Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) et le Projet de plan scientifique et technologique de la province du Hunan (2019RS1036).

1. Dissection de midgut et isolement des bactéries cultivables
<ol><li>Préparer le moustique à la dissection.<ol>
<li>Recueillir les moustiques 7 à 9 jours après l’émergence avec un aspirateur. Anesthésiez les moustiques recueillis en les soumettant à une température de 4 °C pendant 3 à 5 min et gardez les moustiques anesthésiés dans une boîte de Pétri glacée jusqu’à la dissection.</li>
	</ol></li>
	<li>Stériliser les instruments de laboratoire et la surface du mo...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

La recherche sur les interactions hôte-microbe ont constaté que différents microbes intestinaux affectent leur physiologie hôte par des mécanismes divergents. Cet article présente la méthode pour étudier le rôle respectif du microbe intestinal de moustique, y compris la dissection de midgut de moustique, la culture des bactéries intestinales cultivables, le traitement antibiotique, et la réintroduction des bactéries d’intérêt.
Pour réussir un traitement antibiotique, les déta...

Les moustiques sont considérés comme les vecteurs les plus importants des maladies pathogènes humaines, transmettant plus d’une centaine d’agents pathogènes, y compris le virus Zika, le virus de la dengue et les parasites Plasmodium 1. Lorsque les moustiques prennent un repas sanguin pour acquérir des nutriments pour l’oviposition, ils peuvent accidentellement ingérer des agents pathogènes d’un hôte infecté via le tube digestif2. Fait important, le midgut de moustique, qui joue un rôle central dans la digestion de farine de sang et l’entrée de pathogène, abrite un microbiome très dynamique3.
Plusieurs études ont caractérisé le microbiote des moustiques élevés en laboratoire et sur le terrain à l’aide d’une méthode dépendante de la culture ou d’un test de séquençage des bactéries4,,5,6. Espèces, y compris Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, et Enterococcus sont généralement isolés des moustiques dans diverses études5,7,8,9. Fait intéressant, le microbiote intestinal des moustiques fluctue dynamiquement dans la diversité de la communauté et la quantité d’espèces bactériennes, affectées par le stade de développement, les espèces, l’origine géographique et le comportement alimentaire4. Des études montrent que l’alimentation sanguine augmente considérablement la charge bactérienne totale avec l’expansion rapide des espèces d’Enterobacteriaceae et une réduction de la diversité globale10,11. En outre, le microbiote intestinal des moustiques du stade larvaire est généralement éradiqué lorsque l’insecte subit une métamorphose pendant la pupation et l’éclosion; ainsi, les moustiques adultes nouvellement émergés ont besoin de repeupler leur microbiote4.
Le microbiote intestinal module la physiologie des insectes sous divers aspects, y compris l’absorption des nutriments, l’immunité, le développement, la reproduction et la compétence vectorielle12. Les larves de moustiques axeniques ne se développent pas au-delà de la première étoile tandis qu’un approvisionnement oral de bactéries sauve le développement, indiquant que le microbe d’intestin de moustique est essentiel pour le développement de larval13,14. En outre, l’épuisement des bactéries intestinales retarde la digestion des farines sanguines et l’absorption des nutriments, affecte la maturation des ovocytes, et diminue l’oviposition15. En outre, les moustiques atteints de microflore intestinale provoquent des réponses immunitaires plus élevées que les moustiques traités aux antibiotiques, avec une expression peptide antimicrobiene constamment élevée contre d’autres agents pathogènes pour infecter16. Les antibiotiques sont généralement administrés par voie orale pour éliminer les bactéries intestinales dans ces études, puis des expériences sont menées pour comparer la différence entre les moustiques axeniques et les moustiques avec les microbes commensaux. Cependant, le moustique midgut abrite une communauté diversifiée de microbes, et chaque espèce de bactéries pourrait exercer un effet distinct vers la physiologie de l’hôte.
Le microbiote des moustiques régule la compétence vectorielle avec des effets divergents. La colonisation par Proteus isolé des moustiques dérivés du champ des zones dengue-endémiques confère l’expression et la résistance des peptides antimicrobiens upregulés contre l’infection par le virus de la dengue16. Le champignon entomopathogène Beauveria bassiana active la voie immunitaire Toll et JAK-STAT contre l’infection par l’arbovirus17. En revanche, le champignon Talaromyces isolé d’Aedes aegypti midgut facilite l’infection par le virus de la dengue en modulant l’activité de trypsineintestinale 18. En outre, Serratia marcescens favorise la transmission d’arbovirus par une protéine sécrétoire appelée SmEnhancin, qui digère la couche de mucine sur l’épithélium intestinal des moustiques19.
Cette procédure fournit une méthode systématique et intuitive pour la dissection du midgut de moustique, l’isolement des colonies de bactéries cultivables, l’identification des espèces de bactéries, et la réintroduction par l’alimentation orale. Il fournit des résultats représentatifs de l’alimentation du sang avec une bactérie commensal, Chryseobacterium meningosepticum, sur le développement des ovaires de moustiques et l’oviposition.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

