Name: an automated differential nuclear staining assay for accurate determination of mitocan cytotoxicity
Uploaded: 2020-05-12T15:00:00
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NVK, 암 연구에 있는 CPRIT 학자, 그들의 관대 한 지원에 대 한 텍사스의 암 예방 및 연구 연구소 (CPRIT) 감사, CPRIT 부여 RR150044. 이 작품은 또한 웰치 재단 연구 보조금 C-1930에 의해 지원되었다, 건강 R35 GM129294 NVK에 수여 국립 연구소에 의해. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.

1. 세포 독성 분석: 설정
<ol><li>적절한 매체에서 원하는 농도로 관심 있는 화합물의 솔루션을 준비한다(혈청 프리 또는 1, 2.5 또는 5% FBS RPMI-1640).<ol>
<li>단일 화합물의 세포 독성을 측정하려면 (예를 들어, 효과적인 복용량을 결정하기 위해), 2 배 최종 농도에서 화합물을 준비.</li>
		<li>화합물 조합의 세포 독성을 측정하려면 4배 의 최종 농도에서 화합물을 준비하십시오.</li>
		<li>동일한 양의 용매?...

<ol>
	<li>Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assessment:+toward+content-rich+platforms.">Cell viability assessment: toward content-rich platforms.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).</li><li>Melzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+an+affordable+marker+for+automated+live-dead+cell+analysis+in+image+cytometry.">Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry.</a> Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).</li><li>Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+nuclear+staining+assay+for+high-throughput+screening+to+identify+cytotoxic+compounds.">Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds.</a> Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).</li><li>D&#246;hner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+acute+myeloid+leukemia+in+adults:+recommendations+from+an+international+expert+panel,+on+behalf+of+the+European+LeukemiaNet.">Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet.</a> Blood. 115 (3), 453-474 (2010).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Investigations+of+the+Mitochondrial+Complex+I+Inhibitor+Rotenone+in+the+Context+of+Pharmacological+and+Safety+Evaluation.">Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation.</a> Scientific Reports. 7, 45465 (2017).</li><li>Fan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Energy+Metabolism+and+Potential+of+3-Bromopyruvate+as+an+Inhibitor+of+Aerobic+Glycolysis:+Implications+in+Tumor+Treatment.">Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment.</a> Cancers (Basel). 11 (3), (2019).</li><li>Pal, R., Mamidi, M. 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Hoechst/PI 세포 독성 분석에 대한 프로토콜은 견고하고 비교적 작은 실습 시간이 필요하지만 정확한 결과를 보장하는 데 매우 중요한 몇 가지 실험 적 세부 사항이 있습니다. 첫째, DMSO의 농도가 0.5%(v/v) 이하로 유지되도록 하는 것이 필수적입니다. 일반적으로 DMSO의 저용량에도 노출되면 세포의 형태와 부착을 실질적으로 변화시키고 세포 주기 진행을 크게 지연시킬 수 있다는 데동의된다<su...

