Name: an automated differential nuclear staining assay for accurate determination of mitocan cytotoxicity
Uploaded: 2020-05-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity at JoVE.com

NVK، وهو باحث في CPRIT في أبحاث السرطان، يشكر معهد الوقاية من السرطان والبحوث في ولاية تكساس (CPRIT) لدعمهم السخي، منحة CPRIT RR150044. وقد تم دعم هذا العمل أيضا من قبل مؤسسة ويلش منحة البحوث C-1930، والمعاهد الوطنية للصحة R35 GM129294 منحت لNK. ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعدادها.

1. فحص السمية الخلوية: الإعداد
<ol><li>إعداد حلول من المركبات ذات الأهمية عند التركيزات المطلوبة في وسائل الإعلام المناسبة (خالية من المصل أو 1، 2.5، أو 5٪ FBS RPMI-1640).<ol>
<li>لقياس السمية الخلوية لمركب واحد (على سبيل المثال، لتحديد جرعات فعالة)، وإعداد المركبات في التركيز النهائي 2x.</li>
		<li>لقياس السمي?...

<ol>
	<li>Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assessment:+toward+content-rich+platforms.">Cell viability assessment: toward content-rich platforms.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).</li><li>Melzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+an+affordable+marker+for+automated+live-dead+cell+analysis+in+image+cytometry.">Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry.</a> Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).</li><li>Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Functional+Characteristic+of+Senescent+Cancer+Cells.">Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells.</a> Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).</li><li>Copp&#233;, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype:+the+dark+side+of+tumor+suppression.">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).</li><li>Castro-Vega, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescent+microenvironment+promotes+the+emergence+of+heterogeneous+cancer+stem-like+cells.">The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells.</a> Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).</li><li>Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+solid+tumors+by+a+single+multinucleated+cancer+cell.">Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell.</a> Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).</li><li>Osisami, M., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Metastatic+Tumor+Dormancy.">Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy.</a> Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cancer+stem-like+cells+through+the+formation+of+polyploid+giant+cancer+cells.">Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells.</a> Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).</li><li>Mittal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+polyploidy+drives+resistance+to+Docetaxel+chemotherapy+in+prostate+cancer.">Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).</li><li>McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staurosporine-induced+apoptosis+and+hydrogen+peroxide-induced+necrosis+in+two+human+breast+cell+lines.">Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines.</a> British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+lactate+dehydrogenase+release+assay+for+screening+of+drug+candidates+in+neuroscience.">An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).</li><li>Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+necrosis+by+release+of+lactate+dehydrogenase+activity.">Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).</li><li>Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Counting+and+Viability+Assessment+of+2D+and+3D+Cell+Cultures:+Expected+Reliability+of+the+Trypan+Blue+Assay.">Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay.</a> Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).</li><li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+spectral+signatures+of+the+nucleic+acid+dye+acridine+orange+can+distinguish+cell+death+by+apoptosis+and+necroptosis.">Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis.</a> Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li><li>Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+stages+in+single+apoptotic+and+necrotic+cells+monitored+by+Raman+microspectroscopy.">Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy.</a> Scientific Reports. 4, 4698 (2014).</li><li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+impermeant,+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format.">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).</li><li>Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+increased+sensitivity+of+acute+myeloid+leukemia+to+mitotoxic+drugs.">A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (8), 617 (2019).</li><li>Caro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+signatures+uncover+distinct+targets+in+molecular+subsets+of+diffuse+large+B+cell+lymphoma.">Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma.