Name: optogenetic activation of afferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics
Uploaded: 2020-07-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics at JoVE.com

המחברים מודים לבריאן קראוזה על התמיכה הטכנית וההדרכה בפרויקט זה.
עבודה זו נתמכה על ידי החברה הבינלאומית לחקר הרדמה (IMRA to AR), המכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM109086 ל- MIB), והמחלקה להרדמה, בית הספר לרפואה ובריאות הציבור, אוניברסיטת ויסקונסין, מדיסון, WI, ארה"ב.

כל ההליכים המערבים בעלי חיים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון והוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים לבריאות הציבור.
1. גידול עכברים לביטוי חלבון מדווח פלואורסצנטי בתת-אוכלוסיות בין-כוכביות
<ol><li>זוג עכבר זכר הומוזיוגי, תלוי CreTomato...

<ol>
	<li>Baumgart, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+inhibits+synaptic+vesicle+exocytosis+through+reduced+Ca2++influx,+not+Ca2+-exocytosis+coupling.">Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).</li><li>Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+inhibits+the+neurotransmitter+release+machinery.">Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery.</a> Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+anesthetics+with+neurotransmitter+release+machinery+proteins.">Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins.</a> Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).</li><li>Crick, F., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+consciousness.">A framework for consciousness.</a> Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).</li><li>Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+correlates+of+consciousness:+progress+and+problems.">Neural correlates of consciousness: progress and problems.</a> Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+approaches+to+conscious+processing.">Experimental and theoretical approaches to conscious processing.</a> Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).</li><li>Friston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theory+of+cortical+responses.">A theory of cortical responses.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).</li><li>Mashour, G. A., Hudetz, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+and+Top-Down+Mechanisms+of+General+Anesthetics+Modulate+Different+Dimensions+of+Consciousness.">Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).</li><li>Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Effects+of+General+Anesthetics+on+Cortical+Network+Activity+Using+Ex+Vivo+Preparations.">Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations.</a> Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Redinbaugh, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamus+Modulates+Consciousness+Via+Layer-Specific+Control+of+Cortex.">Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex.</a> Neuron. 105 (4), 0896 (2020).</li><li>Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REBUS+and+the+Anarchic+Brain:+Toward+a+Unified+Model+of+the+Brain+Action+of+Psychedelics.">REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics.</a> Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).</li><li>Mak-McCully, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+cortical+and+thalamic+activity+during+non-REM+sleep+in+humans.">Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans.</a> Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).</li><li>Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consciousness+and+anesthesia.">Consciousness and anesthesia.</a> Science. 322 (5903), 876-880 (2008).</li><li>Sanders, R. D., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenergic+trespass+in+anesthetic+and+sedative+states.">Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states.</a> Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).</li><li>Hemmings, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+Comprehensive+Understanding+of+Anesthetic+Mechanisms+of+Action:+A+Decade+of+Discovery.">Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).</li><li>Nourski, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+Predictive+Coding+across+Awareness+States+under+Anesthesia:+An+Intracranial+Electrophysiology+Study.">Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study.</a> Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propofol+disrupts+functional+interactions+between+sensory+and+high-order+processing+of+auditory+verbal+memory.">Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory.</a> Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).</li><li>Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+cortical+network+activity+by+the+general+anesthetic+isoflurane.">Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane.</a> British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).</li><li>Lee, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+frontal-parietal+communication+by+ketamine,+propofol,+and+sevoflurane.">Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane.</a> Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).</li><li>Ferrarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+in+cortical+effective+connectivity+during+midazolam-induced+loss+of+consciousness.">Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).</li><li>Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+inhibition+of+frontal-to-parietal+feedback+connectivity+is+a+neurophysiologic+correlate+of+general+anesthesia+in+surgical+patients.">Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients.</a> PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Properties+in+Transitions+of+Consciousness+during+Propofol-induced+Sedation.">Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).</li><li>Murphy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propofol+anesthesia+and+sleep:+a+high-density+EEG+study.">Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study.</a> Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).</li><li>Murphy, C., Krause, B., Banks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+isoflurane+on+cortico-cortical+feedback+afferent+responses+in+murine+non-primary+neocortex.">Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex.</a> British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).</li><li>Raz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+effect+of+isoflurane+on+top-down+versus+bottom-up+pathways+in+sensory+cortex.">Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex.</a> Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).</li><li>Schrouff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+functional+integration+decreases+during+propofol-induced+loss+of+consciousness.">Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness.</a> Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-Specific+Feedforward+Circuits+between+Thalamus+and+Neocortex+Revealed+by+Selective+Optical+Stimulation+of+Axons.">Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li><li>Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+diffusion+and+partition+coefficients+of+propofol+in+rat+brain+tissue:+implications+for+studies+of+drug+action+in+vitro.">Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro.</a> BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).</li><li>Benkwitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+EC50+amnesic+concentration+of+etomidate+and+its+diffusion+profile+in+brain+tissue:+implications+for+in+vitro+studies.">Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies.</a> Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).</li><li>Franks, N. P., Lieb, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+actions+of+volatile+general+anaesthetics+at+molecular+and+cellular+levels.">Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels.</a> British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).</li><li>Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+coefficients+of+volatile+anesthetics+in+aqueous+electrolyte+solutions+at+various+temperatures.">Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures.</a> Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).</li><li>Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Lin, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+channelrhodopsin+variants:+features,+limitations+and+future+developments.">A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments.</a> Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).</li><li>Banks, M. I., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+actions+of+volatile+anesthetics+on+GABAA+IPSCs:+dissociation+of+blocking+and+prolonging+effects.">Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects.</a> Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).</li><li>Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+measures+of+volatile+anesthetics+in+the+aqueous+phase+using+calcium+sensitive+electrodes.">Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).</li></ol>

