Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס' 81902094, 81600497) ופרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של מחוז הונאן (2019RS1036).

1. פירוק מידגוט ובידוד חיידקים הניתנים לפולחן
<ol><li>הכן את היתוש לפירוק.<ol>
<li>לאסוף את היתושים 7-9 ימים לאחר הופעתו עם שונא. להניא את היתושים שנאספו על ידי כך שהם נושאים אותם לטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות ולשמור על היתושים מנומסים בצלחת פטרי קרה כקרח עד לפירוק.</li>
	</...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

מחקרים על אינטראקציות בין חיידקי מארחים מצאו כי מיקרובים שונים במעיים משפיעים על הפיזיולוגיה המארחת שלהם באמצעות מנגנונים שונים. מאמר זה מציג את השיטה לחקור את התפקיד המתאים של חיידקים מעיים יתוש, כולל ניתוח midgut יתוש, culturing חיידקים מעיים cultivable, טיפול אנטיביוטי, ו reintroducing חיידקים של עניין.</...

יתושים נחשבים וקטורים החשובים ביותר של מחלות פתוגנית אנושית, העברת מעל מאה פתוגנים כולל וירוס זיקה, וירוס דנגה, טפילי Plasmodium 1. כאשר יתושים לקחת ארוחת דם כדי לרכוש חומרים מזינים עבור oviposition, הם יכולים בטעות בלע פתוגנים ממארח נגוע דרך מערכת העיכול2. חשוב לציין, midgut יתוש, אשר ממלא תפקיד מרכזי הן בעיכול ארוחת דם וכניסה פתוגן, נמלים microbiome דינמי מאוד3.
מספר מחקרים אפיינו מיקרוביוטה יתושים שנצברה במעבדה ואספו בשדה בשיטה התלויה בתרבות אובחיידק רצף 4,5,6. מינים כמו פנטואה, סראטיה, קלבסילה, אליזבתקינגיה, ו Enterococcus מבודדים בדרך כללמיתושים במחקרים שונים 5,7,8,9. מעניין, microbiota מעיים יתוש תנודות באופן דינמי הן המגוון הקהילתי ואת כמות מינים חיידקים, מושפע שלב הפיתוח, מינים, מוצא גיאוגרפי, והתנהגותהאכלה 4. מחקרים מראים כי האכלת דם מגבירה באופן דרמטי את העומס החיידקי הכולל עם התרחבות מהירה של מינים מ Enterobacteriaceae וירידה במגוון הכולל 10,11. בנוסף, microbiota מעיים יתוש של שלב הזחל הוא בדרך כלל נמחק כאשר החרק עובר מטמורפוזה במהלך גורים ואקלוסיון; לכן, יתושים בוגרים חדשים צריכים לאכלס מחדש את המיקרוביוטהשלהם 4.
מיקרוביוטה מעיים לווסת פיזיולוגיה חרקים בהיבטים שונים, כולל ספיגת חומרים מזינים, חסינות, פיתוח, רבייה, ויכולתוקטורית 12. זחלי יתושים Axenic להיכשל לפתח מעבר instar הראשון בעוד חיידקים אוראלי אספקה מצילה את הפיתוח, המציין כי החיידק מעיים יתוש חיוני לפיתוחזחלים 13,14. חוץ מזה, דלדול של חיידקי מעיים מעכב את העיכול של ארוחת הדם וספיגת חומרים מזינים, משפיע על התבגרות ביציט, ומפחית oviposition15. בנוסף, יתושים עם מיקרופלורה במעיים לעורר תגובות חיסוניות גבוהות יותר בהשוואה יתושים שטופלו באנטיביוטיקה, עם ביטוי פפטיד מיקרוביאלי גבוה כל הזמן נגד פתוגנים אחריםלהדביק 16. אנטיביוטיקה ניתנת בדרך כלל דרך הפה כדי להסיר חיידקים מעיים פאן במחקרים אלה, ולאחר מכן נערכים ניסויים כדי להשוות את ההבדל בין יתושים axenic ויתושים עם חיידקים commensal. עם זאת, היתוש midgut נמלים קהילה מגוונת של חיידקים, וכל מין חיידקים יכול להפעיל השפעה ברורה כלפי הפיזיולוגיה המארחת.
מיקרוביוטה יתוש מווסת יכולת וקטורית עם השפעות שונות. קולוניזציה על ידי Proteus מבודד יתושים נגזר שדה של אזורים דנגה אנדמי מקנה ביטוי פפטיד מיקרוביאלית מפוקחת והתנגדות נגד זיהום וירוס דנגה16. הפטריה entomopathogenic Beauveria bassiana מפעילה את מסלול החיסון אגרה ו JAK-STAT נגד זיהום arbovirus17. לעומת זאת, הפטרייה Talaromyces מבודד Aedes aegypti midgut מקל על זיהום וירוס דנגה על ידי לווסת פעילות ניסיוןהמעיים 18. בנוסף, Serratia marcescens מקדם שידור arbovirus באמצעות חלבון הפרשה בשם SmEnhancin, אשר מעכל את שכבת הריר על אפיתל מעיים שליתושים 19.
הליך זה מספק שיטה שיטתית ואינטואיטיבית לניתוק של מידגוט היתושים, בידוד מושבות חיידקים הניתנות לפולחן, זיהוי מיני החיידקים והפעלה מחדש באמצעות האכלה אוראלית. הוא מספק תוצאות מייצגות של הזנת דם עם חיידק commensal, מנלינוספטיום Chryseobacterium, על התפתחות השחלות יתושים וoviposition.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

