Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) en het Science and Technology Plan Project van de provincie Hunan (2019RS1036).

1. Midgut dissectie en cultivable bacteriën isolatie
<ol><li>Bereid de mug voor op dissectie.<ol>
<li>Verzamel de muggen 7-9 dagen na het ontstaan met een aspirator. Verdoven de verzamelde muggen door ze gedurende 3-5 min te onderwerpen aan een temperatuur van 4 °C en de muggen verdoofd te houden in een ijskoud petrischaaltje tot dissectie.</li>
	</ol></li>
	<li>Steriliseren laboratoriuminstrumenten en het muggenoppervlak.<ol>
<li>Steriliseren van het experiment bank, ontleden micros...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

Onderzoek naar gastheer-microbe interacties hebben aangetoond dat verschillende darmmicroben hun gastheerfysiologie beïnvloeden via uiteenlopende mechanismen. Dit artikel introduceert de methode om de respectieve rol van mug gut microbe te onderzoeken, met inbegrip van ontleden mug midgut, culturing cultivable darmbacteriën, behandeling met antibiotica, en herinvoering van de bacteriën van belang.
Voor een succesvolle behandeling met antibiotica moeten de volgende details worden overwogen b...

Muggen worden beschouwd als de belangrijkste vectoren van menselijke pathogene ziekten, die meer dan honderd ziekteverwekkers overbrengen, waaronder het Zika-virus, het Dengue-virus en Plasmodium-parasieten 1. Wanneer muggen een bloedmaaltijd nemen om voedingsstoffen te verkrijgen voor ovipositie, kunnen ze per ongeluk ziekteverwekkers van een geïnfecteerde gastheer binnenkrijgen via het spijsverteringskanaal2. Belangrijk is dat de mug midgut, die een centrale rol speelt in zowel bloedmeel spijsvertering en pathogene ingang, herbergt een zeer dynamische microbioom3.
Verschillende studies hebben gekenmerkt lab-gefokte en veld-verzamelde mug microbiota met behulp van een cultuur-afhankelijke methode of een bacteriën sequencing test4,5,6. Soorten zoals Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaen Enterococcus worden vaak geïsoleerd van muggen in verschillende studies5,7,8,9. Interessant is dat muggendarmmicrobiota dynamisch fluctueert in zowel de diversiteit van de gemeenschap als de hoeveelheid bacteriesoorten, beïnvloed door het ontwikkelingsstadium, soorten, geografische oorsprong en voedingsgedrag4. Studies tonen aan dat bloedvoeding de totale bacteriële belasting drastisch verhoogt met een snelle expansie van soorten uit Enterobacteriaceae en een vermindering van de totale diversiteit10,11. Bovendien wordt muggenonderbuismicrobiota van het larvestadium meestal uitgeroeid wanneer het insect een metamorfose ondergaat tijdens verpopping en eclosie; dus, nieuw opgedoken volwassen muggen moeten hun microbiota4opnieuw bevolken .
Gut microbiota moduleert insectenfysiologie in verschillende aspecten, waaronder opname van voedingsstoffen, immuniteit, ontwikkeling, voortplanting en vectorcompetentie12. Axenic mug larven niet te ontwikkelen dan de eerste instar, terwijl een bacterie orale aanbod redt ontwikkeling, wat aangeeft dat de mug gut microbe is essentieel voor larve ontwikkeling13,14. Bovendien vertraagt uitputting van darmbacteriën de spijsvertering van de bloedmaaltijd en de opname van voedingsstoffen, beïnvloedt de rijping van de eicel en vermindert de ovipositie15. Bovendien lokken muggen met darmmicroflora hogere immuunresponsen uit in vergelijking met met antibiotica behandelde muggen, met voortdurend verhoogde antimicrobiële peptide-expressie tegen andere ziekteverwekkers om16te infecteren. Antibiotica worden meestal oraal toegediend om pan gut bacteriën te verwijderen in deze studies, en vervolgens experimenten worden uitgevoerd om het verschil tussen axenic muggen en muggen te vergelijken met commensale microben. Echter, de mug midgut herbergt een diverse gemeenschap van microben, en elke bacterie soort kan een duidelijk effect uitoefenen op de gastheer fysiologie.
Mosquito microbiota reguleert vector competentie met uiteenlopende effecten. Kolonisatie door Proteus geïsoleerd van veld-afgeleide muggen van dengue-endemische gebieden verleent upregulated antimicrobiële peptide expressie en resistentie tegen dengue virus infectie16. De entomopathogene schimmel Beauveria bassiana activeert de Toll en JAK-STAT immuunroute tegen arbovirusinfectie17. Daarentegen, de schimmel Talaromyces geïsoleerd van Aedes aegypti midgut vergemakkelijkt dengue virus infectie door moduleren gut trypsine activiteit18. Bovendien bevordert Serratia marcescens de overdracht van arbovirus via een secretoir eiwit genaamd SmEnhancin, dat de mucinlaag op het darmeptheel van muggen vertelt19.
Deze procedure biedt een systematische en intuïtieve methode voor dissectie van de mug midgut, isolatie van cultivable bacteriën kolonies, identificatie van de bacteriesoorten, en herintroductie via orale voeding. Het biedt representatieve resultaten van bloedvoeding met een commensale bacterie, Chryseobacterium meningosepticum, op mug eierstokontwikkeling en ovipositie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

