Name: an automated differential nuclear staining assay for accurate determination of mitocan cytotoxicity
Uploaded: 2020-05-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity at JoVE.com

NVK, en CPRIT forsker i Cancer Research, takker Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) for deres generøse støtte, CPRIT tilskud RR150044. Dette arbejde blev også støttet af Welch Foundation Research Grant C-1930, og af National Institutes of Health R35 GM129294 tildelt NVK. Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet.

1. Cytotoksicitetsanalyse: Opsætning
<ol><li>Der tilberedning af renteforbindelser ved de ønskede koncentrationer i de relevante medier (serumfri eller 1, 2,5 eller 5% FBS RPMI-1640).<ol>
<li>For at måle cytotoksiciteten for en enkelt forbindelse (f.eks. for at bestemme effektive doser) skal der forberedes forbindelser ved 2x endelig koncentration.</li>
		<li>For at måle cytotoksicitet af sammensatte kombinationer, forberede forbindelser på 4x endelig koncentration.</li>
		<li>Betjening af opløsningsmiddelbetjeni...

<ol>
	<li>Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assessment:+toward+content-rich+platforms.">Cell viability assessment: toward content-rich platforms.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).</li><li>Melzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+an+affordable+marker+for+automated+live-dead+cell+analysis+in+image+cytometry.">Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry.</a> Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).</li><li>Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Functional+Characteristic+of+Senescent+Cancer+Cells.">Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells.</a> Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).</li><li>Copp&#233;, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype:+the+dark+side+of+tumor+suppression.">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).</li><li>Castro-Vega, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescent+microenvironment+promotes+the+emergence+of+heterogeneous+cancer+stem-like+cells.">The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells.</a> Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).</li><li>Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+solid+tumors+by+a+single+multinucleated+cancer+cell.">Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell.</a> Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).</li><li>Osisami, M., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Metastatic+Tumor+Dormancy.">Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy.</a> Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cancer+stem-like+cells+through+the+formation+of+polyploid+giant+cancer+cells.">Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells.</a> Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).</li><li>Mittal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+polyploidy+drives+resistance+to+Docetaxel+chemotherapy+in+prostate+cancer.">Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).</li><li>McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staurosporine-induced+apoptosis+and+hydrogen+peroxide-induced+necrosis+in+two+human+breast+cell+lines.">Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines.</a> British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+lactate+dehydrogenase+release+assay+for+screening+of+drug+candidates+in+neuroscience.">An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).</li><li>Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+necrosis+by+release+of+lactate+dehydrogenase+activity.">Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).</li><li>Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Counting+and+Viability+Assessment+of+2D+and+3D+Cell+Cultures:+Expected+Reliability+of+the+Trypan+Blue+Assay.">Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay.</a> Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).</li><li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+spectral+signatures+of+the+nucleic+acid+dye+acridine+orange+can+distinguish+cell+death+by+apoptosis+and+necroptosis.">Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis.</a> Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li><li>Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+stages+in+single+apoptotic+and+necrotic+cells+monitored+by+Raman+microspectroscopy.">Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy.</a> Scientific Reports. 4, 4698 (2014).</li><li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+impermeant,+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format.">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).</li><li>Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+increased+sensitivity+of+acute+myeloid+leukemia+to+mitotoxic+drugs.">A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (8), 617 (2019).</li><li>Caro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+signatures+uncover+distinct+targets+in+molecular+subsets+of+diffuse+large+B+cell+lymphoma.">Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma.</a> Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).</li><li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells.">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li><li>Senft, D., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+mitochondrial+dynamics+in+cancer.">Regulators of mitochondrial dynamics in cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).</li><li>Vazquez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC1&#945;+expression+defines+a+subset+of+human+melanoma+tumors+with+increased+mitochondrial+capacity+and+resistance+to+oxidative+stress.">PGC1&#945; expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress.</a> Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).</li><li>Caino, M. C., Altieri, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+exploit+adaptive+mitochondrial+dynamics+to+increase+tumor+cell+invasion.">Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion.</a> Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).</li><li>Ralph, S. J., Rodr&#237;guez-Enr&#237;quez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-S&#225;nchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+causes+of+cancer+revisited:+"mitochondrial+malignancy"+and+ROS-induced+oncogenic+transformation+-+why+mitochondria+are+targets+for+cancer+therapy.">The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).</li><li>Kreitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Plasticity+of+Acute+Myeloid+Leukemia.">Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Sriskanthadevan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AML+cells+have+low+spare+reserve+capacity+in+their+respiratory+chain+that+renders+them+susceptible+to+oxidative+metabolic+stress.">AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress.</a> Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).</li><li>Guerra, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunction:+A+Novel+Potential+Driver+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+Cancer.">Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer.</a> Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).</li><li>Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+cancer+chemoresistance.">Mitochondria and cancer chemoresistance.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).</li><li>Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+mitocans,+anti-cancer+drugs+acting+on+mitochondria.">Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria.</a> Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).</li><li>Ubah, O. C., Wallace, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+therapy:+Targeting+mitochondria+and+other+sub-cellular+organelles.">Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).</li><li>Yamaguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elimination+of+cancer+cells+by+deoxyglucose-ABT-263/737+combination+therapy.">Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy.</a> PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).</li><li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anti-cancer+drugs,+mitocans,+to+enhance+the+immune+responses+against+tumors.">Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).</li><li>Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Synergistic+Potential+of+Mitochondria-Targeting+Drugs+for+Leukemia+Therapy.">Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).</li><li>Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+nuclear+staining+assay+for+high-throughput+screening+to+identify+cytotoxic+compounds.">Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds.</a> Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).</li><li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+acute+myeloid+leukemia+in+adults:+recommendations+from+an+international+expert+panel,+on+behalf+of+the+European+LeukemiaNet.">Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet.</a> Blood. 115 (3), 453-474 (2010).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Investigations+of+the+Mitochondrial+Complex+I+Inhibitor+Rotenone+in+the+Context+of+Pharmacological+and+Safety+Evaluation.">Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation.</a> Scientific Reports. 7, 45465 (2017).</li><li>Fan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Energy+Metabolism+and+Potential+of+3-Bromopyruvate+as+an+Inhibitor+of+Aerobic+Glycolysis:+Implications+in+Tumor+Treatment.">Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment.</a> Cancers (Basel). 11 (3), (2019).</li><li>Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+effects+of+dimethyl+sulfoxide+(DMSO)+on+the+differentiation+potential+of+human+embryonic+stem+cells.">Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells.</a> Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).</li><li>Tun&#231;er, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+dimethyl+sulfoxide+driven+gross+molecular+changes+have+the+potential+to+interfere+with+various+cellular+processes.">Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).</li></ol>