</a> Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Senft, D., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+mitochondrial+dynamics+in+cancer.">Regulators of mitochondrial dynamics in cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).</li><li>Vazquez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC1&#945;+expression+defines+a+subset+of+human+melanoma+tumors+with+increased+mitochondrial+capacity+and+resistance+to+oxidative+stress.">PGC1&#945; expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress.</a> Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).</li><li>Caino, M. C., Altieri, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+exploit+adaptive+mitochondrial+dynamics+to+increase+tumor+cell+invasion.">Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion.</a> Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).</li><li>Ralph, S. J., Rodr&#237;guez-Enr&#237;quez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-S&#225;nchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+causes+of+cancer+revisited:+"mitochondrial+malignancy"+and+ROS-induced+oncogenic+transformation+-+why+mitochondria+are+targets+for+cancer+therapy.">The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).</li><li>Kreitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Plasticity+of+Acute+Myeloid+Leukemia.">Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Sriskanthadevan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AML+cells+have+low+spare+reserve+capacity+in+their+respiratory+chain+that+renders+them+susceptible+to+oxidative+metabolic+stress.">AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress.</a> Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).</li><li>Guerra, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunction:+A+Novel+Potential+Driver+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+Cancer.">Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer.</a> Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).</li><li>Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+cancer+chemoresistance.">Mitochondria and cancer chemoresistance.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).</li><li>Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+mitocans,+anti-cancer+drugs+acting+on+mitochondria.">Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria.</a> Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).</li><li>Ubah, O. C., Wallace, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+therapy:+Targeting+mitochondria+and+other+sub-cellular+organelles.">Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).</li><li>Yamaguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elimination+of+cancer+cells+by+deoxyglucose-ABT-263/737+combination+therapy.">Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy.</a> PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).</li><li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anti-cancer+drugs,+mitocans,+to+enhance+the+immune+responses+against+tumors.">Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).</li><li>Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Synergistic+Potential+of+Mitochondria-Targeting+Drugs+for+Leukemia+Therapy.">Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).</li><li>Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+nuclear+staining+assay+for+high-throughput+screening+to+identify+cytotoxic+compounds.">Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds.</a> Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).</li><li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+acute+myeloid+leukemia+in+adults:+recommendations+from+an+international+expert+panel,+on+behalf+of+the+European+LeukemiaNet.">Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet.</a> Blood. 115 (3), 453-474 (2010).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Investigations+of+the+Mitochondrial+Complex+I+Inhibitor+Rotenone+in+the+Context+of+Pharmacological+and+Safety+Evaluation.">Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation.</a> Scientific Reports. 7, 45465 (2017).</li><li>Fan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Energy+Metabolism+and+Potential+of+3-Bromopyruvate+as+an+Inhibitor+of+Aerobic+Glycolysis:+Implications+in+Tumor+Treatment.">Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment.</a> Cancers (Basel). 11 (3), (2019).</li><li>Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+effects+of+dimethyl+sulfoxide+(DMSO)+on+the+differentiation+potential+of+human+embryonic+stem+cells.">Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells.</a> Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).</li><li>Tun&#231;er, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+dimethyl+sulfoxide+driven+gross+molecular+changes+have+the+potential+to+interfere+with+various+cellular+processes.">Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).</li></ol>

