Name: modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone
Uploaded: 2020-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone at JoVE.com

Yazarlar, Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP'nin bu tekniğin geliştirilmesine kritik katkısını kabul etmektedir.

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Cambridge Üniversitesi, Cambridge, İngiltere'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre hatlarının hazırlanması
<ol><li>Geleneksel hücre kültürü veya farelere enjeksiyon için laboratuvarın standart hücre kültürü protokollerine uygun olarak hücre hatlarını büyütün. Burada kullanılan standart protokoller, Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu (FBS), L-glutamin ve penisilin / streptomisin ...

<ol>
	<li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Mouse:+the+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research.">The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li><li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+rodents+as+models+of+human+diseases.">Use of rodents as models of human diseases.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Wolfe, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zoledronic+acid+and+amputation+on+bone+invasion+and+lung+metastasis+of+canine+osteosarcoma+in+nude+mice.">Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinicopathological+features+and+survival+outcomes+of+patients+with+different+metastatic+sites+in+stage+IV+breast+cancer.">The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).</li><li>James, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=metastases+from+breast+carcinoma:+histopathological+-+radiological+correlations+and+prognostic+features.">metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features.</a> British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Chaffee, B. K., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+mouse+model+of+canine+osteosarcoma+with+spontaneous+metastasis.">A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis.</a> In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).</li><li>Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+volume+and+lung+metastasis+in+patients+with+osteosarcoma.">Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma.</a> Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+and+clinicopathological+features+of+osteosarcoma+metastasis+to+the+lung:+A+population-based+study.">Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study.</a> Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).</li><li>Li, W., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+primary+osteosarcoma+and+lung+metastases.">Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases.</a> Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).</li><li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+bone+metastasis.">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).</li><li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+Injection+Causes+Direct+Pulmonary+Seeding+of+Osteosarcoma+Cells+and+Is+Not+a+Spontaneous+Model+of+Metastasis:+A+Mouse+Osteosarcoma+Model.">Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model.</a> Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li><li>Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studying+prostate+cancer+bone+metastasis.">Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis.</a> BoneKey Reports. 5, 777 (2016).</li><li>Marques da Costa, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+in+vivo+orthotopic+bioluminescent+xenograft+models+from+human+osteosarcoma+cell+lines+in+Swiss+nude+and+NSG+mice.">Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice.</a> Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).</li><li>Raheem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+patient-derived+intra-femoral+xenograft+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer+that+recapitulates+mixed+osteolytic+and+osteoblastic+lesions.">A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).</li><li>Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+intrafemoral+injection+with+minimized+leakage+as+an+orthotopic+mouse+model+of+osteosarcoma.">An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma.</a> Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).</li><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-iliac+Artery+Injection+for+Efficient+and+Selective+Modeling+of+Microscopic+Bone+Metastasis.">Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).</li><li>Kuchimaru, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+murine+model+of+bone+metastasis+by+injecting+cancer+cells+through+caudal+arteries.">A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries.</a> Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).</li><li>Haley, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Bone+Metastases+in+Skeletally+Immature+Mice.">Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice.</a> Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).</li><li>Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompromised+and+immunocompetent+mouse+models+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).</li><li>Lefley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+clinically+relevant+in+vivo+metastasis+models+using+human+bone+discs+and+breast+cancer+patient-derived+xenografts.">Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts.</a> Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).</li><li>Tuveson, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+modeling+meets+human+organoid+technology.">Cancer modeling meets human organoid technology.</a> Science. 364 (6444), 952-955 (2019).</li></ol>

Bu yazı, bir tümör allogreftinin intratibial implantasyonunu takiben primer kemik tümörleri veya kemik metastazı oluşturma modelimizi belgelemektedir. Bu süreçte birkaç kritik adım olduğuna inanıyoruz. Hem tümör hücresi süspansiyonunun deri altına enjeksiyonu hem de ortaya çıkan tümör fragmanlarının intratibial yerleşimi için güvenli bir anestezi düzlemi oluşturulmalıdır. Hem subkutan allogreftin çıkarılması hem de allogreftin intratibial yerleştirilmesi için cerrahi bölgenin steril ...

