Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), og Science and Technology Plan Project of Hunan Province (2019RS1036).

1. Midgut dissektion og kultivable bakterier isolering
<ol><li>Forbered myg til dissektion.<ol>
<li>Saml myggene 7-9 dage efter fremkomsten med en aspirator. Bedøve de opsamles myg ved at udsætte dem for en temperatur på 4 °C i 3-5 min og holde myg bedøvet i en iskold petriskål indtil dissektion.</li>
	</ol></li>
	<li>Steriliser laboratorieinstrumenter og myggeoverfladen.<ol>
<li>Steriliser eksperimentbænken, dissekere mikroskop, saftræt og glasrutsjebanen ved at sprøjte 75% e...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

Forskning i vært-mikrobe interaktioner har vist, at forskellige tarm mikrober påvirker deres vært fysiologi via divergerende mekanismer. Denne artikel introducerer metoden til at undersøge den respektive rolle myg gut mikrobe, herunder dissekere myg midgut, dyrkekultebare tarmbakterier, antibiotikabehandling, og genindføre bakterier af interesse.
For vellykket antibiotikabehandling skal følgende detaljer overvejes ved udførelsen af forsøget. I denne protokol blev myg behandlet med vatk...

Myg anses for at være de vigtigste vektorer af humane patogene sygdomme, overføre over hundrede patogener, herunder Zika virus, Dengue virus, og Plasmodium parasitter1. Når myg tage et blodmåltid at erhverve næringsstoffer til oviposition, de kan ved et uheld indtage patogener fra en inficeret vært via fordøjelseskanalen2. Vigtigere, myg midgut, som spiller en afgørende rolle i både blod måltid fordøjelse og patogen indgang, havne en meget dynamisk mikrobiom3.
Flere undersøgelser har karakteriseret lab-opdrættet og felt-indsamlet myg mikrobiota ved hjælp af enten en kultur-afhængig metode eller en bakterie sekventering assay4,5,6. Arter, herunder Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, og Enterococcus er almindeligvis isoleret fra myg i forskelligeundersøgelser 5,,7,,8,9. Interessant, myg gut mikrobiota svinger dynamisk i både samfundet mangfoldighed og mængden af bakterier arter, påvirket af udviklingsstadiet, arter, geografisk oprindelse, og fodring adfærd4. Undersøgelser viser, at blodfodring dramatisk øger den samlede bakteriebelastning med hurtig ekspansion af arter fra Enterobacteriaceae og en reduktion i den samledemangfoldighed 10,11. Desuden er mygge gut mikrobiota af larve fase normalt udryddet, når insektet gennemgår metamorfose under pupation og eclosion; således, nyligt opstået voksne myg nødt til at genbefolke deres mikrobiota4.
Gut mikrobiota modulerer insekt fysiologi i forskellige aspekter, herunder næringsstof absorption, immunitet, udvikling, reproduktion, og vektor kompetence12. Axenic myg larver undlader at udvikle sig ud over den første instar, mens en bakterier oral forsyning redder udvikling, hvilket indikerer, at myg tarmmikrobe er afgørende for larveudvikling 13,,14. Udover, udtynding af tarmbakterier forsinker blod måltid fordøjelse og næringsstof absorption, påvirker oocyt modning, og nedsætter oviposition15. Desuden fremkalder myg med tarmmikroflora højere immunrespons sammenlignet med antibiotikabehandlede myg, med konstant forhøjet antimikrobielt peptid udtryk mod andre patogener til at inficere16. Antibiotika er normalt oralt administreres for at fjerne pan tarmbakterier i disse undersøgelser, og derefter eksperimenter udføres for at sammenligne forskellen mellem axenic myg og myg med commensal mikrober. Men myg midgut havne et mangfoldigt fællesskab af mikrober, og hver bakterie arter kunne udøve en særskilt effekt mod værten fysiologi.
Mosquito microbiota regulerer vektor kompetence med divergerende virkninger. Kolonisering af Proteus isoleret fra felt-afledte myg af dengue-endemiske områder giver opreguleret antimikrobiel peptid udtryk og resistens over for dengue virus infektion16. Den entomopathogenic svamp Beauveria bassiana aktiverer Toll og JAK-STAT immun vej mod arbovirus infektion17. Derimod svampen Talaromyces isoleret fra Aedes aegypti midgut letter dengue virus infektion ved modulerende gut trypsin aktivitet18. Desuden, Serratia marcescens fremmer arbovirus transmission gennem en sekretorisk protein kaldet SmEnhancin, som fordøjer mucin lag på tarm epitel af myg19.
Denne procedure giver en systematisk og intuitiv metode til dissektion af myg midgut, isolering af kultivable bakterier kolonier, identifikation af bakteriearter, og genindførelse via oral fodring. Det giver repræsentative resultater af blod fodring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, om myg æggesting udvikling og oviposition.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