على الرغم من أن بروتوكول هويشست / PI اختبار السمية الخلوية قوية وتتطلب القليل نسبيا التدريب العملي على الوقت، وهناك العديد من التفاصيل التجريبية التي هي مهمة جدا لضمان نتائج دقيقة. أولاً، من الضروري التأكد من أن تركيز نظام إدارة الانبعاثات ما زال أقل من 0.5 في المائة (v/v). ومن المتفق عليه عموم?...

الخطوة الأولى لتحديد علاجات السرطان الفعالة هي اختيار اختبار قوي وغير متحيز للسمية الخلوية التي يمكن استخدامها لفحص تأثير العلاج. خيار شائع لتجارب منخفضة الإنتاجية هو استبعاد الصبغة الزرقاء trypan من الخلايا الحية. يفضل هذا الأسلوب لأنه يسمح بطريقة غير متحيزة نسبيا لتحديد مدى بقاء الخلية. trypan الأزرق ينشر بشكل سلبي في الخلايا التي تتعرض للخطر الأغشية، ولكن يتم حظره بشكل فعال من دخول الخلايا السليمة1. حاصل الخلايا الحية والخلايا الكلية يمثل نسبة البقاء في المئة، مما يدل على فعالية العلاج. العيب الأكثر أهمية من المقايسة الزرقاء trypan هو أنه غير مناسب لمنهجيات عالية الإنتاجية. لديها نسبة منخفضة نسبيا إشارة إلى الضوضاء وتلطيخ لفترات طويلة يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية بسبب تلطيخ الخلايا القابلة للحياة. وبالتالي، يتم استبعاد trypan الأزرق عادة، ولكن ليس دائما2، هبط إلى العد اليدوي. وهذا يجعلها بطيئة جدا ويدخل إمكانية قوية للتحيز بسبب الحكم الذاتي للباحث (ما لم يتم استخدام التهم المسببة للعمى أو مستقلة، مما يقلل من الإنتاجية المختبرية). بشكل عام ، فإن معدل نقل هذا الفحص غير كاف لاكتشاف الأدوية الحديثة.
إن عمليات الفحص التي تكون لها القدرة على البقاء، والتي عادة ما يكون لها إنتاجية أعلى بكثير، تسمح للباحثين بالتحايل على هذا القيد، ولكن تأتي مع محاذير كبيرة (انظر الجدول 1). هذه الأساليب تقع عموما في مجموعتين. تتكون مجموعة واحدة من المعايرات colorimetric التي تستند إلى وظيفة إنزيمات الأكسدة الخلوية. يتم تحويل ركائز عديم اللون أو غير الفلورسنت إلى منتجات نابضة بالحياة يمكن تحديدها كميا باستخدام مقياس الطيف. وتشمل الأمثلة الكلاسيكية أملاح تترازوليوم (MTT، WST-1، XTT، الخ) و resazurin. وتشمل هذه الفئة أيضا المقايسات الإنارة التي تستخدم لوسيفيرين لتقييم مستوى ATP. وتوجد في هذه المقاييس من هذا النوع قيود على أنها تقيس عملية التمثيل الغذائي الخلوي، وهي ليست قابلية البقاء الخلوية في حد ذاتها. من الشائع جداً أن تصبح الخلايا هادئة في ظل ظروف معاكسة، ولكنها لا تزال تحتفظ بالقدرة على تقسيم3و4و5. على سبيل المثال، الخلايا الجذعية السرطانية غالبا ما تكون هادئة نسبيا6،7،8،9، ومن المرجح أن يكون من الصعب إجراء فحص باستخدام هذه التقنيات. ومن المرجح أيضا أن تكون هناك مبالغة كبيرة في تقدير فعالية العلاجات التي تضر بوظيفة الميتوكوندريا، مثل معظم الميتوك.
وتستفيد المنهجية البديلة من الخواص الكيميائية للمواد المختلفة التي تسمح لها إما بعبور الأغشية البيولوجية أو عدم عبورها. ومن الأمثلة على ذلك البقع النووية مثل SYTOX أو يوديد البروديوم (PI). وتشمل هذه الفئة أيضا المقايسات التي هي مماثلة في المفهوم ولكن مختلفة في وظيفة، مثل dehydrogenase اللاكتات (LDH) المقايسة، الذي يقيس الإفراج عن LDH في الوسط خارج الخلية كمؤشر النخر الخلوي(الشكل 1،الجدول 1). هذه المقايسات هي أكثر قدرة على التمييز بين الخلايا غير النشطة الأيضية والميتة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>مقايسة / صبغة</td>
			<td>نوع (ق) من موت الخلية المكتشفة</td>
			<td>المعدات اللازمة</td>
			<td>الميزات الرئيسية</td>
		</tr>
<tr>
<td>MTT، CKK-8، علامة الأزرق (resazurin)</td>
			<td>المبرمج المبرمج / نخر</td>
			<td>مقياس الطيف الضوئي</td>
			<td>غير مكلفة، سريعة؛ نقطة النهاية المقايسة؛ تعتمد على نشاط الانزيمات (المتقدر الحصري في حالة MTT) ولا يميز بين أنماط موت الخلايا1,10
</td>
		</tr>
<tr>
<td>الافراج عن LDH</td>
			<td>نخر</td>
			<td>مقياس الطيف الضوئي</td>
			<td>سريع, مستقلة عن نشاط الإنزيمات الميتوكوندريا; مكلفة لاختبارات عالية الإنتاجية؛ يكتشف الخلايا النخرية مع غشاء البلازما compromized11،12
</td>
		</tr>
<tr>
<td>تريبان بلو (TB)</td>
			<td>المبرمج المبرمج / نخر</td>
			<td>المجهر</td>
