Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) und dem Science and Technology Plan Project der Provinz Hunan (2019RS1036) unterstützt.

1. Midgut-Sektion und kultivierbare Bakterienisolierung
<ol><li>Bereiten Sie die Mücke für die Zerlegung vor.<ol>
<li>Sammeln Sie die Mücken 7-9 Tage nach der Entstehung mit einem Aspirator. Anästhesisieren Sie die gesammelten Mücken, indem Sie sie 3-5 min einer Temperatur von 4 °C unterziehen und die Mücken in einer eiskalten Petrischale bis zur Zerlegung anbesäufen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilisieren Sie Laborinstrumente und die Mückenoberfläche.<ol>
<li>Sterilisieren Sie ...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

Untersuchungen an Wirt-Mikroben-Wechselwirkungen haben ergeben, dass verschiedene Darmmikroben ihre Wirtsphysiologie über divergierende Mechanismen beeinflussen. Dieser Artikel stellt die Methode vor, um die jeweilige Rolle der Moskito-Darm-Mikrobe zu untersuchen, einschließlich der Sezieren von Mückenmittelgut, Kultivieren von kultivierbaren Darmbakterien, Antibiotika-Behandlung, und Wiedereinführung der Bakterien von Interesse.
Für eine erfolgreiche Antibiotikabehandlung müssen bei der...

Mücken gelten als die wichtigsten Vektoren menschlicher pathogener Krankheiten, die über hundert Krankheitserreger übertragen, darunter das Zika-Virus, das Dengue-Virus und die Plasmodium-Parasiten 1. Wenn Mücken eine Blutmahlzeit nehmen, um Nährstoffe für die Oviposition zu erhalten, können sie versehentlich Krankheitserreger von einem infizierten Wirt über den Verdauungstrakt2aufnehmen. Wichtig ist, dass das Mückenmittelgut, das sowohl bei der Blutmahlzeit als auch beim Eintritt von Krankheitserregern eine zentrale Rolle spielt, ein hochdynamisches Mikrobiom3beherbergt.
Mehrere Studien haben labor- und feldgesammelte Mückenmikrobiota entweder mit einer kulturabhängigen Methode oder einem Bakteriensequenzierungstest4,5,6charakterisiert. Arten wie Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaund Enterococcus sind häufig von Mücken in verschiedenen Studienisoliert 5,7,8,9. Interessanterweise schwankt die Moskitodarmmikrobiota dynamisch sowohl in der Vielfalt der Gemeinschaft als auch in der Menge der Bakterienarten, die von der Entwicklungsphase, der Art, der geografischen Herkunft und dem Fütterungsverhalten betroffen sind4. Studien zeigen, dass die Blutfütterung die gesamte bakterielle Belastung mit einer schnellen Ausdehnung der Arten von Enterobacteriaceae und einer Verringerung der Gesamtvielfalt10,11dramatisch erhöht. Darüber hinaus wird Mückendarmmikrobiota des Larvenstadiums in der Regel ausgerottet, wenn das Insekt während der Pupation und Scheidung einer Metamorphose unterzogen wird; Daher müssen neu entstandene erwachsene Mücken ihre Mikrobiota4wieder bevölkern.
Gut mikrobiota moduliert Insektenphysiologie in verschiedenen Aspekten, einschließlich Nährstoffaufnahme, Immunität, Entwicklung, Reproduktion und Vektorkompetenz12. Axenic Mückenlarven nicht über den ersten Instar entwickeln, während ein Bakterium orale Versorgung rettet Entwicklung, was darauf hindeutet, dass die Mücke Darm Mikrobe ist wichtig für die Larvenentwicklung13,14. Außerdem, Erschöpfung der Darmbakterien verzögert Blutmehl Verdauung und Nährstoffaufnahme, wirkt sich auf die Oozytenreifung, und verringert oviposition15. Darüber hinaus lösen Mücken mit Darmmikroflora höhere Immunantworten im Vergleich zu antibiotikabehandelten Mücken aus, mit ständig erhöhter antimikrobieller Peptidexpression gegen andere Krankheitserreger, um16zu infizieren. Antibiotika werden in der Regel oral verabreicht, um Pan-Darm-Bakterien in diesen Studien zu entfernen, und dann werden Experimente durchgeführt, um den Unterschied zwischen axtischen Mücken und Mücken mit commenalen Mikroben zu vergleichen. Allerdings beherbergt die Mücke Midgut eine vielfältige Gemeinschaft von Mikroben, und jede Bakterienart könnte eine deutliche Wirkung auf die Wirtphysiologie ausüben.
Mückenmikrobiota reguliert Vektorkompetenz mit divergierenden Effekten. Die Kolonisation durch Proteus, isoliert von feldabgeleiteten Mücken von Dengue-endemischen Gebieten, verleiht eine hochregulierte antimikrobielle Peptidexpression und Resistenz gegen Dengue-Virusinfektionen16. Der entomopathogene Pilz Beauveria bassiana aktiviert den Toll- und JAK-STAT-Immunweg gegen eine Arbovirus-Infektion17. Im Gegensatz dazu erleichtert der aus Aedes aegypti midgut isolierte Pilz Talaromyces die Infektion des Dengue-Virus, indem er die Darmtrypsin-Aktivitätmoduliert 18. Darüber hinaus fördert Serratia marcescens die Arbovirus-Übertragung durch ein sekretorisches Protein namens SmEnhancin, das die Mucin-Schicht auf dem Darmepithel von Mückenverdaut 19.
Dieses Verfahren bietet eine systematische und intuitive Methode zur Zerlegung des Mückenmittelguts, zur Isolierung von kulturierbaren Bakterienkolonien, zur Identifizierung der Bakterienarten und zur Wiedereinführung durch orale Fütterung. Es liefert repräsentative Ergebnisse der Blutfütterung mit einem commensal Bakterium, Chryseobacterium Meningosepticum, auf Mücken EierstockEntwicklung und Oviposition.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