효과적인 암 치료를 확인하는 첫 번째 단계는 치료의 효과를 검사하는 데 사용할 수있는 강력하고 편견없는 세포 독성 분석의 선택입니다. 낮은 처리량 실험에 대 한 일반적인 선택은 살아있는 세포에서 trypan 블루 염료의 제외. 이 방법은 세포 생존을 정량화하는 비교적 편견없는 방법을 허용하기 때문에 선호된다. trypan blue는 막이 손상된 세포로 수동적으로 확산되지만 건강한 세포1을입력하는 것이 효과적으로 차단됩니다. 살아있는 세포와 총 세포의 몫은 치료의 효험을 나타내는 백분율 생존력을 나타냅니다. trypan 파란색 분석의 가장 중요한 단점은 높은 처리량 방법론에 적합하지 않다는 것입니다. 그것은 상대적으로 낮은 신호 대 잡음 비율을 가지고 있으며, 장기간 염색으로 인해 실행 가능한 세포의 얼룩으로 인해 아티팩트를 초래할 수 있습니다. 따라서 trypan 파란색 제외는 일반적으로2이며수동 계수로 강등됩니다. 이것은 너무 느리게 하고 연구원의 주관적인 판단으로 인한 편견의 강한 가능성을 소개합니다 (눈부신 또는 독립적 인 카운트가 사용되지 않는 한 실험실 처리량을 더 줄입니다). 일반적으로, 이 분석의 처리량은 현대 약 발견을 위해 불충분합니다.
일반적으로 훨씬 더 높은 처리량을 가진 생존 가능성 분석은 연구원이 이 한계를 우회할 수 있게 하지만 중요한 주의 사항(표 1참조). 이러한 메서드는 일반적으로 두 그룹으로 나뉩니다. 한 그룹은 세포 레독스 효소의 기능에 기초한 착색 분석으로 구성됩니다. 무색 또는 비형광 기판은 분광광계를 사용하여 정량화 할 수있는 생생한 제품으로 변환됩니다. 테트라졸륨 염(MTT, WST-1, XTT 등)과 레사쥐린등이 대표적인 예입니다. 이 범주에는 또한 ATP 수준을 평가하기 위해 루시페린을 활용하는 발광 성 소사도 포함됩니다. 이 모형의 분석은 세포 대사를 측정하는 근본적인 한계가 있습니다, 이는 세포 생존성이 아닙니다. 세포가 불리한 조건하에서 정지되는 것은 매우 일반적이지만, 여전히3,4,5를분할하는 능력을 유지합니다. 예를 들어, 암줄기세포는 종종 비교적 대사적으로정지6,7,8,9,이러한 기술을 사용하여 분석하기 어려울 가능성이 있다. 대부분의 미토칸과 같은 미토콘드리아 기능을 손상시키는 치료의 효과또한 상당히 과대 평가될 가능성이 높습니다.
다른 방법론은 생물학적 막을 교차하거나 교차하지 않도록 허용하는 다양한 물질의 화학적 특성을 활용합니다. 한 가지 예는 SYTOX 또는 프로피듐 요오드 (PI)와 같은 핵 얼룩입니다. 이 범주에는 또한 개념상 유사하지만 기능상 다른 분석(LDH) 분석, 세포 괴사의 지표로서 세포외 밀리유로LDH의 방출을 측정하는분석(도 1,표 1). 이 소는 신진 대사비활성 세포와 죽은 세포를 구별할 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>분석/염료</td>
			<td>세포 사멸의 유형(들) 검출</td>
			<td>필요한 장비</td>
			<td>주요 기능</td>
		</tr>
<tr>
<td>MTT, CKK-8, 알라마 블루 (레사쥐린)</td>
			<td>아포토시스/괴사증</td>
			<td>분 광 광도 계</td>
			<td>저렴, 빠른; 끝점 분석; 효소의 활성 (MTT의 경우 독점적으로 미토콘드리아)에 의존하고 세포 사멸 의 모드를 구별하지 않습니다1,10
</td>
		</tr>
<tr>
<td>LDH 릴리스</td>
			<td>괴 사</td>
			<td>분 광 광도 계</td>
			<td>급속한, 미토콘드리아 효소의 활성과 무관; 높은 처리량 테스트에 대 한 비싼; 결합된 혈장 막11,12를 가진 괴사 세포를 검출합니다
</td>
		</tr>
<tr>
<td>트라이판 블루 (TB)</td>
			<td>아포토시스/괴사증</td>
			<td>현미경</td>
			<td>세포 불굴의; 세포 사멸의 모드를 구별하지 않습니다; 고처리량 스크리닝에 적합하지 않은 고공처리량 스크리닝; 부착 셀과 함께 사용하기가 더 어렵다; 사용자의 주관적인 판단에 취약하지만 표준 셀 생존성 측정방법(13)으로 간주됩니다.
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">아크리딘 오렌지 (AO)</td>
			<td>아포토시스/괴사/</td>
			<td rowspan="2">형광 현미경</td>
			<td rowspan="2">독특한 스펙트럼 특성을 가진 핵산 염료는 세포석증과 괴사/necroptosis14를 구별할 수 있습니다.
</td>
		</tr>
<tr>
<td>네크로토시스</td>
		</tr>
<tr>
<td>호흐트스트 33342, DAPI</td>
			<td>Apoptosis</td>
			<td>형광 현미경 또는 유동 세포계</td>
			<td>세포 투과성; 세포 사멸을 모니터링하는 것은 그 자체로 부적절합니다. 공동 염색에 유용합니다. 초기 세포사멸에서 크로마틴 응축 및 핵 단편화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 요오드제와 페어링하여 사멸을 괴사15,16과 구별할 수 있습니다.
</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로피듐 이오드 (PI)</td>
			<td>늦은 자멸/괴사</td>
			<td>형광 현미경 또는 유동 세포계</td>
			<td>세포 불굴의 인터칼레이터; 세포사멸의 후기 세포사멸 및 괴사 모드를 모두검출한다(17). 긴 잠복 시간18 후 독성 및 투과성
</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 세포 독성 검사 목록. 세포 독성 연구, 일부는이 연구에서 사용 되었다, 그들의 주요 기능에 대 한 간단한 설명과 함께 나열.
최근 연구에 따르면 미토콘드리아 대사가 일부 암19,20,21,22,23,24,25에서변경된다는 것을입증했습니다. 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML)은 그들의 에너지 요구를 충족시키기 위하여 그들의 미토콘드리아 질량, mtDNA 함량 및 미토콘드리아 호흡을 강화시키는 것으로 나타났습니다19,26,27. 한편, 일부 고형종양은 OXPHOS에 관여하는 미토콘드리아 단백질의 다운조절또는 mtDNA 함량 감소와 같은 미토콘드리아 기능 장애 또는 오히려 "대사 재프로그래밍"을 특징으로 하며, 이는 종양 침습성, 전이성 전위 및 세포멸 유발 약물에 대한 내성과 관련이 있다28,29. 더욱이, 최근에는 특정 암에 대한 잠재적 치료법으로 미토콘드리아 기능(일반적으로 미토칸30이라고함)에 영향을 미치는 기계적으로 다양한 화합물을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다. 이들 약물은 ATP 합성, 미토콘드리아 DNA, OXPHOS 및 ROS 생산을 대상으로 하며, 미토콘드리아(30,31)와관련된 세포세포 및 세포세포 단백질을 표적으로 한다. 몇몇 연구 결과는 이 접근이 중요한 약속19,32,33,34가있다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 암 세포 생물학 또는 미토콘드리아 표적화 처리에 있는 이 신진 대사 편차는 미토콘드리아 기능에 근거를 둔 전통적인 생존가능성 소사에 현저하게 영향을 미칠 수 있습니다.