Le moustique midgut abrite un microbiome très dynamique qui affecte le métabolisme de l’hôte, la reproduction, la forme physique et la compétence vectorielle. Des études ont été menées pour étudier l’effet des microbes intestinaux dans leur ensemble; cependant, différents microbes pourraient exercer des effets distincts vers l’hôte. Cet article fournit la méthodologie pour étudier l’effet de chaque microbe spécifique d’intestin de moustique et le mécanisme potentiel.
Ce protocole contient deux parties. La première partie introduit la façon de disséquer le moustique midgut, d’isoler les colonies de bactéries cultivables et d’identifier les espèces de bactéries. La deuxième partie fournit la procédure pour générer des moustiques traités aux antibiotiques et réintroduire une espèce bactérienne spécifique.

Les midguts des moustiques traités avec des antibiotiques et sans antibiotiques ont été sortis pour l’extraction d’ADN, et qPCR a été exécuté avec des amorces bactériennes universelles. La figure 1 montre l’expression de l’ARN 16S bactérien dans le groupe témoin et le groupe de traitement antibiotique. Les résultats montrent qu’environ 98% des bactéries intestinales ont été enlevées, et la stérilisation intestinale de la pénicilline et de la streptomycine a été réussie.
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A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

Un test d’alimentation orale bactérienne avec des moustiques traités aux antibiotiques