Die Mücke Midgut beherbergt ein hochdynamisches Mikrobiom, das den Wirtsstoffwechsel, die Fortpflanzung, die Fitness und die Vektorkompetenz beeinflusst. Es wurden Studien durchgeführt, um die Wirkung von Darmmikroben als Ganzes zu untersuchen; jedoch könnten verschiedene Mikroben unterschiedliche Auswirkungen auf den Wirt ausüben. Dieser Artikel enthält die Methodik, um die Wirkung jeder spezifischen Mückendarmmikrobe und den potenziellen Mechanismus zu untersuchen.
Dieses Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil stellt vor, wie man das Mückenmittelgut seziert, kultivierbare Bakterienkolonien isoliert und Bakterienarten identifiziert. Der zweite Teil sieht das Verfahren zur Erzeugung von antibiotikabehandelten Mücken und zur Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart vor.

Die Mittelguts von Mücken, die mit Antibiotika und ohne Antibiotika behandelt wurden, wurden zur DNA-Extraktion herausgenommen, und qPCR wurde mit universellen bakteriellen Primern durchgeführt. Abbildung 1 zeigt die Expression von bakteriellen 16S rRNA in der Kontrollgruppe und der Antibiotika-Behandlungsgruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass etwa 98% der Darmbakterien entfernt wurden, und die Darmsterilisation von Penicillin und Streptomycin war erfolgreich.
Mit den beschrieb...

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A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos

Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um die Wirkung einzelner Mückendarmbakterien zu untersuchen, einschließlich Isolierung und Identifizierung von Mücken-Mittelgut-anbaufähigen Mikroben, Antibiotika-Erschöpfung von Mückendarmbakterien und Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mosquito Midgut beherbergt eine komplexe Gemeinschaft von Mikroben, die den Wirtsstoffwechsel, Die Fortpflanzung, Fitness und Tierarztkompetenz beeinflussen. Mit jeder Darmmikrobe ist ein anderer Effekt. Dieses Video stellt das Verfahren vor, um die jeweilige Rolle jedes Bakterienstamms oder der Wirtsphysiologie zu untersuchen.Um eine Kultur der Darmbakterienkolonien zu erwerben, sezieren Sie die Mücke Midgut unter sterilem Zustand. Erden Sie das Sezieren midgut, serotologinate, und über die Agarplatte verteilt. Wählen Sie einzelne Kolonien von der Platte und identifizieren Sie die Bakterienarten über ihre 16 SRNA-Gensequenz.Füttern Sie die Mücken mit COD-Emboss, die Antibiotika für aufeinander folgende von drei Tagen enthalten, um Darmmikrobiota zu entfernen. Die Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung kann durch Sezieren des Mittelguts der aseptischen Mücke für Kolonien bildenden Einheit Assay vor den nachfolgenden Extremisten bestätigt werden. Dann wieder bestimmte Bakterienarten, die zuvor aus Demmückendarm durch orale Fütterung Assay isoliert.Die Wirkung von Bakterien auf die Wirtsphysiologie könnte durch den Vergleich der unbehandelten Mücken, antibiotikabehandelten Mücken und der Wiedereinführung spezifischer Zurückhaltung bewertet werden. Mittelgut-Sektion und die kultivierte Bakterienisolierung. Zuerst sammeln Sie die Mücken im Käfig mit einem Aspirator und Zelle der Mücken in der Sammelbox.Anästhesisieren Sie die Mücken, indem Sie eine Temperatur von 4 Grad für drei bis fünf Minuten unterwerfen. Halten Sie die Mücken anästhetisiert, indem Sie sie in eine eiskalte Petrischale legen. Desinfizieren Sie die Bank, sezieren Sie Mikroskop, und Zange durch Sprühen 75%Ethanol, um eine Kontamination durch Bakterien aus der Umwelt zu vermeiden.Oberfläche sterilisieren die Mücke durch Verkleben und Schütteln in 75%Ethanol für drei Minuten und spülen zweimal mit PBS-Puffer. Bisect die Mücke separat auf einem sterilen Glasrutsche, die Ihren Tropfen PBS enthält. Entfernen Sie vorsichtig die Beine, Flügel und den Kopf der Mücke mit Zangen.Klemmen Sie die Brust der Mücke und der letzte Abschnitt des Bauches war Zange und ziehen Sie auseinander, um den Verdauungstrakt zu isolieren. Verwenden Sie Zangen, um die Ernte und das Malpighian-Rohr aus dem Verdauungstrakt zu entfernen. Die Ernte wird am Pnterior des Mittelguts positioniert und wölbt sich nach der Einnahme von Zuckerwasser.Malpighian Rohre sind Gruppe von schlanken Ausscheidungsrohren an der Kreuzung von Midgut und Hintergut. Das sezierte Make-up mit 200 Mikroliter sterilem PBS-Puffer in EP-Rohr geben und mit dem sterilmahlenden Pastor in die saubere Bank schleifen. Getreide, um die Homogenate auf drei Tempowahn bei 50 Mikroliter jeder Täuschung auf die LB-Agarplatte und verzweifelte Platte zu laden.Inkubieren Sie die Platte ein bis zwei Tage lang als 37 Grad, bis einzelne Kolonien möglich sind. Wählen Sie einzelne Kolonien in einen 150 Milliliter konischen Kolben mit 50 Milliliter lb BHs Medium. schütteln Sie die Bakterien bei 37 Grad über Nacht.Artenidentifikation. Extrahieren Sie TOTO DNA aus bakteriellem genomischem DNA-Bausatz und verstärken Sie 16 SRDNA per PCR. Rückgewinnung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus PCR-Produkten durch Ambrose-Gel-Elektrophorese und das angetriebene Recovery-Kit.Führte DNA-Sequenzierung an den gereinigten DNA-Fragmenten durch, um eine erreichte Bakterienkettensequenz zu haben. Führen Sie die Explosionssuche zu einer Abfrage der 16 SRNA-Gensequenz aus, in der die Bakterien gegen die Bakterien und die Archaeen und die Datenbank identifiziert werden. Die Identifikation auf Artenebene wurde als größer oder gleich 99%16 SRDNA-Sequenzähnlichkeit mit dem nächstgelegenen Teambankeintrag definiert.Das Isolat wurde der entsprechenden Gattung 16 SRDNA-Sequenz zugeordnet, die