De mug midgut herbergt een zeer dynamisch microbioom dat het metabolisme van de gastheer, reproductie, fitness en vectorcompetentie beïnvloedt. Er zijn studies uitgevoerd om het effect van darmmicroben als geheel te onderzoeken; verschillende microben kunnen echter verschillende effecten op de host uitoefenen. Dit artikel biedt de methodologie om het effect van elke specifieke mug gut microbe en het potentiële mechanisme te bestuderen.
Dit protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel introduceert hoe de mug midgut te ontleden, cultivable bacteriën kolonies te isoleren, en bacteriën soorten te identificeren. Het tweede deel biedt de procedure om met antibiotica behandelde muggen te genereren en één specifieke bacteriesoort opnieuw in te voeren.

De muggen die met antibiotica en zonder antibiotica werden behandeld, werden genomen voor DNA-extractie, en qPCR werd uitgevoerd met universele bacteriële primers. Figuur 1 toont de expressie van bacteriële 16S rRNA in de controlegroep en de behandelingsgroep voor antibiotica. De resultaten tonen aan dat ongeveer 98% van de darmbacteriën zijn verwijderd, en de darmsterilisatie van penicilline en streptomycine was succesvol.
Met de beschreven methoden werden bacteriestammen ...

Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

Een bacteriële orale voedingstest met met antibiotica behandelde muggen

Dit artikel presenteert een protocol om het effect van individuele muggendarmbacteriën te onderzoeken, inclusief isolatie en identificatie van muggenmuisculivable microben, uitputting van muggendarmen en herintroduceren van een specifieke bacteriesoort.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mosquito midgut herbergt een complexe gemeenschap van microben die invloed hebben op de gastheer metabolisme, reproductie, fitness, en dierenarts competentie. Bij elke darmmicrobe is een ander effect. Deze video introduceert de procedure om de respectieve rol van elke bacteriestam of gastheerfysiologie te bestuderen.Om een cultuur van darmbacteriële kolonies te verwerven, ontleden de mug midgut onder steriele toestand. Bezoedelde de ontleed midgut, serotologinaat, en verspreid over de agar plaat. Kies enkele kolonies van de plaat en identificeer de bacteriesoorten via hun 16 SRNA-gensequentie.Voer de muggen met COD-reliëfs met antibiotica voor opeenvolgende van drie dagen om darmmicrobiota te verwijderen. De effectiviteit van de behandeling met antibiotica kan worden bevestigd door de midgut van de aseptische mug te ontleden voor kolonievormende eenheidstest voorafgaand aan latere extremisten. Vervolgens herintroduceren specifieke bacteriën soorten die eerder geïsoleerd uit muggendarm via orale voeding test.Het effect van bacteriën op de hostfysiologie kan worden geëvalueerd door de onbehandelde muggen, met antibiotica behandelde muggen en de muggen opnieuw specifieke terughoudendheid te vergelijken. Midgut dissectie en de cultiverbare bacteriën isolatie. Om te beginnen, verzamel de muggen in kooi met een aspirator en cel de muggen in de collectebus.Verdoven de muggen door het onderwerpen aan een temperatuur van 4 graden gedurende drie tot vijf minuten. Houd de muggen verdoofd door ze in een ijskoud petrischaaltje te plaatsen. Desinfecteren de bank, ontleden microscoop, en tangen door het spuiten van 75%ethanol om besmetting door