Name: an automated differential nuclear staining assay for accurate determination of mitocan cytotoxicity
Uploaded: 2020-05-12T15:00:00
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がん研究のCPRIT学者であるNVKは、テキサス州がん予防研究所(CPRIT)の寛大な支援、CPRIT助成金RR150044に感謝します。この研究は、ウェルチ財団研究助成金C-1930、およびNVKに授与された国立衛生研究所R35 GM129294によっても支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

1. 細胞毒性アッセイ: セットアップ
<ol><li>適切な培地(無血清または1、2.5、または5%FBS RPMI-1640)で所望の濃度で目的の化合物の溶液を調製する。<ol>
<li>単一の化合物の細胞毒性を測定するには(例えば、有効用量を決定するために)、2倍の最終濃度で化合物を調製する。</li>
		<li>化合物の組み合わせの細胞毒性を測定するには、4倍の最終濃度で化合物を調製する。</li>
		<li>適切な培地と同量の?...

<ol>
	<li>Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assessment:+toward+content-rich+platforms.">Cell viability assessment: toward content-rich platforms.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).</li><li>Melzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+an+affordable+marker+for+automated+live-dead+cell+analysis+in+image+cytometry.">Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry.</a> Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).</li><li>Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. 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Hoechst/PI細胞毒性アッセイのプロトコルは堅牢で、比較的実践的な時間を必要としますが、正確な結果を確実にするために非常に重要な実験的な詳細がいくつかあります。まず、DMSOの濃度が0.5%(v/v)未満であることを確認することが不可欠です。DMSOの低用量への暴露は、細胞の形態および付着を実質的に変化させ、細胞周期進行を39,40に著しく遅らせることができるというこ?...