Selv om protokollen for Hoechst/PI cytotoksicitetsanalyse er robust og kræver forholdsvis lidt praktisk tid, er der flere eksperimentelle detaljer, der er meget vigtige for at sikre nøjagtige resultater. For det første er det vigtigt at sikre, at koncentrationen af DMSO forbliver under 0,5 % (v/v). Der er almindelig enighed om , at eksponering for selv lave doser af DMSO i væsentlig grad kan ændre morfologien og fastgørelsen af celler og i væsentlig grad forsinke cellecyklusprogressionen39<...

Det første skridt til at identificere effektive kræftbehandlinger er udvælgelsen af en robust, upartisk cytotoksicitet assay, der kan bruges til at undersøge effekten af behandlingen. Et fælles valg for lav-throughput eksperimenter er udelukkelsen af trypan blå farvestof fra levende celler. Denne metode er begunstiget, fordi det giver en relativt upartisk metode til kvantificering celle overlevelse. trypan blå passivt diffunderer i celler, hvis membraner er kompromitteret, men det er effektivt blokeret fra at komme ind i raske celler1. Kvotienten af de levende celler og de samlede celler repræsenterer den procentvise levedygtighed, hvilket indikerer effekten af behandlingen. Den væsentligste ulempe ved trypan blå analyse er, at det er dårligt egnet til høj-throughput metoder. Det har et relativt lavt signal-støj-forhold og langvarig farvning kan resultere i artefakter på grund af farvning af levedygtige celler. Derfor er trypan blå udelukkelse typisk, men ikke altid2, henvist til manuel optælling. Dette gør det for langsomt og introducerer den stærke mulighed for partiskhed på grund af subjektive dom af forskeren (medmindre blændende eller uafhængige tæller anvendes, hvilket yderligere reducere laboratorie gennemløb). Generelt, gennemløb af denne analyse er utilstrækkelig til moderne stof opdagelse.
Rentabilitetsanalyser, som generelt har en langt højere gennemløb, giver forskerne mulighed for at omgå denne begrænsning, men kommer med betydelige forbehold (se tabel 1). Disse metoder falder generelt i to grupper. En gruppe består af kolojære analyser, der er baseret på funktionen af cellulære redox enzymer. Farveløse eller ikke-fluorescerende substrater omdannes til levende produkter, der kan kvantificeres ved hjælp af et spektrofotometer. Klassiske eksempler omfatter tetrazolium salte (MTT, WST-1, XTT, osv.) og resazurin. Denne kategori omfatter også selvlysende analyser, der udnytter luciferin at evaluere ATP niveau. Analyser af denne type har den underliggende begrænsning, at de måler cellulære stofskifte, som ikke er cellulære levedygtighed i sig selv. Det er ret almindeligt, at celler bliver quiescent under ugunstige forhold, men stadig bevare evnen til atopdele 3,4,5. For eksempel, kræft stamceller er ofte relativt metabolisk quiescent6,7,8,9, og vil sandsynligvis være vanskeligt at analysere ved hjælp af disse teknikker. Effektiviteten af behandlinger, der skader mitokondriel funktion, såsom de fleste mitocans, er også sandsynligt, at være betydeligt overvurderet.
En alternativ metode udnytter de kemiske egenskaber af forskellige stoffer, der giver dem mulighed for enten at krydse eller ikke krydse biologiske membraner. Et eksempel er nukleare pletter såsom SYTOX eller propidium iodid (PI). Denne kategori omfatter også analyser, der ligner hinanden i konceptet, men forskellige i funktion, såsom laktatdehydrogenase (LDH)-analysen, som måler frigivelsen af LDH i det ekstracellulære miljø som indikator for cellulær nekrose (Figur 1, Tabel 1). Disse analyser er mere i stand til at skelne mellem metabolisk inaktive og døde celler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Analyse/farvestof</td>
			<td>Type(er) af celledød opdaget</td>
			<td>Nødvendigt udstyr</td>
			<td>Vigtige funktioner</td>
		</tr>
<tr>
<td>MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin)</td>
			<td>Apoptose/Nekrose</td>
			<td>Spektrofotometer</td>
			<td>Billig, hurtig; endepunktsanalyse afhænger af enzymers aktivitet (udelukkende mitokondriel i tilfælde af MTT) og diskriminerer ikke mellem celledødstyper1,10
</td>
		</tr>
<tr>
<td>LDH-udgivelse</td>
			<td>Nekrose</td>
			<td>Spektrofotometer</td>
