Name: quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae
Uploaded: 2020-06-11T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae at JoVE.com

Wir danken dem Instituto Gulbenkian de Ciéncia (IGC) dafür, dass es uns Zugang zu einem Teil der in diesem Protokoll beschriebenen Experimentellen Ausrüstung verschafft hat. Diese Arbeit wurde von der Portugiesischen Stiftung für Wissenschaft und Technologie (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 und La Caixa HR17-00595 an PMD und von einem Australian Research Council Future Fellowship (FT170100259) an CKM unterstützt.

1. Zubereitung der Saccharose-Hefe-Diäten (SY)
<ol><li>Wiegen Sie alle trockenen Zutaten (Agar, Hefe, Saccharose) für die Makronährstoffausgleich und L3-Aufzucht diäten. Die Mengen in Gramm für jeden der Zutaten, die für die Zubereitung von 1 L Lebensmittel benötigt werden, sind in Abbildung 1Bangegeben. HINWEIS: Berücksichtigen Sie, dass ca. 13 ml Lebensmittel benötigt werden, um eine 60-mm-Petrischale zu füllen.</li>
	<li>Lösen Sie alle Zutaten in sterilem destilliertem Was...

<ol>
	<li>Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature of nutrition - a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).</li><li>Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+morphology+with+behavior+during+development:+an+integrative+approach+from+a+fly+perspective.">Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective.</a> Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).</li><li>Steck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+amino+acid+state+modulates+yeast+taste+neurons+to+support+protein+homeostasis+in+Drosophila.">Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila.</a> Elife. 7, 31625 (2018).</li><li>Itskov, P. M., Ribeiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dilemmas+of+the+gourmet+fly:+the+molecular+and+neuronal+mechanisms+of+feeding+and+nutrient+decision+making+in+Drosophila.">The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila.</a> Frontiers in Neuroscience. 7, 12 (2013).</li><li>Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+amino+acids+in+a+dopaminergic+circuitry+promotes+rejection+of+an+incomplete+diet+in+Drosophila.">Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila.</a> Cell. 156 (3), 510-521 (2014).</li><li>Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-acid+imbalance+explains+extension+of+lifespan+by+dietary+restriction+in+Drosophila.">Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila.</a> Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+reproduction+in+Drosophila:+New+insights+from+nutritional+geometry.">Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).</li><li>Levine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+protein+intake+is+associated+with+a+major+reduction+in+IGF-1,+cancer,+and+overall+mortality+in+the+65+and+younger+but+not+older+population.">Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).</li><li>Solon-Biet, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ratio+of+macronutrients,+not+caloric+intake,+dictates+cardiometabolic+health,+aging,+and+longevity+in+ad+libitum-fed+mice.">The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).</li><li>Piper, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li><li>Jones, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+reach+of+the+GAL4/UAS+system+into+the+behavioral+neurobiology+of+Drosophila.">The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila.</a> BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).</li><li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Drosophila+food+intake:+comparative+analysis+of+current+methodology.">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li><li>Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trophic+role+for+serotonin+in+the+development+of+a+simple+feeding+circuit.">A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit.</a> Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).</li><li>Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+drug+screening+in+Drosophila+identifies+the+5HT2A+receptor+as+a+feeding+modulation+target.">Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target.</a> Scientific Reports. 3, (2013).</li><li>Schoofs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+motor+programs+for+suppressing+food+intake+and+inducing+locomotion+in+the+Drosophila+brain.">Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain.</a> PLoS Biology. 12 (6), 1001893 (2014).</li><li>Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+diet+matter?+The+roles+of+larval+and+adult+nutrition+in+regulating+adult+size+traits+in+Drosophila+melanogaster.">When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. , 104051 (2020).</li><li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Jenett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GAL4-driver+line+resource+for+Drosophila+neurobiology.">A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology.</a> Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).</li><li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons.">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+of+Drosophila+courtship+song.">Motor control of Drosophila courtship song.</a> Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).</li><li>Mirth, C. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+intake+and+food+choice+are+altered+by+the+developmental+transition+at+critical+weight+in+Drosophila+melanogaster.">Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).</li><li>Simpson, S. J., Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+the+protein+leverage+hypothesis.">Obesity: the protein leverage hypothesis.</a> Obesity Reviews. 6 (2), 133-142 (2005).</li><li>Raubenheimer, D., Simpson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+models+of+nutrient+balancing:+application+to+insects+and+vertebrates.">Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates.</a> Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).</li><li>Li, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GAL4+driver+resource+for+developmental+and+behavioral+studies+on+the+larval+CNS+of+Drosophila.">A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila.</a> Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).</li><li>Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+larval+feeding+circuit+in+Drosophila.">Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).</li><li>Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+measuring+feeding+rate+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).</li><li>Almeida-Carvalho, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ol1mpiad:+concordance+of+behavioural+faculties+of+stage+1+and+stage+3+Drosophila+larvae.">The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+larvae+make+nutritional+choices+that+minimize+developmental+time.">Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time.</a> Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).</li><li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+food+intake+in+Drosophila.">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+foraging+and+social+behavior+by+the+Drosophila+neuropeptide+Y-like+system.">Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system.</a> Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).</li><li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila.">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li><li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster.">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li></ol>