			<td>خلية impermeant; لا يميز بين طرق موت الخلايا؛ مُجهدة وغير مناسبة للفحص عالي الإنتاجية؛ أكثر صعوبة في الاستخدام مع الخلايا المنضمة. عرضة للحكم الذاتي للمستخدم، ولكن يعتبر معيار الخلية طريقة قياس قابلية البقاء13
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">أكريدين البرتقالي (AO)</td>
			<td>المبرمج المبرمج/ النخر/</td>
			<td rowspan="2">مجهر الفلوريسنس</td>
			<td rowspan="2">صبغة حمض نووي مع خصائص طيفية فريدة من نوعها، يمكن أن تميز بين المبرمج والنخر / نخر14
</td>
		</tr>
<tr>
<td>نكروباتوس</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hoechst 33342, DAPI</td>
			<td>مرض اpoptosis</td>
			<td>مجهر الفلوريسنس أو مقياس تدفق</td>
			<td>خلية نفاذية؛ غير لائق من تلقاء نفسها لرصد موت الخلايا ؛ مفيدة لالتلوث المشترك. يمكن استخدامها لتقييم التكثيف الكروماتين وتفتيت النوى في المبرمج المبكر. يمكن أن يقترن مع يوديد بروبدييوم للتمييز المبرمج من نخر15،16
</td>
		</tr>
<tr>
<td>بروبيديوم يوديد (PI)</td>
			<td>موتوبوبتوس في وقت متأخر / نخر</td>
			<td>مجهر الفلوريسنس أو مقياس تدفق</td>
			<td>الخلية impermeant مُتشابك؛ يكتشف كل من موت الخلايا المبرمج في وقت متأخر وأوضاع نخر موت الخلية17. سام ونفاذ بعد فترة طويلة حضانة مرات18
</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1- الانبعاثات 1000 قائمة من مقايسات السمية الخلوية. مسايسات السمية الخلوية، التي تم استخدام بعضها في هذه الدراسة، مدرجة مع وصف موجز لخصائصها الرئيسية.
وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن يتم تغيير التمثيل الغذائي الميتوكوندريا في بعض أنواع السرطان19,20,21,22,23,24,25. على سبيل المثال، وقد أظهرت سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) ل upregulate كتلة الميتوكوندريا، محتوى mtDNA، والتنفس الميتوكوندريا لتلبية متطلبات الطاقة الخاصة بهم19،26،27. من ناحية أخرى ، تتميز بعض الأورام الصلبة بالخلل الميتوكوندريا ، أو بالأحرى "إعادة برمجة التمثيل الغذائي" ، مثل داونراسم البروتينات الميتوكوندريا المشاركة في OXPHOS أو انخفاض محتوى mtDNA ، التي ارتبطت مع غزوة الورم ، وإمكانات النقيلي ومقاومة للأدوية المسببة للتخثر28،29. وعلاوة على ذلك, في الآونة الأخيرة, كان هناك اهتمام متزايد في استخدام المركبات المتنوعة ميكانيكيا التي تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا (تسمى عموما mitocans30),العلاجات المحتملة لأنواع معينة من السرطان. هذه الأدوية تستهدف تركيب ATP, الحمض النووي الميتوكوندريا, OXPHOS, و روس الإنتاج, فضلا عن البروتينات الموالية لبروتينات المبرمجة و المضادة لهيبوتوتيك المرتبطة الميتوكوندريا30,31. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن هذا النهج له وعد كبير19،32،33،34. ومع ذلك، قد تؤثر هذه الانحرافات الأيضية في بيولوجيا الخلايا السرطانية أو العلاجات التي تستهدف الميتوكوندريا بشكل كبير على مقايسات الجدوى التقليدية التي تستند إلى وظائف الميتوكوندريا.
هنا، يتم وصف بروتوكول الأمثل لخلاف تفاضلي تلطخ النووية. البروتوكول يسمح بسرعة ودقة تحديد السمية الخلوية للميتوكان أو تركيباتها مع المركبات الأخرى. Hoechst 33342 هو صبغة نووية الخلية permeant التي تعبر بسهولة أغشية الخلايا لطخة الحمض النووي، مما يسمح للعد الخلايا الإجمالية التي يتعين الحصول عليها. عن طريق التلطيخ المشترك مع PI، الذي يدخل فقط نواة الخلايا الميتة، يمكن تحديد نسبة المعيشة (Hoechst فقط) والقتلى (ملطخة مع كل من) الخلايا بدقة. هذا البروتوكول ينقّح المقايسةالمنشورة 35 عن طريق إضافة خطوة لتحسين تركيز الصبغة (عن طريق الرجوع إلى النتائج باستخدام طريقة الترباني الأزرق المتعمّدة) والطرد المركزي لللوحة قبل التصوير. وبما أن العديد من خطوط الخلية شبه المنضمة أو المعلقة، فإن الطرد المركزي يزيد من نسبة الخلايا التي يتم تصويرها ويحسن الدقة بقوة. الفحص له العديد من المزايا، بما في ذلك أن تلطيخ لا يتطلب إزالة وسائل الإعلام أو الغسيل. خليط الصبغة هو أيضا غير مكلفة وسهلة التحضير، ومتوافقة مع أنظمة الأنابيب متعددة القنوات / الروبوتية.