効果的ながん治療を特定するための最初のステップは、治療の効果を調べるために使用できる堅牢で公平な細胞傷害性アッセイの選択です。低スループット実験の一般的な選択肢は、生細胞からのトリパンブルー染料の除外です。この方法は、細胞生存を定量化するための比較的公平な方法を可能にするので好ましい。trypanブルーは、膜が損なわれている細胞に受動的に拡散するが、健康な細胞1に入るのを効果的に遮断される。生きている細胞と全細胞の商は、治療の有効性を示す生存率の割合を表す。trypan blue アッセイの最も大きな欠点は、高スループットの方法論に適していることです。それは比較的低い信号対雑音比を有し、長期染色は、生存細胞の染色のために人工物をもたらす可能性がある。したがって、trypan blue の除外は通常、必ずしも2ではなく、手動カウントに降格されます。これはあまりにも遅くなり、研究者の主観的判断によるバイアスの可能性が強くなります(ブラインドまたは独立したカウントを使用しない限り、実験室のスループットをさらに低下させます)。一般に、このアッセイのスループットは、現代の創薬には不十分です。
一般的にスループットがはるかに高い生存アッセイは、研究者がこの制限を回避することを可能にしますが、重大な注意点が付属しています(表1を参照)。これらの方法は、一般的に2つのグループに分類されます。1つのグループは、細胞レドックス酵素の機能に基づく比色アッセイで構成されています。無色または非蛍光基質は、分光光度計を使用して定量することができる活気に満ちた製品に変換されます。古典的な例としては、テトラゾリウム塩(MTT、WST-1、XTTなど)およびレサズリンが挙げられる。このカテゴリには、ATP レベルを評価するためにルシフェリンを利用する発光アッセイも含まれています。このタイプのアッセイは、細胞代謝を測定しているという根本的な制限を有するが、これは細胞の生存率それ過ではない。細胞が不利な条件下で静止することは非常に一般的ですが、それでも3、4、5を分割する能力を保持しています。例えば、癌幹細胞は、比較的代謝的に6、7、8、9であることが多く、これらの技術を用いてアッセイが困難である可能性が高い。ミトコンドリア機能を損なう治療の有効性も、ほとんどのミトカンなど、著しく過大評価される可能性が高い。
代替方法論は、生物学的膜を交差するか、または交差しないのいずれかを可能にする様々な物質の化学的性質を活用する。その一例が、SYTOXやヨウ化プロピジウム(PI)などの核染色である。このカテゴリには、細胞壊死の指標として細胞外ミリューへのLDHの放出を測定する乳酸脱水素酵素(LDH)アッセイのような概念は類似しているが機能が異なるアッセイも含まれる(図1、表1)。これらのアッセイは、代謝不活性細胞と死細胞を区別することがより可能である。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>アッセイ/染料</td>
			<td>細胞死の種類が検出されました</td>
			<td>必要な機器</td>
			<td>主な機能</td>
		</tr>
<tr>
<td>MTT, CKK-8, アラマーブルー (レザズリン)</td>
			<td>アポトーシス/壊死</td>
			<td>分光 光度 計</td>
			<td>安価で、迅速。エンドポイントアッセイ;酵素の活性(MTTの場合はミトコンドリアのみ)に依存し、細胞死のモードを区別しない1,10
</td>
		</tr>
<tr>
<td>LDH リリース</td>
			<td>壊死</td>
			<td>分光 光度 計</td>
			<td>ミトコンドリア酵素の活性とは無関係の迅速な;高スループットテストの場合は高価です。コンプロマ化された形質膜11,12で壊死細胞を検出する
</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリパンブルー(TB)</td>
			<td>アポトーシス/壊死</td>
			<td>顕微鏡</td>
			<td>細胞非透過性;細胞死のモードを区別しません。働きがく、ハイスループットスクリーニングには適していません。接着細胞での使用がより困難。ユーザーの主観的判断を受けやすいが、標準的な細胞生存率測定方法13と考えられている
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">アクリジンオレンジ(AO)</td>
			<td>アポトーシス/壊死/</td>
			<td rowspan="2">蛍光顕微鏡</td>
			<td rowspan="2">独特なスペクトル特性を有する核酸色素は、アポトーシスと壊死/ネクロトーシス14を区別できる
</td>
		</tr>
<tr>
<td>ネクロトーシス</td>
		</tr>
<tr>
<td>ホークスト 33342, DAPI</td>
			<td>アポトーシス</td>
			<td>蛍光顕微鏡またはフローサイトメーター</td>
			<td>細胞透過性;細胞死を監視するために単独で不適切。共同染色に有用である。初期アポトーシスにおけるクロマチン縮合と核断片化を評価するために使用することができます。ヨウ化プロピジウムと組み合わせることで、アポトーシスと壊死を区別することができます15,16
</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヨウ化プロピジウム(PI)</td>
			<td>後期アポトーシス/壊死</td>
			<td>蛍光顕微鏡またはフローサイトメーター</td>
			<td>細胞非透過インターカレーター;細胞死17の後期アポトーシスおよび壊死モードの両方を検出する。長いインキュベーションの後の有毒で透過性18
</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.細胞毒性アッセイのリスト細胞毒性アッセイは、その一部がこの研究で使用され、その主要な特徴の簡単な説明と共にリストされた。
最近の研究では、ミトコンドリア代謝が一部の癌で変化することが実証されています19,20,21,22,23,24,25.例えば、急性骨髄性白血病(AML)は、彼らのエネルギー需要19、26、27を満たすためにミトコンドリア質量、mtDNA含有量、およびミトコンドリア呼吸をアップレレートすることが示されている。一方、いくつかの固形腫瘍は、ミトコンドリア機能障害、またはむしろ「代謝リプログラミング」、OXPHOSに関与するミトコンドリアタンパク質のダウンレギュレーションやmtDNA含有量の低下など、腫瘍浸潤性、転移電位およびアポトーシス誘発薬28、29に対する耐性に関連している。さらに最近では、ミトコンドリア機能に影響を与える機械学的に多様な化合物(一般にミトカン30と呼ばれる)を特定の癌の潜在的な治療法として使用することに対する関心が高まっています。これらの薬物は、ATP合成、ミトコンドリアDNA、OXPHOS、およびROS産生、ならびにミトコンドリア30、31に関連するプロアポトーシスおよび抗アポトーシスタンパク質を標的とする。いくつかの研究は、このアプローチが重要な約束を持っていることを示しています19,32,33,34.しかし、がん細胞生物学やミトコンドリア標的治療におけるこれらの代謝偏差は、ミトコンドリア機能に基づく従来の生存アッセイに大きな影響を与える可能性があります。
ここでは、微分核染色アッセイ用の最適化されたプロトコルについて説明する。このプロトコルは、ミトカンの細胞毒性や他の化合物との組み合わせの迅速かつ正確な決定を可能にします。Hoechst 33342は細胞膜を容易に横切ってDNAを染色する細胞透過核色素であり、全細胞数が得られるようになる。死細胞の核にしか入るPIとの共染色により、生きている細胞(Hoechstのみ)と死んだ(両方で染色)細胞の割合を正確に決定することができる。このプロトコルは、(直交トリパンブルー法との交差参照結果による)およびイメージング前のプレートの遠心分離による色素濃度の最適化のためのステップを加えることによって、公表アッセイ35 を改良する。多くの細胞株は半接着または懸濁されているため、遠心分離は、画像化される細胞の割合を増加させ、精度を大幅に向上させます。アッセイには、染色が媒体の除去または洗浄を必要としないことを含むいくつかの利点がある。染料混合物はまた安価で、準備が容易で、多チャンネル/ロボティックピペットシステムと互換性がある。