Mit diesem Protokoll könnte man die Fähigkeit von Larven unter thermogenetischer Aktivierung bestimmter neuronaler Populationen testen, um die Aufnahmevonwerte von Proteinen und Kohlenhydraten, zwei hauptwichtigsten Makronährstoffen, zu regulieren, wenn sie Diäten unterschiedlicher P:C-Zusammensetzung ausgesetzt sind. Diese Methode wurde im Rahmen eines Larven-Vorscreenings getestet, um neuronale Populationen zu identifizieren, die mit der Kontrolle der Nahrungsaufnahme über Diäten unterschiedlicher Makronährstoff...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
Figure 1&#160;was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.

Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Alle Tiere sind auf eine ausgewogene Ernährung angewiesen, um die notwendigen Nährstoffmengen für Überleben, Wachstum und Fortpflanzung zu erhalten1. Die Wahl dessen und wie viel zu essen wird durch eine Vielzahl von interagierenden Faktoren im Zusammenhang mit dem inneren Zustand des Tieres beeinflusst, wie die Sättigungsstufe, und Umweltbedingungen, wie Lebensmittelqualität2,3,4,5. Protein und Kohlenhydrate sind zwei wichtige Makronährstoffe und seine ausgewogene Aufnahme ist wichtig, um die physiologischen Prozesse der Tiere aufrechtzuerhalten. Daher ist das Verständnis der neuronalen Mechanismen, die das Fütterungsverhalten steuern und eine ausgewogene Aufnahme dieser Makronährstoffe aufrechterhalten, äußerst relevant. Dies liegt daran, dass lebensgeschichtliche Merkmale wie Lebensdauer, Fruchtbarkeit und metabolische Gesundheit direkt durch die Mengen der Proteinaufnahme6,7,8,9,10beeinflusst werden.
Die Verwendung einfacherer, haltbarer ergewöhnlicher Erregungsorganismen, die evolutionär konservierte Fütterungsgewohnheiten mit komplexen Tieren, einschließlich Säugetieren, aufweisen, ist für diese Art von Studien von wesentlicher Bedeutung. Wichtig ist, dass diese einfacheren Tiermodelle eine gute Gelegenheit bieten, komplexe biologische Fragen in einem kostspieligen, ethisch und technisch effektiveren Kontext zu sezieren. In den letzten Jahrzehnten war Drosophilamit seinem leistungsstarken genetischen Toolkit, komplizierten und stereotypen Verhalten und konservierter Architektur von peripheren und nährstoffsensorischen Mechanismen mit Säugetieren ein fruchtbares Modell für Verhaltensneurobiologen11. Letztlich besteht die Hoffnung, dass wir durch das Verständnis, wie die Nahrungsaufnahme in diesem Tier mit einem einfacheren Nervensystem reguliert wird, dann beginnen können, neuronale Fehlfunktionen zu entwirren, die menschlichen Essstörungen zugrunde liegen.
Die Untersuchung neuronaler Substrate für das Fütterungsverhalten hängt stark davon ab, dass sie gleichzeitig die Nahrungsaufnahme von Tieren messen können, während sie ihre neuronale Aktivität manipulieren. Aufgrund der minimalen Menge an aufgenommenen Lebensmitteln ist die Quantifizierung der Menge an Lebensmitteln, die von Fliegen gegessen werden, äußerst anspruchsvoll, und alle derzeit verfügbaren Methoden stellen erhebliche Einschränkungen dar. Daher ist der Goldstandard eine Kombination komplementärer Methoden12zu verwenden. Erwachsene Fliegen wurden historisch als genetisches und Verhaltensmodell bevorzugt. Dennoch, Drosophila Larven, bieten auch Möglichkeiten, neuronale Substrate Codierung Fütterung Verhalten zu untersuchen. Das Larven-Zentralnervensystem (ZNS) mit rund 12.000 Neuronen ist deutlich weniger komplex als das des Erwachsenen, der etwa 150.000 Neuronen enthält. Diese geringere Komplexität ist nicht nur numerisch, sondern auch funktional, da Larvenverhalten auf einfacheren Lokomotivfunktionen und sensorischen Systemen beruht. Trotz der scheinbaren Einfachheit ihres Nervensystems, Larven zeigen immer noch vollständige Fütterungsverhalten, und einige Methoden zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Drosophila Larven wurden beschrieben5,13,14,15. Durch die Kombination mit Manipulationen der neuronalen Aktivität, Drosophila Larven können ein hoch gradlierbares Modell für das Verständnis der neuronalen Regulation der Nahrungsaufnahme bilden.
Hier ist ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Larven, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Die Diäten, sogenannte Makronährstoffausgleichsdiäten, unterschieden sich in den Protein- und Kohlenhydratgehalten, insbesondere in Bezug auf die Protein-Kohlenhydrat-Verhältnisse (P:C) Verhältnisse: 1:1 (proteinreiche Ernährung), 1:4 (Zwischenernährung) und 1:16 (proteinarme Ernährung), wie in Abbildung 1Adargestellt. Kurz gesagt, wurde ein quantitativer No-Choice-Fütterungstest mit diesen drei isocalorischen Saccharose-Hefe (SY)-basierten Diäten mit einem blauen Lebensmittelfarbstoff gefärbt etabliert. Da Hefeextrakt und Saccharose als Protein- und Kohlenhydratquellen verwendet wurden und beide Kohlenhydrate enthalten, wurde eine Variation der P:C-Verhältnisse durch Änderung des Gleichgewichts dieser beiden Komponenten, wie zuvor beschrieben16 und wie in Abbildung 1Bangegeben, erreicht. Eine schematische Übersicht über das Protokoll mit den wichtigsten experimentellen Schritten ist in Abbildung 2verfügbar.
Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel erstellt, die Rolle spezifischer neuronaler Populationen bei der Regulierung der Larvenfütterungsspiegel in Diäten unterschiedlicher P:C-Verhältnisse und im Rahmen eines thermogenetischen neuronalen Bildschirms zu untersuchen. Ein gut charakterisiertes neurogenetisches Werkzeug wurde aus der Transienten-Rezeptorpotential (TRP)-Familie verwendet: Drosophila Transient Receptor Potential Channel (dTRPA1), ein Temperatur- und spannungsgebundener Kationenkanal, der das Abfeuern von Aktionspotentialen ermöglicht, wenn Umgebungstemperaturen über 25 °C17steigen. Um die dTRPA1-Transgene auszudrücken, nutzten wir die Gal4-Linien, die auf cis-regulatorischenRegionen aus dem Im Rubin-Labor ansässigen Drosophila-Genom im Rahmen des FlyLight-Projekts am Janelia Research Campus18,19basieren.
Obwohl das Protokoll, hier beschrieben, im Kontext eines Aktivierungsbildschirms eingerichtet wurde, kann es vom Experimentator leicht an andere spezifische Bedürfnisse oder Interessen angepasst werden, nämlich einen Unterdrückungsbildschirm mit dem temperaturempfindlichen neuronalen Schalldämpfer ShibireTS20durchzuführen, alternativ zu dTRPA1. Diese und andere Anpassungen werden in den Protokoll- und Diskussionsabschnitten diskutiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2112px;" width="2113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">1.5 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.690.001</td>
			<td style="width:1272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10xPBS</td>
			<td style="width:271px;">Nytech</td>
			<td style="width:247px;">MB18201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.0 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Greiner Bio-one, Austria</td>
			<td style="width:247px;">628161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96 well microplates</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-204453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bench cooler</td>
			<td style="width:271px;">Nalgene, USA</td>
			<td style="width:247px;">Labtop Cooler 5115-0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Blue food dye</td>
			<td style="width:271px;">Rayner, Billingshurst, UK</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell disruption media</td>
			<td style="width:271px;">Scientific Industries, Inc.</td>
			<td style="width:247px;">888-850-6208</td>
			<td>(0.5 mm glass beads)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dish weight boats</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-201606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Embryo collection cage for 60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td style="width:247px;">FLY1212 (59-100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:271px;">BioQuip Products, USA</td>
			<td style="width:247px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fly food for stocks maintenance</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Forceps #5</td>
			<td style="width:271px;">Dumont</td>
			<td style="width:247px;">0108-5-PS</td>
			<td>Standard tips, INOX, 11cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">LMS Ltd, UK</td>
			<td style="width:247px;">Series 2, Model 230</td>
			<td>For thermogenetic feeding assay (30&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">Percival Scientific, USA</td>
			<td style="width:247px;">DR36NL</td>
			<td>To stage larvae (19&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Janelia lines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Detailed information in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Macronutrient balancing diets</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Methanol</td>
			<td style="width:271px;">VWR</td>
			<td style="width:247px;">CAS number: 67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:271px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:247px;">H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrile gloves</td>
			<td style="width:271px;">VWR, USA</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:271px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:247px;">5804 R / Serial number: 5805CI364293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Rubin Gal4 ines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ShibireTS UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 66600</td>
			<td>Provided by Carlos Ribeiro Group</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Soft brushes</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>For sorting anaesthetised fruit flies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Spectrophotometer plate reader</td>
			<td style="width:271px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:247px;">Multiskan Go 51119300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:271px;">Nikon</td>
			<td style="width:247px;">1016625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sucrose</td>
			<td style="width:271px;">Sidul, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Third-instar larvae (L3) rearing diet</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Timer</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tissue lyzer / bead beater</td>
			<td style="width:271px;">MP Biomedicals, USA</td>
			<td style="width:247px;">FastPrep-24 6004500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TRPA1 UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 26264</td>
			<td>Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 &#8728;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath</td>
			<td style="width:271px;">Sheldon Manufacturing Inc., USA</td>
			<td style="width:247px;">W20M-2 / 03068308 / 9021195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>51% Protein, 15% Carbohydrate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae

Futter- und Fütterungsverhalten ermöglichen es Tieren, auf Energiequellen und Nährstoffe zuzugreifen, die für ihre Entwicklung, Gesundheit und Fitness unerlässlich sind. Die Untersuchung der neuronalen Regulation dieser Verhaltensweisen ist für das Verständnis der physiologischen und molekularen Mechanismen, die der Ernährungshomöostase zugrunde liegen, von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung genetisch bestückbarer Tiermodelle wie Würmer, Fliegen und Fische erleichtert diese Art von Studien erheblich. In den letzten zehn Jahren wurde die Fruchtfliege Drosophila melanogaster von Neurobiologen als mächtiges Tiermodell verwendet, die die neuronale Kontrolle von Fütterungs- und Futterverhalten untersuchen. Obwohl zweifellos wertvoll, untersuchen die meisten Studien erwachsene Fliegen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das einfachere Larvennervensystem nutzt, um neuronale Substrate zu untersuchen, die das Fütterungsverhalten kontrollieren, wenn Larven Diäten ausgesetzt sind, die sich in ihrem Protein- und Kohlenhydratgehalt unterscheiden. Unsere Methoden basieren auf einem quantitativen kolorimetrischen No-Choice-Fütterungstest, der im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Aktivierungsbildschirms durchgeführt wird. Als Auslese wurde die Menge an Lebensmitteln, die von Larven über ein Intervall von 1 h gegessen wurden, verwendet, wenn sie einer der drei mit Farbstoffen gekennzeichneten Diäten ausgesetzt wurde, die sich in ihrem Protein-Zu-Kohlenhydrat-Verhältnis (P:C) unterscheiden. Die Wirksamkeit dieses Protokolls wird im Kontext eines neurogenetischen Bildschirms bei Larven Drosophilademonstriert, indem kandidaten neuronale Populationen identifiziert werden, die die Menge der Nahrung regulieren, die in Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität gegessen wird. Wir waren auch in der Lage, die getesteten Genotypen in phänotypische Klassen zu klassifizieren und zu gruppieren. Neben einem kurzen Überblick über die derzeit verfügbaren Methoden in der Literatur werden die Vorteile und Grenzen dieser Methoden diskutiert und es werden auch einige Vorschläge gemacht, wie dieses Protokoll an andere spezifische Experimente angepasst werden könnte.

Drosophila-Larven regulieren ihre Proteinzufuhr auf Kosten der Einnahme überschüssiger Kohlenhydrate23 (schematische Darstellung in Abbildung 2E). Tatsächlich wurde diese Priorisierung der Proteinzufuhr bei vielen anderen Tieren beobachtet und wird als Protein-Hebel24,25bezeichnet.
Unter Ausnutzung dieser robusten Fütterungsverhaltensreaktion wurde ein verhaltensbasiert...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae at JoVE.com

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Beschrieben hier ist ein Protokoll, das die kolorimetrische Quantifizierung der Menge der Nahrung ermöglicht, die innerhalb eines definierten Zeitintervalls von Drosophila melanogaster Larven gegessen wird, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Diese Assays werden im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Bildschirms durchgeführt.

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Gepaart Nanoinjection und Elektrophysiologie-Test zum Screening auf Bioaktivität der Verbindungen unter Verwendung des Drosophila melanogaster Riesen-Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Forschung

Neurowissenschaften

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

Die kapillare feeder Assay misst die Nahrungsaufnahme in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...