بعد أن تكون الخلايا ملطخة ، يتم تصويرها بمجهر آلي. هذا له ميزة إضافية لخلق سجل دائم من الصور التي يمكن إعادة تحليلها في وقت لاحق ويمكن إعادة تقييم آثار مركبات معينة عن طريق التفتيش البصري للصور التي تم التقاطها. بمجرد الحصول على الصور، يمكن عد الخلايا إما يدويا أو باستخدام أي من عدة حزم برامجية، بما في ذلك كل من الحرة (على سبيل المثال، ImageJ، CellProfiler، الخ) والبرمجيات التجارية (مثل، التحول، Gen5، الخ). العد الآلي للخلايا هو الأفضل عموما منذ وضعت بشكل صحيح خطوط أنابيب العد الآلي للخلايا هي أكثر دقة وأقل تحيزا من التهم اليدوية. كما أنها تتجاهل بشكل أكثر فعالية حطام الخلية أو المجمعات غير القابلة للذوبان. تطوير هذه الأنابيب هو واضح عموما وتبسيطها من خلال كفاءة البقع المستخدمة. الإخراج هو كمية منذ العدد الفعلي للخلايا الميتة تحسب تلقائيا فيما يتعلق العدد الإجمالي الخلية، ويمكن تطبيق عتبات مختلفة لزيادة أو تقليل صرامة الكشف35. للراحة، يتم تضمين معلمات محسنة لعد الخلايا باستخدام Gen5 v. 3.00 برنامج متوافق Cytation 5 الخلية التصوير متعدد وضع قارئ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1423px;" width="1423">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">2-Deoxy-D-glucose/2-DG</td>
			<td style="width:137px;">Chem-Impex</td>
			<td style="width:176px;">50-519-067</td>
			<td style="width:819px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">3-bromo-pyruvate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td style="width:176px;">1113-59-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">96-Well plates</td>
			<td style="width:137px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:176px;">655090</td>
			<td>Black or clear flat-bottomed 96-well plates 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>A50101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Countess II automated cell counter</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td style="width:137px;">BioTek</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:176px;">62249</td>
			<td>20 mM solution; final concentration 1:1,000 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HyClone fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#25-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">m-chlorophenylhydrazone/CCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Pierce LDH assay kit</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>50-103-5952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>50-596-072</td>
			<td>Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 &#181;g/mL (leukemia cells), 1 &#181;g/mL (normal PBMCs) 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotenone</td>
			<td>Ark Pharm</td>
			<td style="width:176px;">AK115691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:84px;width:291px;">RPMI-1640 Medium 
			With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:137px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazolyl blue tetrazolium bromide</td>
			<td style="width:137px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:176px;">AC158990010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Trypan blue stain (0.4%)</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td style="width:176px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1423px;">Cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">K562</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;">CCL-243</td>
			<td>CML cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">MOLM-13</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td>AML cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">MOLT-4</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1582</td>
			<td>ALL cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">OCI-AML2</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td>AML cell line 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated differential nuclear staining assay for accurate determination of mitocan cytotoxicity