細胞が染色された後、それらは自動化された顕微鏡でイメージされる。これは、後で再分析することができる画像の永久的な記録を作成し、特定の化合物の効果をキャプチャされた画像の目視検査によって再評価することができるという付加的な利点を有する。画像が取得されると、セルは手動で、または無料(ImageJ、CellProfilerなど)と商用ソフトウェア(例えば、変身、Gen5など)の両方を含むいくつかのソフトウェアパッケージのいずれかを使用してカウントすることができます。自動セルカウントは、一般に、自動セルカウントパイプラインが手動カウントよりも正確でバイアスが低いため、一般的に好ましいです。また、細胞の破片や不溶性複合体をより効果的に無視します。これらのパイプラインの開発は一般的に簡単であり、使用される汚れの効率によって簡素化されます。出力は、死細胞の実際の数が総細胞数に対して自動的に計算されるため定量的であり、異なる閾値を適用して検出35のストリンジェンシーを増減することができる。利便性のために、Gen5 v. 3.00ソフトウェア互換Cytation 5セルイメージングマルチモードリーダーを使用してセルをカウントするための最適化されたパラメータが含まれています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1423px;" width="1423">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">2-Deoxy-D-glucose/2-DG</td>
			<td style="width:137px;">Chem-Impex</td>
			<td style="width:176px;">50-519-067</td>
			<td style="width:819px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">3-bromo-pyruvate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td style="width:176px;">1113-59-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">96-Well plates</td>
			<td style="width:137px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:176px;">655090</td>
			<td>Black or clear flat-bottomed 96-well plates 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>A50101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Countess II automated cell counter</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td style="width:137px;">BioTek</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:176px;">62249</td>
			<td>20 mM solution; final concentration 1:1,000 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HyClone fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#25-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">m-chlorophenylhydrazone/CCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Pierce LDH assay kit</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>50-103-5952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>50-596-072</td>
			<td>Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 &#181;g/mL (leukemia cells), 1 &#181;g/mL (normal PBMCs) 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotenone</td>
			<td>Ark Pharm</td>
			<td style="width:176px;">AK115691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:84px;width:291px;">RPMI-1640 Medium 
			With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:137px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazolyl blue tetrazolium bromide</td>
			<td style="width:137px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:176px;">AC158990010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Trypan blue stain (0.4%)</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td style="width:176px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1423px;">Cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">K562</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;">CCL-243</td>
			<td>CML cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">MOLM-13</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td>AML cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">MOLT-4</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1582</td>
			<td>ALL cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">OCI-AML2</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td>AML cell line 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated differential nuclear staining assay for accurate determination of mitocan cytotoxicity