			<td>Hurtig, uafhængig af mitokondrielle enzymers aktivitet; dyrt for test med høj gennemløb; detekektære celler med compromiseretplasmamembran 11,12
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trypan Blå (TB)</td>
			<td>Apoptose/Nekrose</td>
			<td>Mikroskop</td>
			<td>Celle-impermeant; ikke diskriminerer mellem celledødsformer arbejdsformig og ikke egnet til screening med høj gennemløb vanskeligere at bruge med klæbende celler; tilbøjelige til subjektiv dømmekraft fra brugerens måde, men betragtes som standardmetode til måling af cellernes levedygtighed13
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Acridine orange (AO)</td>
			<td>Apoptose/Nekrose/</td>
			<td rowspan="2">Fluorescensmikroskop</td>
			<td rowspan="2">Et nukleinsyrefarvestof med unikke spektrale egenskaber kan skelne mellem apoptose og nekrose/nekroptose14
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nekrokose</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hoechst 33342, DAPI</td>
			<td>Apoptose</td>
			<td>Fluorescensmikroskop eller flowcytometer</td>
			<td>Cellepermeerbar; upassende i sig selv til at overvåge celledød; nyttige til co-farvning; kan anvendes til at vurdere kromatinkondensation og kernefragmentering i tidlig apoptose; kan parres med propidiumidodid for at skelne apoptose fra nekrose15,16
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Propidiumidodid (PI)</td>
			<td>Sen apoptose/Nekrose</td>
			<td>Fluorescensmikroskop eller flowcytometer</td>
			<td>Celle-impermeant intercalator; registrerer både sen apoptose og nekrosetilstande for celledød17. Giftig og gennemtrængelig efter lange inkubationstider18
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Liste over cytotoksicitetsanalyser. Cytotoksicitetsanalyser, hvoraf nogle blev brugt i denne undersøgelse, opført sammen med den korte beskrivelse af deres vigtigste funktioner.
Nylige undersøgelser har vist, at mitokondriel metabolisme er ændret i nogle kræftformer19,20,21,22,23,24,25. For eksempel har akut myeloid leukæmi (AML) vist sig at upregulate deres mitokondrielle masse, mtDNA indhold, og mitokondrielle åndedræt for at opfylde deres energibehov19,26,27. På den anden side, nogle solide tumorer er karakteriseret ved mitokondriel dysfunktion, eller rettere "metabolisk omprogrammering", såsom downregulation af mitokondrielle proteiner involveret i OXPHOS eller nedsat mtDNA indhold, der har været forbundet med tumor invasiv, metastatisk potentiale og resistens over for apoptose-inducerende lægemidler28,29. Desuden, for nylig, der har været en øget interesse i at bruge mekanistisk forskellige forbindelser, der påvirker mitokondrielle funktion (generelt kaldet mitocans30), som potentielle behandlinger for særlige kræftformer. Disse lægemidler er rettet mod ATP syntese, mitokondrielle DNA, OXPHOS, og ROS produktion, samt pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner forbundet med mitokondrier30,31. Flere undersøgelser har vist , at denne fremgangsmåde har et betydeligt løfte19,32,33,34. Men, disse metaboliske afvigelser i kræft cellebiologi eller mitokondrier-målretning behandlinger kan i væsentlig grad påvirke konventionelle levedygtighed assays, der er baseret på mitokondriel funktionalitet.
Her er en optimeret protokol for en differentieret nuklear farvning assay beskrevet. Protokollen giver mulighed for hurtig og præcis bestemmelse af cytotoksicitet af mitocans eller deres kombinationer med andre forbindelser. Hoechst 33342 er et cellepermeant nukleart farvestof, der let krydser cellemembraner for at plette DNA, så det samlede celletal kan opnås. Ved co-farvning med PI, som kun kommer ind i kerner af døde celler, kan andelen af levende (Hoechst kun) og døde (farves med begge) celler præcist bestemmes. Denne protokol forædler den offentliggjorte analyse35 ved at tilføje et trin til optimering af farvestofkoncentrationen (ved krydsrefererende resultater med ortogonal trypan blå metode) og centrifugering af pladen før billeddannelse. Da mange cellelinjer er semi-klæbende eller suspenderet, centrifugering øger andelen af celler, der er afbildet og stærkt forbedrer nøjagtigheden. Analysen har flere fordele, herunder at farvning ikke kræver fjernelse af medier eller vask. Farvestoffet blandingen er også billig, let at forberede, og kompatibel med multichannel / robot pipetting systemer.