مساهمة الميتوكوندريا في التحول على الوسووجين هو موضوع اهتمام واسع ودراسة نشطة. كما يصبح مجال الأيض السرطان أكثر تعقيدا, هدف استهداف الميتوكوندريا باستخدام المركبات المختلفة التي تسبب الضرر الميتوكوندريا (ما يسمى الميتوكان) أصبحت شعبية جدا. لسوء الحظ، تتطلب العديد من مقايسات السمية الخلوية الموجودة، مثل تلك القائمة على أملاح تترازوليوم أو ريسازونين إنزيمات الميتوكوندريا الوظيفية لأدائها. الأضرار التي تلحقها المركبات التي تستهدف الميتوكوندريا غالبا ما يعرض للخطر دقة هذه المقايسات. هنا، نحن وصف بروتوكول معدلة على أساس التصبغ التفاضلي مع اثنين من الأصباغ الفلورية، واحدة منها هي الخلية permeant (Hoechst 33342) والآخر الذي ليس (يوديد البرودييوم). الفرق في تلطيخ يسمح الخلايا الحية والميتة أن يكون التمييز. الميكنة قابلة للمجهر الآلي وتحليل الصور ، مما يزيد من الإنتاجية ويقلل من التحيز. وهذا يسمح أيضا أن تستخدم في الميكون عالية الإنتاجية باستخدام لوحات 96-well، مما يجعلها خيارا قابلا للتطبيق لجهود اكتشاف المخدرات، لا سيما عندما تكون الأدوية المعنية لديها بعض مستوى السمية الميتومي. الأهم من ذلك، النتائج التي حصلت عليها Hoechst / PI تلطيخ قياس إظهار زيادة الاتساق، سواء مع نتائج استبعاد الأزرق trypan وبين يكرر البيولوجية عندما تتم مقارنة المقايسة إلى أساليب أخرى.