Myg midgut havne en meget dynamisk mikrobiom, der påvirker værten stofskifte, reproduktion, fitness, og vektor kompetence. Der er gennemført undersøgelser for at undersøge virkningen af tarmmikrober som helhed; forskellige mikrober kan dog have forskellige virkninger over for værten. Denne artikel indeholder metoden til at undersøge effekten af hver enkelt myg gut mikrobe og den potentielle mekanisme.
Denne protokol indeholder to dele. Den første del introducerer, hvordan man dissekere myg midgut, isolere kultivable bakterier kolonier, og identificere bakterier arter. Den anden del giver mulighed for at generere antibiotika-behandlede myg og genindføre en bestemt bakterie arter.

Midguts af myg behandlet med antibiotika og uden antibiotika blev taget ud for DNA-ekstraktion, og qPCR blev udført med universelle bakterielle primere. Figur 1 viser ekspressionen af bakteriel 16S rRNA i kontrolgruppen og antibiotikabehandlingsgruppen. Resultaterne viser, at omkring 98% af tarmbakterierne er blevet fjernet, og tarmsterilisering af penicillin og streptomycin var en succes.
Med de beskrevne metoder blev bakteriestammer isoleret og identificeret. C. meningo...

Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

En bakteriel oral fodring assay med antibiotika-behandlede myg

Denne artikel præsenterer en protokol til at undersøge effekten af de enkelte myg tarmbakterier, herunder isolering og identifikation af myg midgut kultivable mikrober, antibiotika udtynding af myg tarmbakterier, og genindføre en bestemt bakterie arter.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mosquito midgut havne et komplekst fællesskab af mikrober, der påvirker værten stofskifte, reproduktion, fitness, og dyrlægen kompetence. Med hver tarm mikrobe er en anden effekt. Denne video introducerer proceduren for at studere den respektive rolle hver bakterie stamme eller vært fysiologi.At erhverve en kultur af gut bakterielle kolonier, dissekere myg midgut under steril tilstand. Jord dissekere midgut, serotologisk, og spredt over agar plade. Vælg enkelte kolonier fra pladen, og identificer bakteriearten via deres 16 SRNA-gensekvens.Fodre myg med COD Prægning indeholdende antibiotika i træk på tre dage for at fjerne tarm mikrobiota. Effektiviteten af antibiotikabehandling kan bekræftes ved at dissekere midgut af aseptiske myg for koloni danner enhed analyse forud for efterfølgende ekstremister. Derefter genindføre specifikke bakterier arter, der tidligere isoleret fra myg tarmen via oral fodring assay.Effekten af bakterier på vært fysiologi kunne evalueres ved at sammenligne de ubehandlede myg, antibiotika-behandlede myg, og myg genindført specifik tilbageholdenhed. Midgut dissektion og dyrkes bakterier isolation. Til at begynde med, indsamle myg i bur med en aspirator og celle myg i indsamling boksen.Bedøve myg ved at underkaste en temperatur på 4 grader i tre til fem minutter. Hold myg bedøvet ved at placere dem i en iskold petriskål. Desinficere bænken, dissekere mikroskop, og snævring ved at sprøjte 75% ethanol for at undgå forurening med bakterier fra miljøet.Overflade sterilisere myg ved tape og ryste dem i 75% ethanol i tre minutter og skyl to gange med PBS buffer. Bisect myg separat på en steril glas dias, der indeholder din dråbe PBS. Fjern forsigtigt benene, vingerne og hovedet af myg ved hjælp af sniver.Clamp myg bryst og den sidste del af maven var stænde og trække fra hinanden for at isolere fordøjelseskanalen. Brug vices til at fjerne afgrøden og malpighian rør fra fordøjelseskanalen. Afgrøden er placeret ved pnterior af midgut og buler efter indtagelse af sukker vand.Malpighian rør er gruppe af slanke ekskrekulerende rør på krydset af midgut og hindgut. Placer den dissekerede makeup i EP-rør med 200 mikroliters sterile PBS buffer og male det med den sterile slibning præst i den rene bænk. Korn til at indlæse homogene til tre tempo vrangforestillinger på 50 mikroliter af hver vrangforestilling til LB agar plade og desperate plade.Inkuber pladen som 37 grader i en til to dage, indtil enkelte kolonier er mulige. Pluk enkelte kolonier i en 150 milliliter konisk kolbe, der indeholder 50 milliliter lb bh'er medium. ryste bakterierne ved 37 grader natten over.Identifikation af arter. Uddrag TOTO DNA ved bakteriel genomisk DNA konstruktion kit og forstærke 16 SRDNA ved PCR. Genopretning og rensning af DNA-fragmenter fra PCR-produkter af Ambrose gelelektrophorsis og det kørte recovery kit.Udført DNA sekventering på de rensede DNA fragmenter at have en opnået bakterier kæde sekvenser. Kør blast søgning