בכתב יד זה מתואר פרוטוקול להערכת תגובות תוך-תאיות וחוץ-תאיות למסלולים אפרנטיים המופעלים באופן סלקטיבי בפרוסות מוח ex vivo.
השימוש בכלים אופטוגנטיים ובשיטות הקלטה מקבילות מאפשר לחוקרים לחקור תגובות של אוכלוסיות מקומיות לתשומות מאזורי מוח מרוחקים, תוך הקלטה בו-זמנית מאוכלוסי?...

חומרי הרדמה נדיפים נמצאים בשימוש בכל מקום במגוון מסגרות קליניות ואקדמיות במשך יותר ממאה שנה. לסוגים שונים של חומרי הרדמה יש מטרות מולקולריות ייחודיות, לעתים קרובות לא חופפות 1,2,3, אך כמעט כולן מייצרות חוסר הכרה. בעוד שההשפעות ההתנהגותיות שלהם צפויות למדי, המנגנונים שבאמצעותם חומרי הרדמה גורמים לאובדן הכרה אינם ידועים במידה רבה. הרדמה עשויה בסופו של דבר להשפיע הן על רמת התודעה והן על תכניה באמצעות פעולות על מעגלים קורטיקותלמיים, ולשבש את שילוב המידע לאורך ההיררכיה הקורטיקלית 4,5,6,7,8,9. באופן רחב יותר, אפנון של מעגלים קורטיקותלמיים עשוי למלא תפקיד בניסוי 10 אופרמקולוגית 11 מצבי תודעה משתנים, ועשוי להיות מעורב גם בשינה 12 ובהפרעות פתופיזיולוגיות של תודעה13,14.
את החמקמקות של המנגנונים העומדים בבסיס אובדן והחזרת ההכרה במהלך ההרדמה ניתן לייחס באופן חלקי לפעולות לא ליניאריות וסינרגטיות של חומרי הרדמה ברמה התאית, הרשת והמערכות15. איזופלוראן, למשל, מדכא פעילות באזורי המוח שנבחרו 16,17,18, פוגע בקישוריות בין אזורי מוח מרוחקים 19,20,21,22,23, ומפחית תגובות סינפטיות באופן ספציפי למסלול 24,25 . עדיין לא ברור אילו השפעות של חומרי הרדמה, מהרמה המולקולרית ועד לרמה המערכתית, הכרחיות או מספיקות כדי לגרום לאובדן הכרה. בנוסף למחקרים קליניים מהותיים של התודעה תוך שימוש בטכניקות לא פולשניות 19,20,26, חשוב שהנסיינים יבקשו לנטרל את האינטראקציות התאיות והרשתיות המובחנות המשרתות את החוויה המודעת.
על ידי פישוט האינטראקציות המורכבות שנמצאות במוח השלם, פרוסות המוח ex vivo מאפשרות לחקור מרכיבים מבודדים של המערכות הדינמיות של המוח9. הכנת פרוסה מופחתת משלבת את היתרונות של מבנים אנטומיים שלמים יחסית של מעגלים עצביים מקומיים עם הרבגוניות של מניפולציות במבחנה. עם זאת, עד לאחרונה, אילוצים מתודולוגיים מנעו את חקר התכונות הסינפטיות והמעגלים של קלטים ארוכי טווח בפרוסות מוח27,28; הנתיב המפותל של דרכי סיבים קורטיקותלמיים הפך את ההפעלה של מסלולים אפירניים עצמאיים לבלתי אפשרית על ידי גירוי חשמלי.
חקירת ההשפעות של חומרי הרדמה על תכשירי פרוסות המוח מציבה אתגרים נוספים. בהיעדר מערכת נשימה ומחזור דם תקינה, יש למרוח חומרי הרדמה באמבטיה, ולהתאים את הריכוזים בקפידה לריכוזי ההשפעה המשוערים באתר. עבור חומרי הרדמה תוך ורידיים רבים, קצב שיווי המשקל האיטי ברקמה הופך את החקירות הפרמקולוגיות המסורתיות למייגעותשל 29,30. חקירת ההשפעות של הרדמת גזים נדיפים בתכשירי ex vivo היא נוחה יותר, אך גם מציבה אתגרים. אלה כוללים המרת מינוני לחץ חלקי בשאיפה לריכוזים מימיים, ואת הצורך במערכת אספקה שונה של התרופה לרקמה באמצעות נוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי31.
כאן מתוארות שיטות שבאמצעותן חוקרים יכולים לנצל את התכונות הפיסיקוכימיות המתועדות היטב של איזופלורן ההרדמה הנדיף להעברת תרופות לפרוסות מוח ex vivo, להפעיל קלטים ספציפיים למסלול ולשכבה לאזור עניין בקליפת המוח עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה, ולבצע הקלטות למינריות בו-זמניות והקלטות מהדקי טלאים ממוקדות מאוכלוסיות נבחרות של נוירונים. יחד, נהלים אלה מאפשרים לחוקרים למדוד שינויים הנגרמים על ידי הרדמה נדיפה במספר תכונות תגובה אלקטרופיזיולוגיות נצפות, מרמת הסינפטית ועד לרמת הרשת המקומית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5x broadfield objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPLFLN2.5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water immersion objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2/5% CO2 mixture</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z02OX95R2003045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A16 probe</td>
			<td>NeuroNexus</td>
			<td>A16x1-2mm-100-177-A16</td>
			<td>16-channel probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP</td>
			<td>Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic gas monitor (POET II)</td>
			<td>Criticare</td>
			<td>602-3A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, Magnesium Salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007914</td>
			<td>Cre-dependent tdTomato mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>008069</td>
			<td>PV-Cre mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Shaker</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210H86-TS</td>
			<td>for equilibration of sealed gas bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Generic brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Generic brand</td>
			<td></td>
			<td>for silver chloriding patch clamp electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivicaine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSC20010</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass (patch clamp recordings)</td>
			<td>King Precision Glass, Inc.</td>
			<td>KG-33</td>
			<td>Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass (viral injections)</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td>3.5&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control of junior micromanipulator</td>
			<td>Luigs and Neumann</td>
			<td>SM8</td>
			<td>for control of junior micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control of manipulators and shifting table</td>
			<td>Luigs and Neumann</td>
			<td>SM7</td>
			<td>for control of multichannel electrode and shifting table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A + Clampex 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1440A</td>
			<td>Digitizer and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-3603 tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14171208</td>