Efter celler er blevet plettet, er de afbildet med et automatiseret mikroskop. Dette har den ekstra fordel at skabe en permanent registrering af de billeder, der kan re-analyseres senere, og virkningerne af bestemte forbindelser kan revurderes ved visuel inspektion af optagne billeder. Når billederne er opnået, kan celler tælles enten manuelt eller ved hjælp af flere softwarepakker, herunder både gratis (f.eks. ImageJ, CellProfiler osv.) og kommerciel software (f.eks. Automatiseret celletælling er generelt at foretrække, da korrekt udviklede automatiserede celletællingspipelines er mere nøjagtige og mindre forudindtagede end manuelle optællinger. De har også mere effektivt se bort fra cellerester eller uopløselige komplekser. Udviklingen af disse rørledninger er generelt ligetil og forenkles af effektiviteten af de anvendte pletter. Outputtet er kvantitativt, da det faktiske antal døde celler automatisk beregnes i forhold til det samlede celletal, og der kan anvendes forskellige tærskler for at øge eller mindske strengheden af detektion35. For nemheds skyld er optimerede parametre til optælling af celler ved hjælp af Gen5 v. 3.00-softwarekompatibel Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader inkluderet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1423px;" width="1423">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">2-Deoxy-D-glucose/2-DG</td>
			<td style="width:137px;">Chem-Impex</td>
			<td style="width:176px;">50-519-067</td>
			<td style="width:819px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">3-bromo-pyruvate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td style="width:176px;">1113-59-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">96-Well plates</td>
			<td style="width:137px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:176px;">655090</td>
			<td>Black or clear flat-bottomed 96-well plates 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>A50101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Countess II automated cell counter</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td style="width:137px;">BioTek</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:176px;">62249</td>
			<td>20 mM solution; final concentration 1:1,000 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HyClone fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#25-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">m-chlorophenylhydrazone/CCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Pierce LDH assay kit</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>50-103-5952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>50-596-072</td>
			<td>Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 &#181;g/mL (leukemia cells), 1 &#181;g/mL (normal PBMCs) 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotenone</td>
			<td>Ark Pharm</td>
			<td style="width:176px;">AK115691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:84px;width:291px;">RPMI-1640 Medium 
			With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:137px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazolyl blue tetrazolium bromide</td>
			<td style="width:137px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:176px;">AC158990010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Trypan blue stain (0.4%)</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td style="width:176px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1423px;">Cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">K562</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;">CCL-243</td>
			<td>CML cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">MOLM-13</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td>AML cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">MOLT-4</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1582</td>
			<td>ALL cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">OCI-AML2</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td>AML cell line 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated differential nuclear staining assay for accurate determination of mitocan cytotoxicity