bacteriën uit het milieu te voorkomen.Oppervlakte steriliseren de mug door ze drie minuten in 75% ethanol te tapsen en te schudden en spoel twee keer af met PBS-buffer. Doorsnijd de mug afzonderlijk op een steriele glazen glijbaan met uw druppel PBS. Verwijder voorzichtig de benen, vleugels en het hoofd van de mug met behulp van tangen.Klem de borst van de mug en het laatste deel van de buik sforcept en trek uit elkaar om het spijsverteringskanaal te isoleren. Gebruik tangen om het gewas en de malpighian buis uit het spijsverteringskanaal te verwijderen. Het gewas wordt geplaatst bij de pnterior van midgut en uitstulpingen na het innemen van suikerwater.Malpighian buizen zijn groep van slanke uitscheidingsbuizen op de kruising van midgut en hindgut. Plaats de ontleed make-up in EP buis met 200 microliters steriele PBS buffer en maal het met de steriele slijpen pastor in de schone bank. Granen om het homogenaat te laden tot drie tempo wanen bij 50 microliter van elke waan aan de LB agar plaat en wanhopige plaat.Broed de plaat als 37 graden gedurende een tot twee dagen tot enkele kolonies haalbaar zijn. Pluk enkele kolonies in een 150 milliliter conische kolf met 50 milliliter lb bh's medium. schud de bacteriën op 37 graden 's nachts.Identificatie van soorten. Haal TOTO DNA uit door bacteriële genomic DNA bouwkit en versterk 16 SRDNA van PCR. Herstel en de zuivering van DNA-fragmenten uit PCR-producten door Ambrose gel elektroforese en de drove recovery kit.Uitgevoerd DNA sequencing op de gezuiverde DNA fragmenten om een bereikte bacteriën ketting sequenties hebben. Run blast zoeken naar een query de 16 SRNA gen sequentie van de bacteriën te identificeren tegen de bacteriën en de archaea en database. Identificatie van het soortenniveau werd gedefinieerd als groter dan of gelijk aan 99%16 SRDNA sequentie gelijkenis met de dichtstbijzijnde team bank entry.Het isolaat werd toegewezen aan de overeenkomstige, geslacht wanneer is 16 SRDNA sequentie, gelijkenis was minder dan 99%en groter dan of gelijk aan 95% behandeling met antibiotica en bacterium re-introductie. wegen de vereiste hoeveelheid sacharose penicilline en streptomycine om ons 10% sacharose oplossing voor te bereiden, met inbegrip van het proberen van 20 eenheden penicilline en de 20 microgram streptomycine per milliliter. Infiltreren in de katoenen ballen in de sacharose oplossing met antibiotica en plaats het over de top van de papieren beker met mug.Bedek de katoenen bal met een petrischaal van 10 centimeter om te voorkomen dat een waterkant verdampt. Vervang de katoenen ballen twee dagen en voer de mug voor opeenvolgende van drie dagen. Muggen zijn verdeeld in twee groepen.De eerste groep werd geplaatst in een mug beker zonder enige behandeling, een katoenen ballen arts met 10%Zo kruis werd dagelijks gegeven. De tweede groep werd behandeld met antibiotica en drie dagen dienen. In elke groep werden Sergei muggen ontleed.De Mika werd geëxtraheerd voor totale DNA-extractie en de QPCR werd uitgevoerd met behulp van universele bacteriën primers, figuur een toont de uitdrukking van 16 SRNA in de controlegroep en antibiotica behandeling groep. De resultaten tonen aan dat de kosten of realisatie van penicilline en streptomycine succesvol was. bereiden bacteriële oplossing, meet een bacterie oplossing in het virus met een