İnsan ve hayvan hastalıklarının fare modelleri, biyomedikal araştırmalarda giderek daha popüler hale geliyor. Bu bağlamda fareleri kullanmanın yararı, anatomi ve fizyolojilerinin insanlara çok benzemesidir. Olgunluğa ulaşmak için doğum sonrası yaşamda nispeten kısa bir gebelik süresine ve süresine sahiptirler ve büyük ölçüde nispeten düşük bir maliyet ve barınma kolaylığı ile ilişkilidirler, ancak artan geliştirme veya satın alma maliyetleri daha yüksek derecelerde genetik modifikasyon, immün yetmezlik ve / veya insancıllaştırma ile ilişkilidir1. Akraba suşların kullanımı, çalışmanın dahil edilmesinden önce büyük ölçüde tekdüze bir hayvan popülasyonu ile sonuçlanır. Genomlarının tam bir bilgisi, insanlara yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Fare genomunda birçok hastalık süreci için ortolog moleküler hedefler tanımlanmıştır ve şimdi kolayca elde edilebilen fareye özgü reaktiflerin kapsamlı bir kütüphanesi bulunmaktadır. Bu nedenle, daha büyük hayvan modellerine kıyasla daha hızlı ve daha ucuz bir şekilde nispeten yüksek verimli analiz için fırsat sağlarlar1. Ek olarak, belirli genlerin küresel olarak veya hücre tipine özgü bir şekilde ve / veya yapısal veya indüklenebilir bir şekilde aşırı ekspresyonuna veya silinmesine izin veren genetik düzenleme stratejilerinin ortaya çıkmasıyla, insan ve hayvan hastalıklarının araştırılması için biyolojik olarak çok yararlı bir model sistemi temsil etmektedirler2.
Kanser, fare modellerinin büyük faydaya sahip olduğu bir alandır. Kanserin genetik fare modelleri, hücrelerin onkojenik transformasyona uğraması için onkogenlerin veya tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonunun tek başına veya kombinasyon halinde modülasyonuna dayanır. Primer veya yerleşik tümör hücre hatlarının farelere enjeksiyonu da gerçekleştirilir. İnsanlardan veya fareler de dahil olmak üzere diğer hayvan türlerinden hücre hatlarının veya dokuların tanıtılması, in vivo olarak en yaygın kullanılan kanser modeli olmaya devam etmektedir. İmmün sistemi baskılanmış farelerde farklı türlerden (ksenogreftler) hücrelerin ve dokuların kullanımı en yaygın olarak gerçekleştirilir2. Bununla birlikte, hem konakçının hem de alıcının aynı türden olduğu allogreft tümör hücrelerinin veya dokularının kullanılması, sinjenik sistemlerde aynı konakçı fare suşu ile birleştirildiğinde sağlam bir bağışıklık sistemi ile etkileşime izin verir3.
Primer kemik tümörleri veya solid tümörlerden kemik metastazı ağrılı osteolitik, osteoblastik veya mikst osteolitik / osteoblastik lezyonlara neden olur 3,4. Bu tümörler kemik yapısını bozar, patolojik kırık riskini arttırır ve hastaları sınırlı tedavi seçenekleriyle baş başa bırakır. Primer kemik tümörleri uzak organlara metastaz yapar ve bazı tipleri diğer iskelet bölgelerine yayılabilir. Meme kanserli hastalarda kemik, metastatik hastalığın ilk metastazının en sık görüldüğü ve ilk ortaya çıktığı yerdir 5,6. Ek olarak, yayılmış tümör hücreleri (DTC'ler) diğer organlarda metastaz tanısı konmadan önce kemik iliğinde bulunur ve gelişimini öngörür7. Bu nedenle, kemikte bulunan kanser hücrelerinin, nihayetinde diğer organ sistemlerine metastaz yapan hücrelerin kaynağı olduğuna inanılmaktadır. Ağırlıklı olarak akciğer ve lenf nodlarında metastaz geliştiren ve tümör tipine ve enjeksiyon tekniğine bağlı olarak, potansiyel olarak diğer organ sistemlerinde metastaz geliştiren birçok fare katı tümör metastazı modeli mevcuttur3. Bununla birlikte, kemik metastazının fare modelleri, güvenilir bir şekilde, bölgeye özgü iskelet metastazı üreten ve fareler primer tümör yükünden veya metastazdan diğer organlara erken çıkarma kriterlerine ulaşmadan önce kemik metastazı geliştiren eksiktir. Primer kemik tümörü osteosarkomunun, solid tümör allogreftinin farelerin proksimal tibiasına cerrahi implantasyonuna dayanan bir modelini sunduk8. Kemik tümörleri farelerin %100'ünde oluşmuş ve %88'inde pulmoner metastaz gelişmiştir. Bu metastaz insidansı, insanlarda klinik olarak yaygın olarak bildirilenleri aşmaktadır (~% 20-50), ancak akciğer osteosarkom için en sık metastaz yeri olduğu için büyük ilgi çekmektedir 9,10,11. Bu model primer kemik tümörlerinin modellenmesinde avantajlı olmakla birlikte, meme, akciğer, prostat, tiroid, hepatik, renal ve gastrointestinal tümörler gibi diğer osteotropik solid tümörlerden kemik metastazının modellenmesinde de büyük faydası vardır.
Bu modelin geliştirilmesinin mantığı, primer kemik tümörlerini veya kemik metastazını modellemek için tipik olarak proksimal tibia veya distal femura geleneksel intra-osseöz enjeksiyona bir alternatif geliştirmekti12. Öncelikli amacımız bu tekniğin bilinen bir kısıtlılığını, yani akciğerin tümör embolizasyonunu hafifletmekti. Bu, bu embolik tümör hücrelerinin engraftmanı ve akciğerlere metastaz yapan yerleşik bir primer kemik tümöründen tam metastatik kaskatı özetlemeyen "yapay metastaz" ile sonuçlanır 8,13. Bu aynı zamanda yerleşik bir kemik metastazının uzak bir bölgeye yayıldığı durum olacaktır. Ek olarak, bu teknik, ortotopik veya intravasküler enjeksiyon teknikleriyle karşılaştırıldığında, kemikte ve tekdüze bir bölgede daha fazla engraftman ve tümör büyümesi insidansı sağlayacak bir kemik metastazı modeli üretmek için geliştirilmiştir. Bu modelin, açıklanan bu tekniklere göre belirgin avantajları vardır. Bu model, tümör hücrelerinin kemiğe kontrollü ve tutarlı bir şekilde verilmesini içerir. Ayrıca, pulmoner embolizasyonu takiben yapay akciğer metastazını önler ve temel bir tekdüze çalışma popülasyonu oluşturur. Primer tümörlerden veya diğer organlara metastaz sonucu oluşan erken çıkarma kriterleri riski olmadan bu model ile bölgeye özgü tümörlerin yararı vardır. Son olarak, bu model, hasta kaynaklı ksenogreftlerin kullanımı da dahil olmak üzere modifikasyon için büyük bir faydaya sahiptir.