Mitokondriens bidrag til onkogene omdannelse er genstand for stor interesse og aktiv undersøgelse. Som inden for kræft metabolisme bliver mere kompleks, målet om at målrette mitokondrier ved hjælp af forskellige forbindelser, der påfører mitokondriel skade (såkaldte mitocans) er ved at blive meget populære. Desværre, mange eksisterende cytotoksicitet assays, såsom dem baseret på tetrazolium salte eller resazurin kræver funktionelle mitokondrielle enzymer for deres ydeevne. Den skade, der påføres af forbindelser, der er målrettet mitokondrier ofte kompromitterer nøjagtigheden af disse analyser. Her beskriver vi en modificeret protokol baseret på differentialfarvning med to fluorescerende farvestoffer, hvoraf den ene er celle-permeant (Hoechst 33342) og den anden er ikke (propidium iodid). Forskellen i farvning gør det muligt at diskriminere levende og døde celler. Analysen er modtagelig for automatiseret mikroskopi og billedanalyse, hvilket øger gennemløb og reducerer bias. Dette gør det også muligt analysen, der skal anvendes i høj-throughput mode ved hjælp af 96-brønd plader, hvilket gør det til en farbar vej for drug opdagelse indsats, især når de pågældende lægemidler har en vis grad af mitotoksicitet. Det er vigtigt, at resultater opnået ved Hoechst/PI-farvningsanalyse viser øget konsistens, både med trypanblå eksklusionsresultater og mellem biologiske replikater, når analysen sammenlignes med andre metoder.