여기서, 차동 핵 염색 분석에 대한 최적화된 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜은 미토칸의 세포 독성 또는 다른 화합물과의 조합의 빠르고 정확한 측정을 허용합니다. Hoechst 33342는 세포막을 쉽게 교차시켜 DNA를 얼룩지게 하는 세포 침투 핵 염료로, 총 세포 수를 얻을 수 있게 한다. 죽은 세포의 핵만으로 들어가는 PI와 공동 염색함으로써, 살아있는 비율(Hoechst 만) 및 죽은(둘 다염색) 세포가 정확하게 결정될 수 있다. 이 프로토콜은 공표된분석법(35)을 단계별 염료 농도 최적화를 위한 단계(직교 트라이팬 블루 방법을 이용한 교차 참조 결과)와 이미징 전에 플레이트의 원심분리를 정제한다. 많은 세포주반 부착 또는 일시 중단되기 때문에 원심분리는 이미지화되어 정확도를 강하게 향상시키는 세포의 비율을 증가시킵니다. 분석법은 스테인링이 미디어 또는 세척을 제거할 필요가 없다는 것을 포함하여 몇 가지 장점이 있습니다. 염료 혼합물은 또한 저렴하고, 준비하기 쉬우며, 멀티채널/로봇 파이펫팅 시스템과 호환됩니다.
세포가 염색된 후에, 그(것)들은 자동화한 현미경으로 심상입니다. 이는 나중에 다시 분석할 수 있는 이미지의 영구 기록을 만드는 장점이 있으며, 특정 화합물의 효과는 캡처된 이미지의 육안 검사에 의해 재평가될 수 있다. 이미지를 획득하면 셀을 수동으로 또는 무료(예: ImageJ, CellProfiler 등) 및 상용 소프트웨어(예: 변형, Gen5 등)를 포함한 여러 소프트웨어 패키지를 사용하여 셀을 계산할 수 있습니다. 자동화된 셀 카운팅은 일반적으로 수동 셀 계산보다 더 정확하고 편향이 적기 때문에 일반적으로 바람직합니다. 또한 세포 파편이나 용해성 복합체를 보다 효과적으로 무시합니다. 이러한 파이프라인의 개발은 일반적으로 간단하며 사용되는 얼룩의 효율성에 의해 단순화됩니다. 출력은 실제 죽은 세포의 수가 총 세포 수에 대하여 자동으로 계산되기 때문에 정량적이며, 다른 임계값은검출(35)의스트링성을 증가 또는 감소시키기 위하여 적용될 수 있다. 편의를 위해 Gen5 대 3.00 소프트웨어 호환 Cytation 5 셀 이미징 멀티 모드 리더를 사용하여 셀 을 계산하기 위한 최적화된 매개 변수가 포함되어 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1423px;" width="1423">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">2-Deoxy-D-glucose/2-DG</td>
			<td style="width:137px;">Chem-Impex</td>
			<td style="width:176px;">50-519-067</td>
			<td style="width:819px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">3-bromo-pyruvate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td style="width:176px;">1113-59-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">96-Well plates</td>
			<td style="width:137px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:176px;">655090</td>
			<td>Black or clear flat-bottomed 96-well plates 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>A50101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Countess II automated cell counter</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td style="width:137px;">BioTek</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:176px;">62249</td>
			<td>20 mM solution; final concentration 1:1,000 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HyClone fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#25-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">m-chlorophenylhydrazone/CCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Pierce LDH assay kit</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>50-103-5952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher</td>
			<td>50-596-072</td>
			<td>Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 &#181;g/mL (leukemia cells), 1 &#181;g/mL (normal PBMCs) 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotenone</td>
			<td>Ark Pharm</td>
			<td style="width:176px;">AK115691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:84px;width:291px;">RPMI-1640 Medium 
			With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:137px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazolyl blue tetrazolium bromide</td>
			<td style="width:137px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:176px;">AC158990010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Trypan blue stain (0.4%)</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td style="width:176px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1423px;">Cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">K562</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;">CCL-243</td>
			<td>CML cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">MOLM-13</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td>AML cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">MOLT-4</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1582</td>
			<td>ALL cell line 
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">OCI-AML2</td>
			<td style="width:137px;">ATCC</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td>AML cell line 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated differential nuclear staining assay for accurate determination of mitocan cytotoxicity

