Name: quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae
Uploaded: 2020-06-11T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae at JoVE.com

ברצוננו להודות למכון גולבנקיאן דה סינסיה (IGC) על שסיפק לנו גישה לחלק מהציוד הניסיוני המתואר בפרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 ולה Caixa HR17-00595 ל PMD ועל ידי מלגת מחקר עתידית של מועצת המחקר האוסטרלית (FT170100259) ל- CKM.

1. הכנת דיאטות סוכרוז-שמרים (SY)
<ol><li>שוקלים את כל החומרים היבשים (אגר, שמרים, סוכרוז) עבור איזון macronutrient ודיאטות גידול L3. הכמויות בגרמים עבור כל אחד מהמרכיבים הדרושים להכנת 1 L של מזון מסומנות באיור 1B. הערה: יש לקחת בחשבון כי כ 13 מ"ל של מזון יש צורך למלא צלחת פטרי 60 מ"מ.</li>
	<li>ממיס...

<ol>
	<li>Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature of nutrition - a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).</li><li>Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+morphology+with+behavior+during+development:+an+integrative+approach+from+a+fly+perspective.">Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective.</a> Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).</li><li>Steck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+amino+acid+state+modulates+yeast+taste+neurons+to+support+protein+homeostasis+in+Drosophila.">Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila.</a> Elife. 7, 31625 (2018).</li><li>Itskov, P. M., Ribeiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dilemmas+of+the+gourmet+fly:+the+molecular+and+neuronal+mechanisms+of+feeding+and+nutrient+decision+making+in+Drosophila.">The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila.</a> Frontiers in Neuroscience. 7, 12 (2013).</li><li>Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+amino+acids+in+a+dopaminergic+circuitry+promotes+rejection+of+an+incomplete+diet+in+Drosophila.">Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila.</a> Cell. 156 (3), 510-521 (2014).</li><li>Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-acid+imbalance+explains+extension+of+lifespan+by+dietary+restriction+in+Drosophila.">Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila.</a> Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+reproduction+in+Drosophila:+New+insights+from+nutritional+geometry.">Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).</li><li>Levine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+protein+intake+is+associated+with+a+major+reduction+in+IGF-1,+cancer,+and+overall+mortality+in+the+65+and+younger+but+not+older+population.">Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).</li><li>Solon-Biet, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ratio+of+macronutrients,+not+caloric+intake,+dictates+cardiometabolic+health,+aging,+and+longevity+in+ad+libitum-fed+mice.">The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).</li><li>Piper, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li><li>Jones, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+reach+of+the+GAL4/UAS+system+into+the+behavioral+neurobiology+of+Drosophila.">The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila.</a> BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).</li><li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Drosophila+food+intake:+comparative+analysis+of+current+methodology.">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li><li>Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trophic+role+for+serotonin+in+the+development+of+a+simple+feeding+circuit.">A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit.</a> Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).</li><li>Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+drug+screening+in+Drosophila+identifies+the+5HT2A+receptor+as+a+feeding+modulation+target.">Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target.</a> Scientific Reports. 3, (2013).</li><li>Schoofs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+motor+programs+for+suppressing+food+intake+and+inducing+locomotion+in+the+Drosophila+brain.">Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain.</a> PLoS Biology. 12 (6), 1001893 (2014).</li><li>Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+diet+matter?+The+roles+of+larval+and+adult+nutrition+in+regulating+adult+size+traits+in+Drosophila+melanogaster.">When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. , 104051 (2020).</li><li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Jenett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GAL4-driver+line+resource+for+Drosophila+neurobiology.">A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology.</a> Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).</li><li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons.">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+of+Drosophila+courtship+song.">Motor control of Drosophila courtship song.</a> Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).</li><li>Mirth, C. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+intake+and+food+choice+are+altered+by+the+developmental+transition+at+critical+weight+in+Drosophila+melanogaster.">Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).</li><li>Simpson, S. J., Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+the+protein+leverage+hypothesis.">Obesity: the protein leverage hypothesis.</a> Obesity Reviews. 6 (2), 133-142 (2005).</li><li>Raubenheimer, D., Simpson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+models+of+nutrient+balancing:+application+to+insects+and+vertebrates.">Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates.</a> Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).</li><li>Li, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GAL4+driver+resource+for+developmental+and+behavioral+studies+on+the+larval+CNS+of+Drosophila.">A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila.</a> Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).</li><li>Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+larval+feeding+circuit+in+Drosophila.">Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).</li><li>Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+measuring+feeding+rate+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).</li><li>Almeida-Carvalho, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ol1mpiad:+concordance+of+behavioural+faculties+of+stage+1+and+stage+3+Drosophila+larvae.">The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+larvae+make+nutritional+choices+that+minimize+developmental+time.">Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time.</a> Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).</li><li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+food+intake+in+Drosophila.">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+foraging+and+social+behavior+by+the+Drosophila+neuropeptide+Y-like+system.">Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system.</a> Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).</li><li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila.">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li><li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster.">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li></ol>