Ovennævnte protokol er udviklet ved hjælp af OCI-AML2 celler, som blev taget som en repræsentativ akut myeloid leukæmi cellelinje. AML er karakteriseret ved unormal spredning af udifferentierede og ikke-funktionelle hæmatopoietiske celler i knoglemarven26. På trods af den seneste udvikling inden for målrettet behandlingsstandarden har været uændret i flere årtier og består af induktionsbehandling (typisk bestående af tre dages antracyklin, f.eks. daunorubicin, idarubicin eller antraeti...

Watch this Scientific Journal Video about An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity at JoVE.com

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

Protokollen beskriver en hurtig, høj-gennemløb, pålidelig, billig, og upartisk analyse for effektivt at bestemme cellulære levedygtighed. Denne analyse er især nyttig, når cellernes mitokondrier er blevet beskadiget, hvilket forstyrrer andre analyser. Analysen bruger automatiseret optælling af celler farves med to nukleare farvestoffer – Hoechst 33342 og propidium iodid.

En automatiseret differentiale nuklear farvning assay til nøjagtig bestemmelse af Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Denne metode vil gøre det muligt for forskere at vurdere cellulære levedygtighed uafhængigt af mitokondriel funktion. Og det er modtagelige for høj gennemløb narkotika screening indsats. Denne teknik er hurtig, præcis, billig, og giver mulighed for bestemmelse af forbindelser cytotoksicitet, herunder dem, der forringer mitokondriel funktion i de fleste celletyper.Denne protokol er nem at udføre. Det er vigtigt at være opmærksom på lægemidlet forberedelse, behandling betingelser, og celletæthed for at sikre eksperimentel nøjagtighed og gyldighed. Visuel demonstration af denne metode er vigtig, fordi billederhvervelse og billedanalyse trin kan være svært at opsummere, især for forskere, der har ringe erfaring med Gen5 Software.Begynd med at forberede opløsninger af interesseforbindelser ved den ønskede koncentration. Sørg altid for at blande forbindelser ved at hvirvle grundigt. For at måle cytotoksicitet af en enkelt forbindelse, forberede forbindelser ved 2X endelig koncentration.Hvis cytotoksiciteten af sammensatte kombinationer måles, forberedes de ved en slutkoncentration på 4X. Opløsningsmiddelberedningsopløsningsbetjeningen ved at blande den samme mængde opløsningsmiddel med det relevante medium. Cellerne opsamles i et konisk rør på 15 milliliter og aliquot 10 mikroliter af cellesuspensionen.For trypan blå farvning, tilføje 10 mikroliter af 0,4% trypan blå til aliquot og bruge en hæmocytometer eller celle tæller til at tælle levedygtige og ikke-levedygtige celler. Pellet celler i 15 milliliter rør ved 200 gange G i fem minutter, derefter aspirere eller decamperede supernatant. Vi suspenderer cellepille i essay passende medier på en celletæthed på tre gange 10 til den femte celler pr milliliter.Brug en multi-kanal pipette til frø 50 mikroliter af celle suspension i hver brønd af en 96 godt plade. For enkelt sammensatte analyser tilsættes 50 mikroliter af 2X sammensatte opløsning i hver brønd. Ved opløsningsmiddelkontrolbosninger tilsættes 15 mikroliter testmedier, der indeholder opløsningsmidlet ved 2X koncentration.For kombinationsanalyser tilsættes 25 mikroliter af hver af de 4X forbindelser i hver brønd. For enkelt sammensatte kontrol brønde, tilsæt 25 mikroliter hver af 4X sammensatte opløsning og test medium. Sørg for, at den endelige koncentration af DMSO ikke overstiger 0,5% For at sikre reproducerbarheden, tilsættes lægemidler med pipettespidserne, der rører ved siden af brøndene.At være omhyggelig med at tilføje narkotika til forskellige steder. Dette stik skal udføres meget hurtigt, helst ikke tager længere end 30 minutter pr plade. Bank forsigtigt på pladen for at blande indholdet af brøndene og inkubere den ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Når du er klar til at plette cellerne med Hoechst 33342 og propidium iodid forberede frisk 10X farvning løsning og tilsæt 10 mikroliter til hver brønd. Bank forsigtigt på pladen og inkuber den ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Centrifuge pladen ved 200 gange G i fire minutter for at bringe alle cellerne til bunden af pladen.Tør derefter forsigtigt bunden af pladen af med en fugtig laboratorieslet for at fjerne eventuelt snavs, der kan forstyrre billeddannelse. Billede pladen inden for 15 minutter efter centrifugering. Åbn Gen5 Software og oprette en ny standard protokol, skal du klikke på Procedure og vælge den type plader, der skal anvendes.Normalt 96 godt sorte plastplader. Derefter skal du indstille læsemetoden til