وقد تم تطوير البروتوكول المذكور أعلاه باستخدام خلايا OCI-AML2، والتي تم اتخاذها كممثل خط خلايا سرطان الدم النخاعي الحاد. يتميز AML بالانتشار غير الطبيعي للخلايا غير المتمايزة وغير الوظيفية في نخاع العظام26. على الرغم من التطورات الأخيرة في مكافحة غسل الأموال العلاج المستهدف، وقد ?...

Watch this Scientific Journal Video about An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity at JoVE.com

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

يصف البروتوكول فحص سريع وعالي الإنتاجية وموثوقًا به وغير مكلف وغير متحيز لتحديد الجدوى الخلوية بكفاءة. هذا الفحص مفيد بشكل خاص عندما تضررت الميتوكوندريا الخلايا ، مما يتداخل مع التشايسات الأخرى. يستخدم الفحص العد الآلي للخلايا الملطخة بصبغتين نوويتين – Hoechst 33342 و ميووديد البروديوم.

الآلي التفاضلية النووية التفضيل الملطخة اختبار لتحديد دقيق للسمية الخلوية الميتوك

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

هذه الطريقة سوف تسمح للباحثين لتقييم صلاحية الخلوية بشكل مستقل عن وظيفة الميتوكوندريا. وهو قابل لارتفاع إنتاجية جهود فحص المخدرات. هذه التقنية سريعة ودقيقة وغير مكلفة، وتسمح بتحديد المركبات السمية الخلوية، بما في ذلك تلك التي تضعف وظيفة الميتوكوندريا في معظم أنواع الخلايا.هذا البروتوكول سهل الأداء. من المهم أن تولي اهتماما لإعداد المخدرات، وظروف العلاج، وكثافة الخلايا لضمان دقة التجريبية وصلاحية. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة مهم لأن خطوات الحصول على الصور وتحليل الصور قد يكون من الصعب تلخيصها ، خاصة بالنسبة للباحثين الذين لديهم خبرة قليلة مع Gen5 Software.تبدأ من خلال إعداد حلول للمركبات ذات الأهمية في التركيز المطلوب. تأكد دائما من خلط المركبات عن طريق دوامة تماما. لقياس السمية الخلوية لمركب واحد، قم بإعداد المركبات عند التركيز النهائي 2X.إذا كان قياس السمية الخلوية من مجموعات مركبة، وإعدادها في تركيز نهائي 4X. إعداد المذيبات فقط عن طريق خلط نفس الكمية من المذيبات مع المتوسطة المناسبة. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر و aliquot 10 ميكرولترات من تعليق الخلية.لتلطّيخ الأزرق trypan، إضافة 10 ميكرولترات من 0.4٪ trypan الأزرق إلى aliquot واستخدام عداد الهيموسيت أو عداد الخلية لحساب الخلايا القابلة للحياة وغير قابلة للحياة. خلايا بيليه في أنبوب 15 ملليلتر في 200 مرة G لمدة خمس دقائق، ثم الpirate أو decamped ناضح. نحن تعليق بيليه الخلية في وسائل الإعلام مقال المناسبة في كثافة الخلية من ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر.استخدام ماصة متعددة القنوات لذرة 50 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل بئر من 96 لوحة جيدا. بالنسبة للمحسّات المركبة الواحدة، أضف 50 ميكرولترات من محلول مركب 2X في كل بئر. بالنسبة لآبار التحكم بالمذيبات، أضف 15 ميكرولترات من وسائط الاختبار التي تحتوي على المذيبات بتركيز 2X.لمحسانات الجمع إضافة 25 ميكرولترات من كل من المركبات 4X في كل بئر. بالنسبة لآبار التحكم في المركبات الفردية، أضف 25 ميكرولترات لكل من حل مركب 4X ومتوسط الاختبار. تأكد من أن التركيز النهائي لـ DMSO لا يتجاوز 0.5٪ لضمان قابلية التكاثر ، أضف الأدوية مع نصائح الماصات التي تلمس جانب الآبار.الحرص على إضافة الأدوية إلى مواقع مختلفة. يجب إجراء هذه الطعنات بسرعة كبيرة ، ويفضل أن لا تستغرق أكثر من 30 دقيقة لكل لوحة. اضغط بلطف على اللوحة لخلط محتويات الآبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون.عندما تكون على استعداد لطخة الخلايا مع Hoechst 33342 وروبوديوم يوديد إعداد جديدة 10X تلطيخ حل وإضافة 10 ميكرولترات لكل بئر. اضغط بلطف على اللوحة واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي في لوحة 200 مرة G لمدة أربع دقائق لجلب جميع الخلايا إلى الجزء السفلي من لوحة.ثم مسح بعناية الجزء السفلي من لوحة مع مسح مختبر رطب لإزالة أي حطام التي قد تتداخل مع التصوير. صورة لوحة في غضون 15 دقيقة بعد الطرد المركزي. فتح Gen5 البرمجيات وإنشاء بروتوكول جديد قياسي، انقر على الإجراءات واختيار نوع من لوحات لاستخدامها.عادة، 96 لوحات بلاستيكية سوداء جيدا. بعد ذلك، قم بتعيين طريقة القراءة إلى الصورة، انقر فوق "حسناً"، ثم اختر مجموعات DAPI و تكساس ريد تصفية مع هدف تكبير 4X. لا حاجة إلى تعويض ، حيث سيتم تصوير مراكز البئر.