미토콘드리아가 온코겐성 변화에 기여하는 것은 광범위한 관심과 적극적인 연구의 대상입니다. 암 대사 분야가 더욱 복잡해짐에 따라 미토콘드리아 손상(소위 미토칸)을 가하는 다양한 화합물을 이용한 미토콘드리아를 표적으로 하는 것이 매우 인기를 끌고 있습니다. 불행히도, 테트라졸륨 염이나 레사쥐린을 기반으로 하는 것과 같은 많은 기존 세포 독성 작용제는 그들의 성능을 위해 기능적인 미토콘드리아 효소가 필요합니다. 미토콘드리아를 표적으로 하는 화합물에 의해 가해진 손상은 수시로 이 심세의 정확도를 손상합니다. 여기서는 두 개의 형광 염료를 가진 차동 염색에 기초하여 변형된 프로토콜을 설명하고, 그 중 하나는 세포 분산(Hoechst 33342)이고 다른 하나는 그렇지 않다(예의 요오드). 염색의 차이는 살아있는 세포와 죽은 세포를 차별할 수 있게 합니다. 분석법은 처리량을 증가시키고 편견을 감소시키는 자동화된 현미경 검사법과 이미지 분석에 사용가능합니다. 이것은 또한 96 웰 플레이트를 사용하여 고처리량 방식으로 분석방법을 사용할 수 있게 해주며, 특히 문제의 약물이 어느 정도의 미토독성을 가지고 있을 때 약물 발견 노력을 위한 실행 가능한 옵션입니다. 중요하게도, Hoechst/PI 염색 분석체에 의해 얻은 결과는 분석이 다른 방법에 비교될 때 트라이판 블루 배제 결과 및 생물학적 복제 사이에 모두 증가된 일관성을 보여줍니다.