spectrofotometer, voeg een OT bacteriën suspensie in EP buis.Centrifuge de suspensie op 5.000 RCA gedurende vijf minuten op vier graden Gooi de supernatant, was de bacteriën pallet probeert met steriele PBS buffer. Schort de bacteriële pallet opnieuw op met 200 microliter steriele PBS-buffer Voeg 600 microliter, 10% sacharoseoplossing, 200 microliter ATP en 200 microliter bacteriële suspensie toe aan een nieuwe AP-buis en meng goed. Als alternatief kunnen de bacteriën opnieuw worden opgehangen in warmte in het activeren van uw bloed.Bereiding van verwarming geactiveerd bloed. stolsel vers bloed met antistollingsbuis, neem twee tot drie milliliter vers bloed. centrifuge bij 1000 gedurende 10 minuten op vier graden om plasma en bloedcellen te scheiden.Verzamel het plasma in een nieuwe EP buis en hierin activeren geactiveerd op een 56 graden gedurende een uur. Was Blast huis door je tijden met steriele PBS buffer. Spoel een zwevend blasthouse met verwarmd geactiveerd plasma.Monteer membraan en voersysteem. Trek de filmziekte maximaal. met de kunststof ring en werkplekparafilm om te voorkomen dat het lekken langzaam de voorbereide bacteriële oplossing toevoegt aan de feeder unit, aan de maximale portemonnee.Om te voorkomen dat de bel uit één richting viel en de feeder unit verzegelen. Sluit de voeding aan. Wacht tot de temperatuur 37 graden bereikt Geïnstalleerd de feeder unit met bacteriën oplossing op de feeder.Voor het voeden van bacteriën moeten muggen 24 uur worden gestopt om antibiotica te metaboliseren. Voor de voereenheid op de papieren beker met muggen, laat dan 90 minuten voeden. Volledig aangemoedigde muggen kunnen worden uitgekozen voor verdere studies.Representatieve resultaten. Figuur twee toont ons de gemiddelde lofbetuiging per mug. Na het uitzetten van met antibiotica behandelde de muggen zien we meningosepticum.Figuur drie toont de expressie van een variant ontwikkeling gerelateerde genen 24 uur na bloedmeel met de C meningosepticum. De resultaten tonen aan dat er geen significante verandering is in de eiproductie van de controlegroep en de vervagende groep. Dank u voor uw interesse in bacteriën of een voeding essay met antibiotica behandelde muggen.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Injectie van An. stephensi Embryo&#39;s aan Malaria-resistente muggen Generate

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

Voorkomen van de verspreiding van malaria en knokkelkoorts Met behulp van genetisch gemodificeerde muggen

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Protocollen voor orale infectie van lepidoptera Larven met Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-gemedieerde Gene Knockdown en<em&gt; In Vivo</em&gt; Urineproductie Assay in het volwassenenonderwijs Vrouw<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Muggen

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Vetrijke Feeding Paradigm voor larvale zebravis: Voeden, Live Imaging, en kwantificering van voedselinname

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Behoud van Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Mondelinge bacteriële infectie en Shedding bij Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protocollen voor het testen van de toxiciteit van roman insecticide chemicaliën aan muggen

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...