billede, klikke på Okay og vælge DAPI- og Texas Red Filter-sæt med en 4X-forstørrelsesmålsætning. Ingen offset er nødvendig, da brønden centre vil blive afbildet.For DAPI-filteret skal du indstille LED til 10, integrationstid til 99 og gevinst til nul. For Texas Red, sat LED til otte, integration tid til 950, og vinde til 18. Klik på Indstillinger for at sikre, at den automatiske fokus udføres på DAPI-kanalen, og der er ingen forskydning i at fokusere mellem kanaler.Gem protokollen ved at klikke på Okay. Nu kan billeder optages ved hjælp af knappen Læs ny. Når billederne er optaget, skal du klikke på Datareduktion og vælge Billedforbehandling.Anvend billedforbehandling med mørk baggrundsindtraktion ved hjælp af automatisk samkopieringsstørrelse baseret på DAPI-signalet. For Texas Red skal du bruge de samme indstillinger som for Kanal 1. Klik på Okay, når du er færdig.Gå derefter til det cellulære analysepanel og anvend en nuklear maske baseret på det transformerede DAPI-signal med en tærskelværdi på 6.000 enheder, minimal objektstørrelse på fem mikrometer og maksimal objektstørrelse på 25 mikrometer. Analysér hele billedet, udeluk primære kantobjekter på billedets kant, og opdel berøringsobjekter. I avancerede registreringsmuligheder skal du indstille den rullende kuglediameter som 30 mikrometer og evaluere baggrunden baseret på 5 % af de laveste pixel.Bevar kun celletallet i beregnede målinger. Derefter udføre en delpopulation analyse baseret på den gennemsnitlige forvandlet Texas Red signal med en tærskel værdi på 5, 000 enheder til at tælle døde celler. Endelig skal du få adgang til de resulterende celletal.Repræsentative billeder af celler, der er plettet med Hoechst, propidium iodid er vist her. Det samlede antal celler er rimeligt højt og større end antallet af døde celler. Når et panel af cytotoksicitet assays blev sammenlignet med trypan blå udelukkelse, blev det konstateret, at MTT og Alamar blå analyser unøjagtigt målt cellulære levedygtighed.Disse mitokondrielle enzymbaserede analyser viste signifikant lavere levedygtighed sammenlignet med trypan blå udelukkelse. Dobbelt farvning med Hoechst 33342 og PI havde den bedste kombination af robusthed, følsomhed og konsistens med trypanblå farvning og den mindste medianafvigelse fra trypanblå udelukkelsesmetode efter CCP- eller 2DD-behandling. Den Hoechst PI essay var også effektiv til at bestemme cellulære levedygtighed efter behandling med mitokondrier rettet mod molekyler Rotenone og tre bromopyruvat.Det blev yderligere valideret med et panel af leukæmi cellelinjer. Disse celler varierede i Rotenone følsomhed spænder fra meget følsomme til resisten celler. Forkert udførelse af analysen kan kompromittere dens nøjagtighed.Flere kompromitterede resultater er vist her. Overstaining med PI, forsømme centrifugering trin, eller overeksponering i Hoechst kanal, vil forårsage suboptimale resultater. Mens timing denne protokol, skal du huske at optimere farvestoffet koncentration og farvning tid for hver cellelinje.Desuden centrification for en prøveplade, er nødvendig for at sikre billedkvalitet. Efter identifikation af forbindelser af cytotoksicitetseffekt på kræftceller, forskere kan gå videre med mekanistiske undersøgelser for at identificere deres relevante mål. Screening små molekyle biblioteker med denne teknik parallelt med konventionelle MTT analyser, vil gøre det muligt molekyler, der er målrettet mitokondrielle funktion, der skal hurtigt identificeres.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

En GPC3-målretning Bispecific antistof, GPC3-S-Fab med potente cytotoksicitet

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

En simpel Migration/Invasion arbejdsgang ved hjælp af en automatiseret Live-celle Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

En praktisk vejledning for produktion og PET/CT billeddannelse af 68Ga-DOTATATE for Neuroendokrine tumorer i daglig klinisk praksis

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Rumlig og tidsmæssig kontrol af murine melanom initiering fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analyse for at studere tumor-makrofag interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Håndtering af respiratoriske bevægelsesgenstande i 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomografi ved hjælp af en Amplitude-baseret optimal respiratorisk gating algoritme

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Imaging af DNA-skader og reparation Foci i Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Tre metoder til differentialudtryksanalyse til RNA-sekventering: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...