Sunulan model, cerrahi bir yaklaşımı takiben kemiğe doğrudan hücre süspansiyonu enjeksiyonu ile benzerlikler göstermektedir, ardından korteksten enjeksiyon veya kortekste küçük bir kusur yaptıktan sonra kemik iliği boşluğuna verilmesi (medüller boşluğu raybalama ile veya olmadan)8,14,15,16,17. Bununla birlikte, bir tümör allogreftinin implantasyonu bu tekniği belirgin şekilde farklı kılar. Bu nedenle, bu raporun amacı, daha önce tarif edilen modellerin birçok sınırlamasının üstesinden gelen primer kemik tümörleri ve solid tümörlerden kemik metastazı modelini göstermektir. Hücre kültürü, fare modelleri, fare anestezisi ve cerrahisi ve fare anatomisi konusunda deneyime sahip araştırma grupları, farelerde birincil kemik tümörlerini veya kemik metastazını modelleme tekniğimizi yeniden üretmek için iyi donanımlıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#15 scalpel blade</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>75614</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10578911</td>
			<td>Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrams osteosarcoma cell line</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal weighing scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c nude mouse (nu/nu)</td>
			<td>Charles River Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>6-8 weeks of age. Male or female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone cement</td>
			<td>Depuy Synthes</td>
			<td>160504</td>
			<td>Optional use instead of bone wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W31G</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Animalcare Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide euthanasia station</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Should be provided within animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator set at 37 &#176;C and 5% carbon dioxide</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Various</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>411412</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials (2 ml)</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin (Firefly), potassium salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>500-181-30</td>
			<td>Can be manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microradiography cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics, LLC</td>
			<td>MX-20</td>
			<td>Optional to evaluate bone response to tumor growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1371171000</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2483</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11200-33</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (&#8211; 80 &#176;C)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MDF-794C</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11704939</td>
			<td>Can also use automated cell counter, if available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles (27 gauge)</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>DIS55510</td>
			<td>May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>1182098</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher scientifc</td>
			<td>25030081</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>British Oxygen Corporation</td>
			<td>NA</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen dewar, 5 litres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TY509X1</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#174; Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Optional. Also available in 10 ml size (354230)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002549</td>
			<td>Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty freezing containiner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10110051</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td>Can alternatively use an electric clipper with fine blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, #7 Short</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>10007-12</td>
			<td>User preference as long as it accepts #15 scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heated pad</td>
			<td>VetTech</td>
			<td>HE006</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>GT Vision Ltd.</td>
			<td>H600BV1</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive (sterile)</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td>84-1469SB</td>
			<td>Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5250061</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Use 0.05%-0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>Slip tip preferred over Luer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vented tissue culture flasks, T-75</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CLS3290</td>
			<td>Can also use smaller or larger flasks, as needed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone

Primer kemik tümörleri veya solid tümörlerden kemik metastazı ağrılı osteolitik, osteoblastik veya mikst osteolitik / osteoblastik lezyonlara neden olur. Bu lezyonlar kemik yapısını bozar, patolojik kırık riskini artırır ve hastaları sınırlı tedavi seçenekleriyle baş başa bırakır. Primer kemik tümörleri uzak organlara metastaz yapar ve bazı tipleri diğer iskelet bölgelerine yayılabilir. Bununla birlikte, son kanıtlar, birçok katı tümörle, kemiğe yayılmış kanser hücrelerinin, nihayetinde diğer organ sistemlerine metastaz yapan hücrelerin birincil kaynağı olabileceğini düşündürmektedir. Primer kemik tümörlerinin çoğu sinjenik veya ksenogreft fare modeli, tümör hücresi süspansiyonlarının intra-osseöz (ortotopik) enjeksiyonunu içerir. Katı tümörlerden iskelet metastazının bazı hayvan modelleri de doğrudan kemik enjeksiyonuna bağlıdır, diğerleri ise hücreleri intravasküler olarak veya primer tümörün organına enjekte ederek kemik metastatik kaskadının ek adımlarını özetlemeye çalışır. Bununla birlikte, bu modellerin hiçbiri güvenilir bir şekilde veya% 100 insidansı ile kemik metastazı geliştirmez. Ek olarak, tümör hücrelerinin doğrudan intra-osseöz enjeksiyonunun, akciğerin potansiyel tümör embolizasyonu ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu embolik tümör hücreleri aşılanır, ancak metastatik kaskatı özetlemez. Taze veya kriyokorunmuş tümör fragmanlarının (tümör hücreleri artı stromadan oluşan) minimal invaziv bir cerrahi teknik kullanılarak doğrudan proksimal tibiaya implante edildiği bir fare osteosarkom modeli sunduk. Bu hayvanlar tekrarlanabilir engraftman, büyüme ve zamanla osteoliz ve akciğer metastazı geliştirdi. Bu teknik, solid tümör kemik metastazını modellemek için kullanılacak çok yönlülüğe sahiptir ve optik veya ileri görüntüleme ile izlenebilen bir veya daha fazla hücre tipi, genetiği değiştirilmiş hücreler, hasta kaynaklı ksenogreftler ve / veya etiketli hücrelerden oluşan greftleri kolayca kullanabilir. Burada, primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını kemiğe solid tümör greft implantasyonu kullanarak modelleyen bu tekniği gösterdik.