Ähnlichkeit war weniger als 99% und größer als oder gleich 95% Antibiotika-Behandlung und Bakterium Wiedereinführung. wiegen Sie die erforderliche Menge an Saccharose Penicillin und Streptomycin, um uns 10%Saccharose-Lösung vorzubereiten, einschließlich des Ausprobierens von 20 Einheiten Penicillin und der 20 Mikrogramm Streptomycin pro Milliliter. Infiltrieren Sie die Baumwollkugeln in die Saccharoselösung, die Antibiotika enthält, und legen Sie sie über die Oberseite des Papierbechers, der Mücken enthält.Bedecken Sie die Baumwollkugel mit einer 10 Zentimeter langen Petrischale, um zu verhindern, dass eine Uferpromenade verdunstet. Ersetzen Sie die Baumwollkugeln zweimal täglich und füttern Sie die Mücke für aufeinander folgenden von drei Tagen. Mücken werden in zwei Gruppen eingeteilt.Die erste Gruppe wurde in einem Mückenbecher ohne Jede Behandlung platziert, jeder Baumwollkugeln Arzt mit 10%So Kreuz wurde täglich gegeben. Die zweite Gruppe wurde mit Antibiotika behandelt und diente drei Tage lang. In jeder Gruppe wurden Sergei Mücken seziert.Die Mika wurde für die gesamte DNA-Extraktion extrahiert und die QPCR wurde mit universellen Bakterienprimern durchgeführt, Abbildung 1 zeigt die Expression von 16 SRNA in der Kontrollgruppe und Antibiotika-Behandlungsgruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass die Kosten oder Realisierung von Penicillin und Streptomycin erfolgreich war. bakterielle Lösung vorzubereiten, misst eine Bakterienlösung im Virus mit einem Spektralphotometer, fügen Sie eine OT-Bakteriensuspension in EP-Röhre.Zentrifugieren Sie die Suspension bei 5.000 CINCH für fünf Minuten bei vier Grad Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Bakterienpalette versucht mit sterilen PBS Puffer. Setzen Sie die Bakterienpalette mit 200 Mikroliter sterilen PBS-Puffer Wiederaufheben Fügen Sie 600 Mikroliter, 10% Saccharoselösung, 200 Mikroliter ATP und 200 Mikroliter bakterielle Suspension in ein neues AP-Rohr und mischen Sie gut. Alternativ können die Bakterien in DerHitze wieder suspendiert werden, um Ihr Blut zu aktivieren.Vorbereitung der Erwärmung aktiviertes Blut. Gerinnsel frisches Blut mit Gerinnungsmittelröhre, nehmen Sie zwei bis drei Milliliter frisches Blut. Zentrifuge bei 1000 für 10 Minuten bei vier Grad, um Plasma und Blutzellen zu trennen.Sammeln Sie das Plasma in eine neue EP-Röhre und aktivieren Sie hierin aktiviert bei einem 56 Grad für eine Stunde. Waschen Sie Blast House durch Ihre Zeit mit sterilem PBS-Puffer. Spülen Sie abgehängtes Strahlhaus mit heizaktiviertem Plasma.Membran und Zuführsystem montieren. Ziehen Sie die Filmkrankheit auf das Maximum. fix mit dem Kunststoffring und Arbeitsplatz Parafilm, um zu vermeiden, dass das Leck langsam fügen Sie die vorbereitete bakterielle Lösung auf die Feeder-Einheit, um die maximale Brieftasche.Um zu vermeiden, dass die Blase aus einer Richtung fiel und versiegeln Sie die Feedereinheit. Schließen Sie das Netzteil an. Warten Sie, bis die Temperatur 37 Grad erreicht Installiert die Feedereinheit mit Bakterienlösung auf dem Feeder installiert.Vor der Fütterung von Bakterien Mücken sollten für 24 Stunden gestoppt werden, um Antibiotika zu verstoffwechseln. Für die Futtereinheit auf dem Papierbecher mit Mücken, dann erlauben Fütterung für 90 Minuten. Voll geförderte Mücken könnten für weitere Studien ausgewählt werden.Repräsentative Ergebnisse. Abbildung zwei zeigt uns die durchschnittliche Auszeichnung pro Mücke. Nach der Fütterung von Antibiotika behandelt die Mücken sehen wir Meningosepticum.Abbildung 3 zeigt die Expression einer Variante entwicklungsbezogenen Gene 24 Stunden nach der Blutmahlzeit, die das C-Meningoseptikum enthält. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Eiproduktion der Kontrollgruppe und der Verblassengruppe nicht wesentlich verändert. Vielen Dank für Ihr Interesse an Bakterien oder einem Fütterungsaufsatz mit antibiotikabehandelten Mücken.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

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RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

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