עם פרוטוקול זה, ניתן לבדוק את היכולת של זחלים תחת התרמוגנטית-הפעלה של אוכלוסיות עצביות ספציפיות כדי לווסת את רמות צריכת החלבון והפחמימות, שני macronutrients העיקריים, כאשר נחשפים דיאטות של הרכב P:C שונים. שיטה זו נבדקה בהקשר של הקרנה ראשונית של הזחל שמטרתה לזהות אוכלוסיות עצביות הקשורות לשליטה בצ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
Figure 1&#160;was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.

Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

כל בעלי החיים תלויים בתנור תזונה מאוזנת כדי לרכוש את הכמויות הדרושות של חומרים מזינים להישרדות, צמיחה, רבייה1. הבחירה של מה וכמה לאכול מושפעת ממספר רב של גורמים אינטראקציה הקשורים למצב הפנימי של החיה, כמו רמת השובע, ותנאים סביבתיים, כגון איכות המזון2,3,4,5. חלבונים ופחמימות הם שני מקרונוטריאנטים עיקריים והצריכה המאוזנת שלה חיונית כדי לקיים תהליכים פיזיולוגיים של בעלי חיים. לכן, ההבנה של המנגנונים העצביים השולטים בהתנהגויות האכלה ושמירה על צריכה מאוזנת של מקרונוטריאנטים אלה רלוונטית ביותר. הסיבה לכך היא שתכונות היסטוריית החיים כמו תוחלת חיים, פוריות ובריאות מטבולית מושפעות ישירות מרמות צריכת החלבון6,7,8,9,10.
השימוש באורגניזמים פשוטים יותר הניתנים למתיחה, המציגים הרגלי האכלה שמורים מבחינה אבולוציונית עם בעלי חיים מורכבים, כולל יונקים, חיוני למחקרים מסוג זה. חשוב לציין, מודלים פשוטים אלה של בעלי חיים מספקים הזדמנות טובה לנתח שאלות ביולוגיות מורכבות בהקשר יקר, אתי ויעיל יותר מבחינה טכנית. בעשורים האחרונים, Drosophila, עם ערכת הכלים הגנטית רבת העוצמה שלה, התנהגות מורכבת וסטריאוטיפית וארכיטקטורה שמורה של מנגנוני חישה היקפיים וחומרים מזינים עם יונקים, היה מודל פורה לנוירוביולוגים התנהגותיים11. בסופו של דבר, התקווה היא כי על ידי הבנת איך צריכת המזון מוסדר בבעלי חיים אלה, עם מערכת עצבים פשוטה יותר, אז אנחנו יכולים להתחיל להתיר תקלות עצביות ביסוד הפרעות אכילה אנושיות.
המחקר של מצעים עצביים להתנהגויות האכלה תלוי עמוק ביכולת למדוד בו זמנית את צריכת המזון של בעלי חיים תוך מניפולציה של הפעילות העצבית שלהם. בשל כמויות המזון המינימליות שנבלעו, כימות כמות המזון הנאכלת על ידי זבובים הוא מאתגר ביותר, וכל השיטות הזמינות כיום מציבות מגבלות משמעותיות. לכן, תקן הזהב הוא להשתמש בשילוב של מתודולוגיות משלימות12. זבובים בוגרים זכו להעדפה היסטורית כמודל גנטי והתנהגותי. אף על פי כן, זחלים Drosophila, גם להציע הזדמנויות לחקור מצעים עצביים קידוד התנהגות האכלה. מערכת העצבים המרכזית הזחל (CNS), עם כ 12,000 נוירונים, הוא משמעותית פחות מורכב מזה של המבוגר, אשר מכיל כ 150,000 נוירונים. מורכבות נמוכה זו היא לא רק מספרית אלא גם פונקציונלית, שכן התנהגויות הזחל מסתמכות על פונקציות קטר פשוטות יותר ומערכות חושיות. למרות הפשטות לכאורה של מערכות העצבים שלהם, זחלים עדיין להפגין התנהגויות האכלה מלאה, וכמה שיטות לכמת בליעה מזון בזחלים Drosophila תוארו5,13,14,15. על ידי זיווג עם מניפולציות של פעילות עצבית, זחלים Drosophila יכול להוות מודל מאוד נוח להבנת הרגולציה העצבית של צריכת המזון.
בתנאי שלהלן פרוטוקול מפורט לכימות צריכת המזון בזחלים החשופים לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. הדיאטות, מה שמכונה דיאטות איזון macronutrient, היו שונות בתכולת החלבון והפחמימות, במיוחד ביחס בין החלבון לפחמימות (P:C): 1:1 (תזונה עשירה בחלבון), 1:4 (דיאטת ביניים) ו- 1:16 (תזונה לקויה בחלבון), כפי שמוצג באיור 1A. בקצרה, בדיקה כמותית ללא ברירה האכלה הוקמה באמצעות אלה שלוש דיאטות סוכרוז-שמרים isocaloric (SY)מבוסס צבוע עם צבע מזון כחול. מכיוון שתמצית שמרים וסוקרוז שימשו כמקורות חלבון ופחמימות, ושניהם מכילים פחמימות, השונות ביחסי P:C הושגה על ידי שינוי האיזון בין שני מרכיבים אלה, כפי שתואר קודם לכן16 וכפי שצוין באיור 1B. סקירה סכמטית של הפרוטוקול, המציגה את שלבי הניסוי העיקריים, זמינה באיור 2.
פרוטוקול זה הוקם במטרה לחקור את תפקידן של אוכלוסיות עצביות ספציפיות על ויסות רמות האכלת הזחלים בדיאטות של יחסי P:C שונים ובהקשר של מסך עצבי תרמוגנטי. כלי נוירוגנטי מאופיין היטב שימש ממשפחת פוטנציאל הקולטן הארעי (TRP): Drosophila חולף קולטן פוטנציאל ערוץ (dTRPA1), שהוא ערוץ קטיון טמפרטורה ומתח מגודר, המאפשר ירי של פוטנציאל פעולה כאשר טמפרטורות הסביבה לעלות מעל 25 °C17. כדי לבטא את טרנסג'ין dTRPA1, ניצלנו את קווי Gal4 המבוססים על אזורים רגולטורייםמן הגנום Drosophila, שהוקם במעבדת רובין, בהקשר של פרויקט FlyLight בקמפוס המחקר Janelia18,19.
למרות הפרוטוקול, כאן מתואר, נקבע בהקשר של מסך הפעלה, זה יכול להיות מותאם בקלות על ידי הנסיין לצרכים ספציפיים אחרים או תחומי עניין, כלומר לבצע מסך דיכוי באמצעות משתיק עצבים רגיש לטמפרטורה ShibireTS20, חלופה dTRPA1. התאמה זו והסתגלויות אחרות נידונות בסעיפי הפרוטוקול והדיון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2112px;" width="2113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">1.5 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.690.001</td>