Cet article présente un protocole pour étudier l’effet des bactéries intestinales des moustiques individuelles, y compris l’isolement et l’identification des microbes cultivables midgut moustique, l’épuisement antibiotique des bactéries intestinales des moustiques, et réintroduire une espèce spécifique de bactéries.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mosquito midgut abrite une communauté complexe de microbes qui affectent le métabolisme de l’hôte, la reproduction, la forme physique et la compétence vétérinaire. Avec chaque microbe intestinal est un effet différent. Cette vidéo présente la procédure d’étude du rôle respectif de chaque souche bactérienne ou physiologie de l’hôte.Pour acquérir une culture de colonies bactériennes intestinales, disséquez le mystique midgut dans un état stérile. Broyez le midgut disséqué, sérorotologinate, et étalé sur la plaque d’agar. Choisissez des colonies simples dans la plaque et identifiez les espèces bactériennes par l’intermédiaire de leur séquence de 16 gènes SRNA.Nourrissez les moustiques avec des gaufrages COD contenant des antibiotiques pendant trois jours consécutifs pour enlever le microbiote intestinal. L’efficacité du traitement antibiotique peut être confirmée en disséquant le mi-temps du moustique aseptique pour l’essai d’unité de formation de colonie avant les extrémistes suivants. Réintroduisez ensuite des espèces bactériennes spécifiques qui étaient auparavant isolées de l’intestin des moustiques par l’intermédiaire d’un test d’alimentation orale.L’effet des bactéries sur la physiologie de l’hôte pourrait être évalué en comparant les moustiques non traités, les moustiques traités aux antibiotiques et les moustiques réintroduits de retenue spécifique. Dissection midgut et isolement des bactéries cultivables. Pour commencer, recueillir les moustiques en cage avec un aspirateur et cellulaire les moustiques dans la boîte de collecte.Anesthésier les moustiques en soumettant à une température de 4 degrés pendant trois à cinq minutes. Gardez les moustiques anesthésiés en les plaçant dans une boîte de Pétri glacée. Désinfecter le banc, disséquer le microscope et les forceps en pulvérisant 75 % d’éthanol pour éviter la contamination par les bactéries de l’environnement.La surface stérilise le moustique en l’enseilant et en le secouant à 75 % d’éthanol pendant trois minutes et rincez deux fois avec le tampon PBS. Coupez le moustique séparément sur une lame de verre stérile contenant votre goutte de PBS. Retirez soigneusement les jambes, les ailes et la tête du moustique à l’aide de forceps.Pincer la poitrine du moustique et la dernière section de l’abdomen a été forceps et se détacher pour isoler le tube digestif. Utilisez des forceps pour enlever la culture et le tube malpighien du tube digestif. La culture est positionnée au pnterior de midgut et gonfle après avoir ingéré de l’eau sucrée.Les tubes malpighiens sont un groupe de tubes excréteurs minces à la jonction du midgut et du hindgut. Placez le maquillage disséqué dans le tube EP avec 200 microlitres stériles tampon PBS et le moudre avec le pasteur de broyage stérile dans le banc propre. Céréales pour charger l’homogénéité à trois illusions de tempo à 50 microlitres de chaque illusion à la plaque d’agar LB et assiette désespérée.Incuber la plaque à 37 degrés pendant un à deux jours jusqu’à ce qu’une seule colonies soit possible. Choisissez des colonies simples dans une fiole conique de 150 millilitres contenant un support de 50 millilitres lb moyen. secouer les bactéries à 37 degrés pendant la nuit.Identification des espèces. Extraire l’ADN TOTO par kit de construction d’ADN génomique bactérien et amplifier 16 SRDNA par PCR. Récupération et purification des fragments d’ADN des produits PCR par l’électrophoresis gel Ambrose et le kit de récupération conduit.Séquençage de l’ADN effectué sur les fragments d’ADN purifiés pour avoir une chaîne de bactéries atteint séquences. Exécuter la recherche de souffle à une requête de la séquence de 16 gènes SRNA d’identifier les bactéries contre les bactéries et l’archée et la base de données. L’identification au niveau de l’espèce a été définie comme supérieure ou égale à 99%16 similitude de séquence SRDNA avec l’entrée bancaire d’équipe la plus proche.L’isolat lui a été attribué au genre correspondant quand est 16 séquence de SRDNA, la similitude était inférieure à 99% et supérieure ou égale au traitement antibiotique de 95% et à la réintroduction de bactérie. peser la quantité requise de pénicilline saccharose et de streptomycine pour nous préparer 10% solution saccharose, y compris essayer 20 unités de pénicilline et les 20 microgrammes de streptomicine par millilitre. Infiltrer les boules de coton dans la solution de saccharose contenant des antibiotiques et placez-les sur le dessus de la tasse en papier contenant du moustique.Couvrir la boule de coton d’une boîte de Pétri de 10 centimètres pour éviter qu’un front de mer ne s’évapore. Remplacer les boules de coton deux fois par jour et nourrir le moustique pendant trois jours consécutifs. Les moustiques sont divisés en deux groupes.Le premier groupe a été placé dans une tasse de moustique sans aucun traitement, n’importe quel docteur de boules de coton avec la croix de 10%So a été donné quotidiennement. Le deuxième groupe a été traité avec des antibiotiques et servir pendant trois jours. Dans chaque groupe, les moustiques Sergei ont été disséqués.Le Mika a été extrait pour l’extraction totale d’ADN et le QPCR a été exécuté utilisant des amorces universelles de bactéries, figure un montre l’expression de 16 ARN dans le groupe témoin et le groupe de traitement antibiotique. Les résultats montrent que le coût ou la réalisation de la pénicilline et de la streptomycine a été un succès. préparer une solution bactérienne, mesure une solution bactérienne dans le virus avec un spectrophotomètre, ajouter une suspension de bactéries OT dans le tube EP.Centrifugeuse la suspension à 5000 RCA pendant cinq minutes à quatre degrés Jeter le supernatant, laver la palette bactéries tente avec tampon stérile PBS. Suspendre à nouveau la palette bactérienne avec 200 microlitres stériles tampon PBS Ajouter 600 microlitres, 10% solution saccharose, 200 microlitres ATP et 200 microlitres suspension bactérienne dans un nouveau tube AP et bien mélanger. Alternativement, les bactéries peuvent être re-suspendues dans la chaleur pour activer votre sang.Préparation du chauffage du sang activé. caillot de sang frais avec tube anticoagulant, prendre deux à trois millilitres de sang frais. centrifugeuse à 1000 pendant 10 minutes à quatre degrés pour séparer le plasma et les cellules sanguines.Recueillir le plasma dans un nouveau tube EP et activer ici activé à un degré 56 pendant une heure. Wash Blast maison à travers votre temps avec tampon PBS stérile. Rincer la maison de dynamitage suspendue avec le plasma activé par chauffage.Assembler la membrane et le système d’alimentation. Tirez la maladie du film au maximum. fixer avec l’anneau en plastique et parafilm lieu de travail pour éviter la fuite lentement ajouter la solution bactérienne préparée à l’unité d’alimentation, au portefeuille maximum.Pour éviter la bulle est tombé d’une direction et sceller l’unité d’alimentation. Connectez l’alimentation électrique. Attendez que la température atteigne 37 degrés Installé l’unité d’alimentation avec solution bactérienne sur la mangeoire.Avant d’alimenter les bactéries moustiques devraient être arrêtés pendant 24 heures pour métaboliser les antibiotiques. Pour l’unité d’alimentation sur la tasse en papier avec des moustiques, puis laisser l’alimentation pendant 90 minutes. Les moustiques pleinement encouragés pourraient être cueillis pour d’autres études.Résultats représentatifs. La figure deux nous montre l’accolade moyenne par moustique. Après l’alimentation de parcelle des antibiotiques traités les moustiques nous voyons le méningosepticum.La figure trois montre l’expression d’une variante des gènes liés au développement 24 heures après la farine de sang contenant le méningosepticum C. Les résultats montrent qu’il n’y a pas de changement significatif dans la production d’œufs du groupe témoin et du groupe de décoloration. Merci pour votre intérêt pour les bactéries ou un essai d’alimentation avec des moustiques traités aux antibiotiques.

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