لتصفية DAPI، تعيين LED إلى 10، وقت التكامل إلى 99، واكسب إلى الصفر. لتكساس حمراء, تعيين LED إلى ثمانية, وقت التكامل إلى 950, وكسب إلى 18. انقر فوق خيارات للتأكد من أن يتم تنفيذ التركيز التلقائي على قناة DAPI ولا يوجد أي إزاحة في التركيز بين القنوات.حفظ البروتوكول بالنقر فوق "حسناً". الآن يمكن تسجيل الصور باستخدام زر قراءة جديدة. مرة واحدة يتم تسجيل الصور، انقر على تقليل البيانات واختيار معالجة الصورة المسبقة.تطبيق معالجة تمهيدية للصورة باستخدام طرح الخلفية الداكنة باستخدام حجم التسوية التلقائية استنادًا إلى إشارة DAPI. بالنسبة لـ تكساس ريد، استخدم نفس الخيارات الخاصة بالقناة 1. عند الانتهاء، انقر فوق "موافق".ثم انتقل إلى لوحة تحليل الخلوية وتطبيق قناع نووي على أساس إشارة DAPI المحولة مع قيمة عتبة 6000 وحدة، والحد الأدنى لحجم الكائن من خمسة ميكرومتر وأقصى حجم الكائن من 25 ميكرومتر. تحليل الصورة بأكملها، واستبعاد الكائنات حافة الأساسية على حد الصورة وتقسيم لمس الكائنات. في خيارات الكشف المتقدمة، تعيين قطر الكرة المتداول كما 30 ميكرومتر، وتقييم الخلفية على أساس 5٪ من أدنى بكسل.احتفظ بعدد الخلايا فقط في المقاييس المحسوبة. بعد ذلك، قم بإجراء تحليل للسكان الفرعيين استنادًا إلى إشارة تكساس الحمراء المحولة مع قيمة عتبة 5000 وحدة لحساب الخلايا الميتة. وأخيراً، الوصول إلى عدد الخلايا الناتجة.صور تمثيلية للخلايا الملطخة بهيشست، يتم عرض يوديد بروبديسيوم هنا. العدد الإجمالي للخلايا مرتفع بشكل معقول وأكبر من عدد الخلايا الميتة. عندما تمت مقارنة لوحة من مقايسات السمية الخلوية مع الاستبعاد الأزرق trypan، وجد أن MTT والمقايس الزرقاء ألامار قياس غير دقيق الجدوى الخلوية.وأظهرت هذه المقايسات القائمة على انزيم الميتوكوندريا أقل بكثير من الجدوى مقارنة باستبعاد تريبان الأزرق. كان التلطين المزدوج مع Hoechst 33342 و PI أفضل مزيج من المتانة والحساسية والاتساق مع التلطيخ الأزرق trypan وأصغر انحراف متوسط من طريقة الاستبعاد الأزرق trypan بعد CCP أو 2-DG العلاج. وكان مقال هويشت PI فعالة أيضا في تحديد الجدوى الخلوية بعد العلاج مع جزيئات استهداف الميتوكوندريا Rotenone وثلاثة bromopyruvate.هو كان أبعد يصادق مع لوحة من سرطان الدم خلية خطوط. هذه الخلايا تختلف في حساسية الرونتينون تتراوح بين حساسة جدا لخلايا المقاومة. قد الأداء غير السليم للمقدّم للخطر دقته.وتظهر هنا عدة نتائج مخترقة. الإفراط في الاحتواء مع PI ، إهمال خطوة الطرد المركزي ، أو التعرض المفرط في قناة Hoechst ، سيؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل. في حين توقيت هذا البروتوكول، تذكر لتحسين تركيز الصبغة وتلطيخ الوقت لكل خط الخلية.أيضا، centrification لطبقة عينة، ضروري لضمان جودة التصوير. بعد تحديد مركبات تأثير السمية الخلوية على الخلايا السرطانية، قد يشرع الباحثون في إجراء دراسات ميكانيكية لتحديد أهدافهم ذات الصلة. فحص مكتبات الجزيئات الصغيرة مع هذه التقنية بالتوازي مع المقايسات MTT التقليدية، وسوف تسمح الجزيئات التي تستهدف وظيفة الميتوكوندريا ليتم تحديدها بسرعة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

GPC3--استهداف جسم بيسبيسيفيك، GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية، مع سيتوتوكسيسيتي قوية

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

سير عمل بسيطة هجرة/غزو تصوير خلية يعيش الآلي باستخدام

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

دليل عملي للإنتاج والتصوير PET/CT من 68Ga-دوتاتاتي لاورام الغدد الصم العصبية في الممارسة السريرية اليومية

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

التحكم المكاني والزماني للبدء من الميلانوما من الخلايا الجذعية المتحولة للخلايا الصباغية

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

إدارة التحف الحركة التنفسية في 18F-fluorodeoxyglucose Positron الانبعاثات التصوير المقطعي باستخدام خوارزمية الغاءات التنفسية الأمثل القائم على السعة

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

ثلاث طرق لتحليل التعبير التفاضلي لتسلسل الحمض النووي الريبي: ليما، إيدج آر، DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...