発癌性転換へのミトコンドリアの寄与は、広い関心と活発な研究の対象である。がん代謝の分野が複雑化する中で、ミトコンドリアの損傷を与える様々な化合物(いわゆるミトカン)を用いてミトコンドリアを標的にするという目標が非常に人気を集めています。残念なことに、テトラゾリウム塩やレサズリンに基づくものなど、多くの既存の細胞傷害性アッセイは、その性能のために機能的なミトコンドリア酵素を必要とします。ミトコンドリアを標的とする化合物によって与える損傷は、しばしばこれらのアッセイの正確さを損なう。ここでは、2つの蛍光色素による微分染色に基づく改変プロトコルについて説明するが、そのうちの1つは細胞透過性(Hoechst 33342)であり、他方は(ヨウ化プロピジウム)ではない。染色の違いにより、生きている細胞と死んだ細胞を区別することができます。このアッセイは、自動顕微鏡検査と画像解析に適しており、スループットを向上させ、バイアスを低減します。これにより、アッセイは96ウェルプレートを使用してハイスループットの方法で使用することができ、特に問題の薬物がある程度の有糸分裂性がある場合には、創薬の取り組みに実行可能な選択肢となる。重要なことに、Hoechst/PI染色アッセイによって得られた結果は、トリパンブルー排除結果と、アッセイが他の方法と比較されたときに生物学的複製の間の両方で、一貫性の増加を示す。