Pozitif bir sonuç, tümör engraftmanı ve zamanla ilerleyici tümör büyümesi ile ilişkili olacaktır. Tümör tipine bağlı olarak, intraosseöz tümör büyümesi ilerleyici arka ekstremite topallığı ile ilişkili olabilir, ancak birçok tümör eşlik eden kemik hastalığı belirtilerine rağmen topallığa neden olmaz. Başarılı engraftman, ileri görüntüleme ile belgelenmiştir, bu sayede ilgilenilen hücre hattının kemik fenotipiyle ilişkili proksimal tibiada progresif radyografik, μBT veya μMRG ...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone at JoVE.com

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Kemik metastazı modellerinde metastaz düzgün bir şekilde veya %100 insidansla gelişmez. Doğrudan intraosseöz tümör hücresi enjeksiyonu akciğerin embolizasyonu ile sonuçlanabilir. Primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını, kemik içine solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleyen, tekrarlanabilir engraftman ve büyümeye yol açan tekniğimizi sunuyoruz.

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

This study allows for flexibility in creating primary bone tumors or bone metastasis by placing solid tumor grafts into bone. This technique is a departure from injecting tumor cell suspensions in the bone. This method overcomes the limitation of tumor cell suspension injections lung emboli.Another advantage is creating a more uniform model when compared to spontaneous bone metastasis or after intravascular cell injection. Based on solid tumor graft implantation, possibilities exist beyond human or mouse models, but the use of patient-derived xenografts which can lead to therapies tailored to specific patients. The primary focus is for use at cancer research such as tumor microenvironment, metastasis, drug discovery, cancer genetics, and precision medicine.Visual demonstration is key to showing the key steps of creating the subcutaneous tumor, dissection and creation of the tumor graft, and surgical implantation into the tibia. For subcutaneous tumor induction, harvest the cell line of interest using an appropriate cell dissociation solution and resuspend the cells at a one to two times 10 to the fifth cells to 100 to 150 microliter sterile PBS concentration. Place the cells on ice.Clean the exposed skin with 70%ethanol, and load the cells into a Tuberculin syringe equipped with a 27 gauge needle. Then inject the cell subcutaneously into a region of disinfected skin that will not be impacted by the movement of the shoulder blades. Use a caliper to monitor the size of the subcutaneous tumor overlying the dorsal thorax or abdomen, and measure the animal's body weight weekly to ensure that the tumor does not ulcerate or that the mouse does not meet early removal criteria as established by the Institutional Animal Care and Use Committee.When the tumor reaches 15 millimeters in any dimension, use 70%ethanol to sterilize the skin and use a 15 scalpel to incise the skin overlying the tumor. Use sterile surgical scissors to dissect the tumor from the surrounding attached soft tissues sharply and place the tumor in one well of a six-well plate containing complete growth medium. Use the scalpel to mince the tumor into appropriately sized fragments and place the fragments into a new container of sterile complete growth medium at room temperature.For cryopreservation, pool multiple fragments in a single cryovial in complete growth medium supplemented with 20%fetal bovine serum and 10%dimethyl sulfoxide and use a commercial cryopreservation system at minus 80 degrees Celsius to gradually freeze the tissue before long-term storage in liquid nitrogen. To preserve tumor fragments for subsequent analysis but not future implantation, snap freeze the samples by liquid nitrogen immersion and store the frozen tumor fragments long term at minus 80 degrees Celsius. For subcutaneous tumor fragment implantation, first bring the tumor fragments suspension to room temperature.Next, confirm a lack of response to pedal reflex in an anesthetized recipient mouse and subcutaneously administer analgesia. To minimize the potential trauma to the skin, use depilating cream to remove the hair on the right knee joint and proximal tibia of the connected hindlimb. Scrub the exposed skin with 70%ethanol, followed by alternating chlorhexidine and saline scrubs.While flexing and extending the joint, visualize the proximal tibia as the region just distal to the knee joint and use a 15 scalpel blade to create a three to four millimeter incision at the level of the proximal tibia on the medial aspect of the limb through the skin and subcutaneous tissue to expose the medial cortex of the proximal tibia. To create a small hole in the medial cortex of the proximal tibia, use the tip of a 25 gauge needle to apply gentle pressure while rotating the tip approximately two millimeters distal to the knee joint and equidistant between the cranial and caudal tibial cortexes. When the hole has been created, use sterile forceps or a 27 to 30 gauge needle to insert a minimum of 0.5 cubed millimeter tumor fragments into the medullary cavity of the proximal tibia and use a 27 to 30 gauge needle to manipulate the tumor fragments into the medullary canal.After placing all the fragments, oppose the skin edges with the appropriate material and return the animal to its cage with monitoring until ambulatory. Then evaluate the tibial tumor growth noninvasively by weekly digital radiography, bioluminescence, or fluorescence imaging, and use calipers to measure the limb at the implantation site. Successful engraftment can be documented with advanced imaging.In this representative analysis, the cortical defect created for tumor graft implantation was visible in the proximal tibia one week after implantation. By week two, visible osteolysis and bone remodeling adjacent to the cortical defect could be observed. From weeks two to five, additional progressive bone destruction and the formation of new bone associated with tumor engraftment and growth occurred.Care should be taken while creating a small hole in the proximal tibia. Rely on rotating the tip with gentle to minimal pressure allowing the needle tip to do the work. Following this procedure, tumor graft placement in other bone sites, placement of organoids or tumor cells in the extracellular matrix into the bone defect or molecular and histologic analysis in addition to imaging can be performed.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Kanser Araştırmaları

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Mikroskopik Kemik Metastazı Verimli ve Seçici Modelleme için intra-iliak arter Enjeksiyon

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Melanoma hücre kaynaklı faktörler çift etkileri kemik iliği adiposit farklılaşması üzerine

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multipl Miyelom kemik iliği Xenografts NOG farelerde Multimodal kollarındaki ve pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi görüntüleme

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Machine Learning Algorithms for Early Detection of Bone Metastases in an Experimental Rat Model

Deneysel Bir Sıçan Modelinde Kemik Metastazlarının Erken Teşhisi İçin Makine Öğrenme Algoritmaları

Machine learning (ML) algorithms permit the integration of different features into a model to perform classification or regression tasks with an accuracy ...

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

Kemik Metastazı Ksenograft Fare Modeli Oluşturmak için İnsan Prostat Kanseri Hücrelerinin İntrakardiyak Enjeksiyonu

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...