전술한 프로토콜은 대표적인 급성 골수성 백혈병 세포주로서 취해진 OCI-AML2 세포를 사용하여 개발되었다. AML은골수(26)에서미분화 및 비기능성 조혈 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 한다. AML 표적 치료의 최근 발달에도 불구하고, 배려의 표준은 수십 년 동안 변경되지 않은 남아 있고, 유도 치료로 구성됩니다 (전형적으로 탄트라시클라인의 3 일, 예를 들면, daunorubicin, 이다루...

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An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

이 프로토콜은 세포 생존 가능성을 효율적으로 결정하기 위한 신속하고 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 저렴하며 편견없는 분석서를 설명합니다. 이 분석은 세포의 미토콘드리아가 손상되어 다른 분석과 방해가 되는 경우에 특히 유용합니다. 분석은 두 개의 핵 염료로 염색 된 세포의 자동 계수를 사용합니다 - Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드.

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

이 방법은 연구원이 미토콘드리아 기능의 독립적으로 세포 생존가능성을 평가할 수 있게 합니다. 그리고 높은 처리량 약물 검사 노력에 순종적이다. 이 기술은 빠르고 정확하며 저렴하며 대부분의 세포 유형에서 미토콘드리아 기능을 손상시키는 화합물 세포 독성을 측정할 수 있습니다.이 프로토콜은 수행하기 쉽습니다. 실험적 정확성과 유효성을 보장하기 위해 약물 제제, 치료 조건 및 세포 밀도에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 특히 Gen5 Software에 대한 경험이 거의 없는 연구자의 경우 이미지 수집 및 이미지 분석 단계를 재현하기 어려울 수 있기 때문에 이 방법의 시각적 데모가 중요합니다.원하는 농도에서 관심 있는 화합물의 솔루션을 준비 하 여 시작. 항상 철저하게 소용돌이하여 화합물을 혼합해야합니다. 단일 화합물의 세포 독성을 측정하려면 2배 최종 농도에서 화합물을 준비하십시오.화합물 조합의 세포 독성을 측정하는 경우 4배 의 최종 농도로 준비하십시오. 동일한 양의 용매를 적절한 배지와 혼합하여 용매 전용 컨트롤을 준비합니다. 세포 현탁액의 15 밀리리터 원내 튜브와 알리쿼트 10 마이크로리터로 세포를 수집합니다.트라이판 블루 염색의 경우, 알리쿼트에 0.4%의 트라이판 블루 10마이크로리터를 추가하고 혈전계 또는 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 세포와 실행 불가능한 세포를 계산합니다. 15 밀리리터 튜브의 펠릿 세포는 5 분 동안 200 회 G에서, 다음 흡인 또는 슈퍼 나탄을 배출. 우리는 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 3 배 10의 세포 밀도에서 에세이 적절한 매체에서 세포 펠릿을 일시 중단합니다.멀티 채널 파이펫을 사용하여 50 마이크로리터의 셀 서스펜션을 96웰 플레이트의 각 웰에 시드합니다. 단일 화합물 어필의 경우 각 웰에 2X 화합물 용액 50 마이크로리터를 추가하십시오. 용매 제어 우물의 경우 용매를 2배 농도로 포함하는 테스트 매체 15마이크로리터를 추가합니다.조합 된 소의를 위해 각 4X 화합물의 25 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다. 단일 복합 제어 웰의 경우 각각 25마이크로리터를 4X 화합물 용액과 테스트 배지를 추가합니다. DMSO의 최종 농도가 0.5%를 초과하지 않도록 재현성을 보장하고, 우물의 측면을 만지는 파이펫 팁으로 약물을 추가하십시오.다른 위치에 약물을 추가 하는 신중. 이 찌르기는 바람직하게는 플레이트 당 30 분 이상 복용, 매우 빠르게 수행해야합니다. 접시를 부드럽게 탭하여 우물의 내용을 섞어 섭씨 37도와 이산화탄소 5%로 배양합니다.Hoechst 33342및 propidium 요오드로 세포를 염색할 준비가 되면 신선한 10X 염색 용액을 준비하고 각 웰에 10 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 부드럽게 누르고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 플레이트의 바닥에 모든 세포를 가져오기 위해 4 분 동안 200 배 G에서 플레이트를 원심 분리합니다.그런 다음 젖은 실험실 닦아서 플레이트 바닥을 조심스럽게 닦아 이미징을 방해 할 수있는 파편을 제거하십시오. 