前述のプロトコルは、代表的な急性骨髄性白血病細胞株として取られたOCI-AML2細胞を用いて開発された。AMLは、骨髄26における未分化および非機能的造血細胞の異常増殖を特徴とする。AML標的療法の最近の発展にもかかわらず、ケアの水準は数十年間変わらず、誘導療法(典型的には3日間のアントラサイクリン、例えば、ダウノルビシン、イダルビシン、またはアントラセネ?...

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An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

このプロトコルは、細胞の生存率を効率的に決定するための、高速で高スループット、信頼性、安価、および公平なアッセイを記述します。このアッセイは、細胞のミトコンドリアが損傷し、他のアッセイに干渉する場合に特に有用である。このアッセイは、Hoechst 33342とヨウ化プロピジウムの2つの核染料で染色された細胞の自動カウントを使用します。

マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

この方法は、研究者がミトコンドリア機能とは無関係に細胞生存率を評価することを可能にする。そして、それは高いスループットの薬物スクリーニングの努力に適しています。この技術は、速く、正確で、安価であり、ほとんどの細胞タイプにおけるミトコンドリア機能を損なうものを含む、細胞毒性の化合物の決定を可能にする。このプロトコルは簡単に実行できます。実験の正確性と有効性を確保するためには、薬剤の調製、治療条件、および細胞密度に注意を払うことが重要です。特にGen5 Softwareの経験がほとんどない研究者にとっては、画像取得や画像解析の手順を再現することは困難であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。目的の濃度で目的の化合物の溶液を調製して開始します。常に徹底的に渦をかかすことによって化合物を混合するようにしてください。単一化合物の細胞毒性を測定するために、2倍の最終濃度で化合物を調製する。化合物の組み合わせの細胞毒性を測定する場合は、4倍の最終濃度で調製する。適切な培地と同量の溶媒を混合して、制御する溶媒のみを調製する。細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに集め、細胞懸濁液の10マイクロリットルをアリコートします。トリパンブルー染色の場合は、0.4%トリパンブルーの10マイクロリットルをアリコートに加え、ヘモサイトメーターまたはセルカウンターを使用して生存細胞と生存不可能な細胞をカウントします。15ミリリットルチューブ中のペレット細胞をGの200倍で5分間、吸引または脱キャンプした。1ミリリットル当たり5番目の細胞の3倍の10倍の細胞密度で、エッセイ適当な培地中の細胞ペレットを懸濁させる。マルチチャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルのセル懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに播種します。単一化合物アッセイの場合、2X化合物溶液を50マイクロリットルずつ各ウェルに加えます。溶剤制御ウェルの場合、2X濃度で溶媒を含む試験培地を15マイクロリットル添加します。併用アッセイの場合、各ウェルに各4X化合物の25マイクロリットルを加えます。単一化合物制御ウェルの場合、4X化合物溶液および試験培地をそれぞれ25マイクロリットル添加します。DMSOの最終濃度が0.5%を超えていないことを確認して再現性を確保するために、ピペットチップがウェルの側面に触れる薬を添加してください。異なる場所に薬を追加するように注意してください。この刺し傷は非常に迅速に行われるべきであり、好ましくはプレートあたり30分以下で済む。プレートを軽くタップして井戸の内容物を混ぜ、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。Hoechst 33342とヨウ化プロピジウムで細胞を染色する準備ができたら、新鮮な10倍の染色液を調製し、各ウェルに10マイクロリットルを加えます。プレートを軽くタップし、摂氏37度で15分間インキュベートします。プレートを200倍Gで4分間遠心し、すべての細胞をプレートの底に持ち込みます。その後、慎重に湿った実験室のワイプでプレートの底を拭き取り、イメージングを妨げる可能性のある破片を取り除きます。遠心分離後15分以内にプレートをイメージします。Gen5ソフトウェアを開き、新しい標準プロトコルを作成し、手順をクリックして、使用するプレートの種類を選択します。通常、96ウェル黒いプラスチックプレート。次に、読み取り方法をイメージに設定し、[はい]をクリックして、4X 倍率の目標を持つ DAPI とテキサスレッドフィルタセットを選択します。ウェルセンターがイメージ化されるため、オフセットは必要ありません。DAPI フィルターの場合は、LED を 10 に、統合時間を 99 に設定し、ゲインをゼロに設定します。テキサスレッドの場合は、LEDを8に、統合時間を950に設定し、ゲインを18に設定します。[オプション] をクリックして、DAPI チャネルでオート フォーカスが実行され、チャネル間のフォーカスにオフセットがないことを確認します。[OK] をクリックしてプロトコルを保存します。今すぐ画像は、新しい読み取りボタンを使用して記録することができます。画像が記録されたら、[データ削減]をクリックして、[画像の前処理]を選択します。DAPI信号に基づいて自動平坦化サイズを使用して、暗い背景減算で画像前処理を適用します。テキサスレッドの場合は、チャンネル1と同じオプションを使用します。完了したら、[はい] をクリックします。次に、セルラー分析パネルに移動し、6,000単位のしきい値、5マイクロメートルの最小物体サイズ、最大物体サイズ25マイクロメートルの変換されたDAPI信号に基づいて核マスクを適用します。画像全体を解析し、画像の境界上のプライマリエッジオブジェクトを除外し、接触するオブジェクトを分割します。詳細検出オプションでは、ローリングボールの直径を30マイクロメートルに設定し、最低ピクセルの5%に基づいて背景を評価します。計算されたメトリックのセル数のみを保持します。その後、平均変換テキサスレッド信号に基づいて、死んだ細胞を数えるために5,000単位のしきい値を使用してサブ人口分析を実行します。最後に、結果のセル数にアクセスします。Hoechstで染色された細胞の代表的な画像は、ヨウ化プロピジウムをここに示す。セルの総数は、死んだ細胞の数よりもかなり多く、より多い。細胞毒性アッセイのパネルをトリパンブルー排除と比較したところ、MTTとアラマーブルーアッセイが細胞の生存率を不正確に測定していることが判明した。これらのミトコンドリア酵素ベースのアッセイは、トリパンブルー排除に比べて有意に低い生存率を示した。Hoechst 33342とPIによる二重染色は、CCPまたは2-DG処理後のトリパンブルー染色およびトリパンブルー排除法からの最小中央値偏差との堅牢性、感度、および一貫性の最良の組み合わせを有していた。Hoechst PIエッセイは、ミトコンドリア標的分子ロテノーネと3つのブロモピルビン酸で治療後の細胞生存率を決定するのにも有効であった。さらに白血病細胞株のパネルで検証されました。.これらの細胞は、非常に感受性から抵抗細胞に及ぶロテノーネ感受性で変化した。アッセイの性能が不適切な場合、その精度が損なわれる可能性があります。いくつかの妥協された結果がここに示されています。PIで過染色したり、遠心分離ステップを無視したり、Hoechstチャネルで過度に露出したりすると、最適でない結果が生じます。このプロトコルのタイミングを設定しながら、各細胞株の色素濃度と染色時間を最適化することを忘れないでください。また、サンプルプレートの中心は、イメージング品質を確保するために必要である。癌細胞に対する細胞毒性効果の化合物を同定した後、研究者は、その関連するターゲットを同定するために、機械学的研究を進めるかもしれない。この技術を用いて小分子ライブラリーを従来のMTTアッセイと並行してスクリーニングすることで、ミトコンドリア機能を標的とする分子を迅速に同定できるようになる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

GPC3 ターゲット バイスペシフィック抗体、GPC3 S Fab 強力な細胞毒性を持つ

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

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CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

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生産と日常臨床神経内分泌腫瘍の68Ga DOTATATE ペット/CT イメージングのための実用的なガイド

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

振幅ベース最適呼吸格子アルゴリズムを用いた 18F-フルオロデオキシグルコースポジトロン放出断層撮影における呼吸運動アーティファクトの管理

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...