			<td>for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSE57060</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERP-27 EEG Reference/Patch Panel</td>
			<td>Neuralynx</td>
			<td>Retired</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filling needle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>50821912</td>
			<td>for filling patch clamp pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube for imaging EYFP</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-MRFPHQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09801E</td>
			<td>lay over slice template during preparation of tissue block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>2.5x2.5 Box filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas dispersion tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3953312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe (100 mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z314390</td>
			<td>for filling gas-sealed bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSG37020</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSG32040</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP, Sodium Salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage-probe adaptor</td>
			<td>NeuroNexus</td>
			<td>A16-OM16</td>
			<td>adaptor to connect 16-channel probe to headstage input</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>76192-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSH75030</td>
			<td>ACSF,intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-16 Headstage</td>
			<td>Neuralynx</td>
			<td>Retired</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (70%)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>101223-746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junior micromanipulator</td>
			<td>Luigs and Neumann</td>
			<td>210-100 000 0090-R</td>
			<td>for manipulation of patch clamp electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Light Source Control Module</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>BLS-PL02_US</td>
			<td>optogenetic light source control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lynx-8 Amplifier</td>
			<td>Neuralynx</td>
			<td>Retired</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lynx-8 Power Supply</td>
			<td>Neuralynx</td>
			<td>Retired</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSM24300</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry, Texas Red filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>for imaging tdTomato fluorescent reporter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9044962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Generic brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700A</td>
			<td>Molecular Devices/Axon Instruments</td>
			<td>700A</td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen (for air table)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>501460083</td>
			<td>stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon, cut from pantyhose</td>
			<td>Generic brand</td>
			<td></td>
			<td>small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1697520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>307</td>
			<td>For transferring tissue to rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BT124000</td>
			<td>2 cm, flattened, to make platinum harp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polygon400</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>DSI-E-0470-0617-000</td>
			<td>optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSP41000</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSP41200</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire blade (for vibratome)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>100492-502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-361445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealed gas bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>109236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shifting table for microscope</td>
			<td>Luigs and Neumann</td>
			<td>380FMU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (HCO3-)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSS22060</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSS23020</td>
			<td>ACSF, intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013044</td>
			<td>SOM-Cre mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 902</td>
			<td>Dual Small Animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Staples</td>
			<td>886833</td>
			<td>to fix tissue block to specimen stage during slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drill</td>
			<td>RAM Products Inc.</td>
			<td>DIGITALMICROTORQUE</td>
			<td>Microtorque II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL) with LuerLock tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>309628</td>
			<td>for application of pressure during patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL) with slip tip</td>
			<td>WW Grainger, Inc.</td>
			<td>19G384</td>
			<td>for filling patch clamp pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>66064-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wypall towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-042-427</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic activation of afferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics

חומרי הרדמה משפיעים על התודעה בין השאר באמצעות פעולותיהם על מעגלים תלמוקורטיים. עם זאת, המידה שבה חומרי הרדמה נדיפים משפיעים על רכיבים סלולריים ורשתיים שונים של מעגלים אלה עדיין אינה ברורה. פרוסות מוח Ex vivo מספקות אמצעי שבאמצעותו חוקרים יכולים לחקור רכיבים בדידים של רשתות מורכבות ולנטרל מנגנונים פוטנציאליים העומדים בבסיס ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות. כדי לבודד השפעות פוטנציאליות של תרופות ספציפיות לסוג התאים ולמסלולם בפרוסות מוח, חוקרים חייבים להיות מסוגלים להפעיל באופן עצמאי מסלולי סיבים אפרינטיים, לזהות אוכלוסיות תאים שאינן חופפות ולהחיל חומרי הרדמה נדיפים על הרקמה בתמיסה מימית. בפרוטוקול זה מתוארות שיטות למדידת תגובות אופטוגניות המעוררות לשני מסלולים אפירניים בלתי תלויים לניאוקורטקס בפרוסות המוח ex vivo. תגובות חוץ-תאיות נרשמות כדי לבחון את פעילות הרשת, והקלטות ממוקדות של מהדקי טלאים של תאים שלמים מתבצעות באינטרנורונים חיוביים לסומטוסטטין ופרוולבומין. מתוארת אספקה של ריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של איזופלוראן דרך נוזל השדרה המוחי המלאכותי כדי לווסת את תגובות התאים והרשת.

ציר זמן של שלבים המתוארים בפרוטוקול מוצג באיור 1. לקלטים קליפתיים המגיעים מאזורים בקליפת המוח מסדר גבוה יותר או מגרעינים תלמיים שאינם ראשוניים יש שדות סופניים חופפים חלקית בשכבה 1 של קליפת המוח הראייתית הלא ראשונית24. כדי לבודד מסלולים תלמוקורטיים או קורטיקוק?...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics at JoVE.com

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

ניתן להשתמש בפרוסות מוח Ex vivo כדי לחקור את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות לתשומות אפרינטיות. אופטוגנטיקה משמשת להפעלה עצמאית של אפרנטים תלמוקורטיים וקורטיקוקורטיקליים לניאוקורטקס שאינו ראשוני, ותגובות סינפטיות ורשתיות מווסתות עם איזופלורן.

הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

This protocol can be used to investigate whether volatile anesthetics disrupts some synopsis more than others, to determine if their effects are cell type or as pathway specific, and to determine what effects occur at the population level. The main advantage of this technique is the specificity with which we can assess the effects of volatile anesthetics. We can target specific pathways and cell types in simultaneously assay population activity.Begin by preparing the tissue block for sectioning. Gently lift the brain from the skull cavity and place it on the filter paper. Make a cut along the sagittal plane of the brain parallel to the midline and place the tissue block on this sagittal plane.Guide the filter paper over the blocking template, and align the brain with the underlying template outline. Make a parallel cut in the coronal plane as indicated by the lines on the template, adding a small drop of slicing aCSF to keep the filter paper wet if necessary. Place the tissue block in four degrees Celsius slicing aCSF and apply a small amount of glue to the ice-cold specimen stage.Lift the tissue block from the slicing aCSF and wick away excess solution with a corner of an absorbent towel. Glue the posterior coronal plane of the tissue block to the specimen stage with the dorsal surface of the brain facing the sapphire blade. Collect 500 micrometer thick coronal brain slices and place them on a nylon mesh in 34 degrees Celsius slicing aCSF.Allow the container to reach room temperature. To prepare experimental aCSF bags with dissolved isoflurane, add 600 milliliters of experimental aCSF and 600 milliliters of 95%oxygen and 5%carbon dioxide gas mixture to an empty polytetrafluoroethylene gas bag. Label this bag control.Add 300 milliliters of experimental aCSF to another polytetrafluoroethylene gas bag, and label this bag isoflurane. Proceed with preparing the isoflurane bag according to the manuscript directions. Configure the light simulation protocols by randomly assigning wave forms to each profile.Each profile with its assigned wave form corresponds to one trigger pulse from a digital TTL input or one trial. When finished, save the profile sequence. To place the multi-channel probe in the ex vivo brain tissue slide, perfuse bubbled experimental aCSF at three to six milliliters per minute, and transfer the brain slice containing the area of interest onto the mesh grid in the microscope perfusion chamber.Anchor the brain slice with a platinum harp. Rotate the mesh grid so that the line of electrode contacts on the distal end of the multi-channel probe is approximately perpendicular to the peel surface. Under broad field illumination and fine control of the micromanipulator, lower the multichannel probe toward the surface of the slice.Engage the appropriate filter cube for visualization of the fluorescent reporter protein expressed in axon terminals of cortical afferents. If necessary, rotate the slice to more precisely align the probe with the peel surface. Position the probe just above the plane of the slice 200 micrometers short of the final target position along the x-axis, leaving at least one channel outside of the area of tissue being recorded.Slowly insert the probe into the slice along its longitudinal axis. To minimize damage to the tissue, only advance the probe to the extent that the sharp tips are just visible below the tissue surface. Switch experimental aCSF source to bagged control solution and identify the fluorescently-labeled cell for targeted patch clamp recording.Restrict the aperture to the smallest diameter and engage the high power water immersion objective, taking care to avoid contact between the multichannel probe and objective lens. Bring the tissue into focus. Center the light over an area of tissue adjacent to but not overlapping the multi-channel probe.Engage the appropriate filter set to allow imaging of cells expressing the Cre-dependent fluorescent marker. Raise the objective lens to create ample space for lowering a patch pipette. Load a patch pipette with internal solution and mount it on the electrode holder.Use a one milliliter syringe to apply positive pressure corresponding to approximately 0.1 milliliter air. Lower the patch pipette into the solution bringing the tip into focus under visual guidance, and obtain whole cell recording from the targeted cell. The animals used in this protocol expressed fluorescent reporter protein tdTomato in either somatostatin or parvalbumin-positive interneurons.These interneurons were targeted for patch clamping under visual guidance with the appropriate filter cube engaged. Postsynaptic potentials were observed in interneurons in response to a train of four two millisecond pulses of light. Local field potentials were also recorded.Current source density and multi-unit activity were extracted from local field potentials. The amplitude of current sinks extracted from the current source density increased as a function of light intensity. A three parameter non-linear logistic equation was fit to the data for comparisons across pathways.Postsynaptic potential amplitude also increased with current sink amplitude. Synaptic responses to the thalamocortical and cortico-cortical inputs were measured during control, isoflurane, and recovery conditions. Post synaptic responses of somatostatin and cortico-cortical stimuli and the evoked current sinks were suppressed in isoflurane conditions.When preparing the brains slices, maintaining the health of the tissue is paramount. It's important to keep the tissue cool throughout the slicing procedure, working quickly without damaging the tissue. Multichannel extracellular recordings may be post-processed in a variety of ways.For example, high pass filtering of the wideband signal isolates population spiking activity while current source density calculations highlight synaptic activity. Together, these techniques have allowed us to explore anesthetic effects on specific isolated components of cortical circuits, providing insight into the mechanisms underlying loss of consciousness in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...