til en forespørgsel de 16 SRNA gensekvens af identificere bakterier mod bakterier og archaea og database. Identifikationen af artsniveauet blev defineret som større end eller lig med 99%16 SRDNA-sekvensligheden til den nærmeste holdbankpost.Isolatet blev tildelt det til den tilsvarende, slægt, når er 16 SRDNA sekvens, lighed var mindre end 99% og større end eller lig med 95% antibiotika behandling og bakterie genintroduktion. den nødvendige mængde saccharose penicillin og streptomycin til at forberede os 10% saccharose opløsning, herunder forsøger 20 enheder af penicillin og 20 mikrogram streptomycin per milliliter. Infiltrere vatkugler i saccharose opløsning, der indeholder antibiotika og placere den over toppen af papiret kop, der indeholder myg.Dæk vat med en 10 centimeter petriskål for at forhindre en havnefront i at fordampe. Udskift vatkugler to gange om dagen og fodre myg i træk på tre dage. Myg er opdelt i to grupper.Den første gruppe blev placeret i en myg kop uden nogen behandling, enhver vatkugler læge med 10%Så cross blev givet dagligt. Den anden gruppe blev behandlet med antibiotika og tjene i tre dage. I hver gruppe blev Sergei myg dissekeret.Mika blev udvundet for total DNA-ekstraktion og QPCR blev udført ved hjælp af universelle bakterier primere, figur en viser udtrykket af 16 SRNA i kontrolgruppen og antibiotika behandling gruppe. Resultaterne viser, at omkostningerne eller realiseringen af penicillin og streptomycin var en succes. forberede bakteriel løsning, måler en bakterieopløsning i virus med et spektrofotometer, tilsæt en OT bakterier suspension i EP rør.Centrifuge suspensionen ved 5, 000 RCA i fem minutter ved fire graders Kassér supernatanten, vask bakteriepallen forsøger med steril PBS buffer. Re-suspendere bakteriel palle med 200 microliters sterile PBS buffer Tilføj 600 mikroliter, 10% saccharose opløsning, 200 mikroliter ATP og 200 microliter bakteriel suspension i en ny AP rør og bland godt. Alternativt kan bakterierne igen suspenderes i varme i aktivere dit blod.Forberedelse af opvarmning aktiveret blod. blodprop med antikoagulerende rør, skal der gå to til tre milliliter frisk blod. centrifuge ved 1000 i 10 minutter ved fire grader for at adskille plasma og blodlegemer.Opsaml plasmaet i et nyt EP-rør, og aktiver heri aktiveret ved en 56 grader i en time. Vask Blast hus gennem dine tider med sterile PBS buffer. Skyl suspenderet blast hus med varme aktiveret plasma.Saml membran- og fodringssystem. Træk filmsyge til det maksimale. fastgør med plastringen og arbejdsparafilmen for at undgå, at den lækkende langsomt tilsættes den forberedte bakterieopløsning til fødeenheden, til den maksimale tegnebog.For at undgå, at boblen faldt fra én retning, forsegles fødeenheden. Tilslut strømforsyningen. Vent, indtil temperaturen når 37 grader Installeret foderenheden med bakterieopløsning på fødeautomaten.Før fodring bakterier myg bør stoppes i 24 timer at metabolisere antibiotika. For foderenheden på papirkoppen med myg, så lad fodring i 90 minutter. Fuldt opmuntret myg kunne plukkes ud til yderligere undersøgelser.repræsentative resultater. Figur to viser os den gennemsnitlige anerkendelse pr myg. Efter plot fodring af antibiotika behandlet myg ser vi meningosepticum.Figur tre viser udtrykket af en variant udvikling relaterede gener 24 timer efter blodmåltid, der indeholder C meningosepticum. Resultaterne viser, at der ikke er nogen væsentlig ændring i kontrolgruppens og den falmende gruppes ægproduktion. Tak for din interesse i bakterier eller en fodring essay med antibiotika behandlet myg.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-medieret Gene Knockdown og<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay i Voksen Kvinde<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Myg

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-påvisningsassay for Malaria Fremsendende Myg

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Højt fedtindhold Fodring Paradigme for Larver Zebrafisk: Fodring, Levende Imaging, og kvantificering af fødeindtagelse

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Opretholdelse af Aedes aegypti myg inficeret med Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Mundtlige bakterieinfektion og kaste i Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for afprøvning toksicitet af roman insektbekæmpelsesmidler kemi til myg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Tvunget spytsekretion som en metode til at analysere vektor kompetence af myg

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...