원심분리 후 15분 이내에 플레이트를 이미지화합니다. Gen5 소프트웨어를 열고 새 표준 프로토콜을 만들고 절차를 클릭하고 사용할 플레이트 유형을 선택합니다.보통, 96 잘 검은 플라스틱 접시. 다음으로 읽기 메서드를 이미지로 설정하고 Okay를 클릭하고 4배 배율 목표를 가진 DAPI 및 텍사스 레드 필터 세트를 선택합니다. 웰 센터가 이미지화되므로 오프셋이 필요하지 않습니다.DAPI 필터의 경우 LED를 10으로 설정하고 통합 시간을 99로 설정하고 0으로 가져옵니다. 텍사스 레드의 경우 LED를 8로 설정하고 통합 시간을 950으로 설정하고 18로 증가합니다. 옵션을 클릭하여 DAPI 채널에서 자동 포커스가 수행되고 채널 간에 초점을 맞추는 데 오프셋이 없는지 확인합니다.좋아요를 클릭하여 프로토콜을 저장합니다. 이제 새 읽기 단추를 사용하여 이미지를 기록할 수 있습니다. 이미지가 녹화되면 데이터 감소를 클릭하고 이미지 전처리를 선택합니다.DAPI 신호를 기반으로 자동 병합 크기를 사용하여 어두운 배경 빼기로 이미지 전처리를 적용합니다. 텍사스 레드의 경우 채널 1과 동일한 옵션을 사용합니다. 완료되면 확인을 클릭합니다.그런 다음 셀룰러 분석 패널로 이동하여 6, 000 단위의 임계 값, 최소 물체 크기 5 마이크로미터 및 25 마이크로미터의 최대 물체 크기로 변형된 DAPI 신호를 기반으로 핵 마스크를 적용합니다. 전체 이미지를 분석하고 이미지 테두리의 기본 가장자리 개체를 배제하고 터치 오브젝트를 분할합니다. 고급 감지 옵션에서는 롤링 볼 직경을 30 마이크로미터로 설정하고 가장 낮은 픽셀의 5%를 기준으로 배경을 평가합니다.셀 수를 계산된 메트릭에만 유지합니다. 그 후, 죽은 세포를 계산하기 위해 5, 000 단위의 임계 값으로 변형 된 텍사스 적 신호 평균에 기초하여 하위 집단 분석을 수행합니다. 마지막으로 결과 셀 수에 액세스합니다.Hoechst, 프로피듐 요오드로 염색 된 세포의 대표적인 이미지가 여기에 표시됩니다. 세포의 총 수는 합리적으로 높고 죽은 세포의 수보다 큽습니다. 세포 독성 분석의 패널이 트라이판 블루 배제와 비교되었을 때, MTT와 알라마르 블루 분석이 셀룰러 생존가능성을 부정확하게 측정한 것으로 나타났습니다.이러한 미토콘드리아 효소 기반 분석제는 트라이판 블루 제외에 비해 생존가능성이 현저히 낮았다. Hoechst 33342 및 PI를 이용한 이중 염색은 CCP 또는 2-DG 처리 후 트라이판 블루 스테인링과 트라이판 블루 배제 방법에서 가장 작은 중앙 편차와 견고성, 감도 및 일관성의 최상의 조합을 가졌다. Hoechst PI 에세이는 또한 분자 로테네네와 3개의 브로모피라바테를 표적으로 하는 미토콘드리아를 대상으로 처리 후에 세포 생존가능성을 결정하는 데 효과적이었습니다.그것은 백혈병 세포주 패널로 더 검증되었다. 이 세포는 저항 세포에 아주 과민한에서 구역수색하는 로테네감에서 변화했습니다. 분석의 부적절한 성능은 정확도를 손상시킬 수 있습니다.몇 가지 손상된 결과가 여기에 표시됩니다. PI로 과도하게 스태킹하거나 원심분리 단계를 무시하거나 Hoechst 채널의 과다 노출로 인해 최적이 아닌 결과가 발생합니다. 이 프로토콜의 타이밍동안 각 세포주에 대한 염료 농도 및 염색 시간을 최적화해야합니다.또한, 샘플 플레이트에 대한 중심화는 이미징 품질을 보장하기 위해 필요합니다. 암세포에 대한 세포 독성 효과의 화합물을 식별 한 후, 연구원은 그들의 관련 목표를 식별 하기 위해 기계적인 연구와 함께 진행할 수 있습니다. 기존의 MTT assays와 병행하여 이 기술을 가진 소분자 라이브러리를 스크리닝하면 미토콘드리아 기능을 표적으로 하는 분자가 빠르게 식별될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

GPC3 대상으로 Bispecific 항 체, GPC3-S-팹, 강력한 세포 독성을

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

연구

암 연구학

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

생산 및 매일 임상 연습에서 신경 내 분 비 종양에 대 한 68Ga-DOTATATE의 PET/CT 영상에 대 한 실용적인 가이드

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

진폭 기반 최적의 호흡기 개팅 알고리즘을 사용하여 18F-플루오로옥시옥포도당 양전자 방출 단층 촬영에서 호흡기 운동 유물 관리

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법: 림마, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...