			<td style="width:1272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10xPBS</td>
			<td style="width:271px;">Nytech</td>
			<td style="width:247px;">MB18201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.0 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Greiner Bio-one, Austria</td>
			<td style="width:247px;">628161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96 well microplates</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-204453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bench cooler</td>
			<td style="width:271px;">Nalgene, USA</td>
			<td style="width:247px;">Labtop Cooler 5115-0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Blue food dye</td>
			<td style="width:271px;">Rayner, Billingshurst, UK</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell disruption media</td>
			<td style="width:271px;">Scientific Industries, Inc.</td>
			<td style="width:247px;">888-850-6208</td>
			<td>(0.5 mm glass beads)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dish weight boats</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-201606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Embryo collection cage for 60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td style="width:247px;">FLY1212 (59-100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:271px;">BioQuip Products, USA</td>
			<td style="width:247px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fly food for stocks maintenance</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Forceps #5</td>
			<td style="width:271px;">Dumont</td>
			<td style="width:247px;">0108-5-PS</td>
			<td>Standard tips, INOX, 11cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">LMS Ltd, UK</td>
			<td style="width:247px;">Series 2, Model 230</td>
			<td>For thermogenetic feeding assay (30&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">Percival Scientific, USA</td>
			<td style="width:247px;">DR36NL</td>
			<td>To stage larvae (19&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Janelia lines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Detailed information in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Macronutrient balancing diets</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Methanol</td>
			<td style="width:271px;">VWR</td>
			<td style="width:247px;">CAS number: 67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:271px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:247px;">H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrile gloves</td>
			<td style="width:271px;">VWR, USA</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:271px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:247px;">5804 R / Serial number: 5805CI364293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Rubin Gal4 ines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ShibireTS UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 66600</td>
			<td>Provided by Carlos Ribeiro Group</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Soft brushes</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>For sorting anaesthetised fruit flies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Spectrophotometer plate reader</td>
			<td style="width:271px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:247px;">Multiskan Go 51119300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:271px;">Nikon</td>
			<td style="width:247px;">1016625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sucrose</td>
			<td style="width:271px;">Sidul, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Third-instar larvae (L3) rearing diet</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Timer</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tissue lyzer / bead beater</td>
			<td style="width:271px;">MP Biomedicals, USA</td>
			<td style="width:247px;">FastPrep-24 6004500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TRPA1 UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 26264</td>
			<td>Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 &#8728;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath</td>
			<td style="width:271px;">Sheldon Manufacturing Inc., USA</td>
			<td style="width:247px;">W20M-2 / 03068308 / 9021195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>51% Protein, 15% Carbohydrate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae

התנהגויות ליקוט והאכלה מאפשרות לבעלי חיים לגשת למקורות אנרגיה וחומרים מזינים החיוניים להתפתחותם, לבריאותם ולכשירותם. חקירת הרגולציה העצבית של התנהגויות אלה חיונית להבנת המנגנונים הפיזיולוגיים והמולקולריים שבבסיס הומאוסטזיס תזונתי. השימוש במודלים גנטיים של בעלי חיים כגון תולעים, זבובים ודגים מקל מאוד על מחקרים מסוג זה. בעשור האחרון, זבוב הפירות Drosophila melanogaster שימש כמודל בעל חיים רב עוצמה על ידי נוירוביולוגים החוקרים את השליטה העצבית של התנהגויות האכלה וליקוט. אמנם ללא ספק בעל ערך, רוב המחקרים בוחנים זבובים בוגרים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המנצל את מערכת העצבים הזחלית הפשוטה יותר כדי לחקור מצעים עצביים השולטים בהתנהגויות האכלה כאשר הזחלים נחשפים לדיאטות שונות בתכולת החלבון והפחמימות שלהם. השיטות שלנו מבוססות על בדיקת האכלה כמותית של צבעים ללא ברירה, המבוצעת בהקשר של מסך הפעלה תרמוגנטית עצבית. כקריאה, כמות המזון שנאכל על ידי זחלים על פני מרווח זמן של 1 שעות שימשה כאשר נחשפה לאחת משלוש דיאטות עם תווית צבע השונות בחלבון שלהם ליחסי פחמימות (P:C). היעילות של פרוטוקול זה מודגמת בהקשר של מסך נוירוגנטי בזחל Drosophila, על ידי זיהוי אוכלוסיות עצביות מועמד המסדיר את כמות המזון שנאכל דיאטות באיכות macronutrient שונים. הצלחנו גם לסווג ולקבץ את הגנוטיפים שנבדקו לשיעורי פנוטיפים. מלבד סקירה קצרה של השיטות הזמינות כיום בספרות, היתרונות והמגבלות של שיטות אלה נדונים, כמו כן, כמה הצעות ניתנות על איך פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לניסויים ספציפיים אחרים.

זחלי דרוזופילה מווסתים את צריכת החלבון שלהם במחיר בליעת פחמימות עודפות23 (עלילה סכמטית באיור 2E). למעשה, תעדוף זה של צריכת חלבון נצפתה בבעלי חיים רבים אחרים והוא נקרא מינוף החלבון24,25.
תוך ניצול התגובה ההתנהגות?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae at JoVE.com

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

להלן פרוטוקול המאפשר כימות צבעוני של כמות המזון הנאכל בתוך פרק זמן מוגדר על ידי זחלי מלנוגאסטר דרוזופילה שנחשפו לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. מבחנים אלה מתבצעים בהקשר של מסך תרמוגנטי עצבי.

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Nanoinjection לזווג ו Assay Electrophysiology למסך עבור bioactivity של תרכובות באמצעות תסיסנית melanogaster סיבים הענק מערכת

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

כימות של תסיסנית התנהגות Grooming

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...