היתוש midgut נמלים microbiome דינמי מאוד המשפיע על חילוף החומרים המארח, רבייה, כושר, ויכולת וקטורית. מחקרים נערכו כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים במעיים ככלל; עם זאת, חיידקים שונים יכולים להפעיל השפעות ברורות כלפי המארח. מאמר זה מספק את המתודולוגיה כדי ללמוד את ההשפעה של כל מיקרוב ספציפי מעיים יתוש ואת המנגנון הפוטנציאלי.
פרוטוקול זה מכיל שני חלקים. החלק הראשון מציג כיצד לנתח את מידגוט היתוש, לבודד מושבות חיידקים cultivable, ולזהות מינים חיידקים. החלק השני מספק את ההליך כדי ליצור יתושים שטופלו באנטיביוטיקה ולהריח מחדש מין אחד ספציפי חיידקים.

האמצעים של יתושים שטופלו באנטיביוטיקה וללא אנטיביוטיקה הוצאו לחילוץ DNA, qPCR בוצע עם פריימרים חיידקים אוניברסליים. איור 1 מראה את הביטוי של חיידקים 16S rRNA בקבוצת הבקרה וקבוצה טיפול אנטיביוטי. התוצאות מראות כי כ 98% של חיידקי המעי הוסרו, ואת עיקור המעיים של פניצילין וסטרפטומיצין היה מו?...

Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

תסכולת הזנה דרך הפה חיידקית עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה

מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים בודדים מעיים יתוש, כולל בידוד וזיהוי של חיידקים midgut יתושים, דלדול אנטיביוטיקה של חיידקים מעיים יתוש, ולהחזן מחדש מין אחד חיידקים ספציפיים.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

מידגוט יתושים מטפח קהילה מורכבת של מיקרואורגניזמים המשפיעים על חילוף החומרים המארח, רבייה, כושר ויכולת וטרינרית. עם כל חיידק מעיים הוא אפקט שונה. וידאו זה מציג את ההליך כדי ללמוד את התפקיד המתאים של כל זן חיידקים או פיזיולוגיה המארח.כדי לרכוש תרבות של מושבות חיידקיות במעיים, לנתח את midgut יתוש במצב סטרילי. לקרקע את מידגוט לנתח, serotologinate, ולהפיץ על צלחת אגר. בחר מושבות בודדות מהצלחת, וזהה את מיני החיידקים באמצעות רצף הגנים שלהם 16 SRNA.להאכיל את היתושים עם הבלטת COD המכיל אנטיביוטיקה במשך שלושה ימים רצופים כדי להסיר microbiota המעיים. האפקטיביות של טיפול אנטיביוטי ניתן לאשר על ידי ניתוח midgut של יתוש aseptic עבור המושבה להרכיב יחידה assay לפני הקיצוניים הבאים. לאחר מכן הציגו מחדש מיני חיידקים ספציפיים שבודדו בעבר ממעי יתושים באמצעות האכלה אוראלית.ניתן להעריך את השפעת החיידקים על הפיזיולוגיה המארחת על ידי השוואת היתושים שלא טופלו, יתושים שטופלו באנטיביוטיקה, והיתושים הציגו מחדש איפוק ספציפי. ניתוח מידגוט ובידוד חיידקים מטפחים. ראשית, לאסוף את היתושים בכלוב עם שאפה תא היתושים בתיבת האיסוף.הרדמה של היתושים על ידי ירידה לטמפרטורה של 4 מעלות למשך שלוש עד חמש דקות. שמור את היתושים הרדמה על ידי הצבת אותם בצלחת פטרי קר כקרח. לחטא את הספסל, לנתח מיקרוסקופ, מדפים על ידי ריסוס 75% אתנול, כדי למנוע זיהום על ידי חיידקים מהסביבה.משטח לערפל את היתוש על ידי הקשה לנער אותם 75% אתנול במשך שלוש דקות ולשטוף פעמיים עם חיץ PBS. חצי את היתוש בנפרד על מגלשת זכוכית סטרילית המכילה את טיפת PBS שלך. בזהירות להסיר את הרגליים, הכנפיים ואת הראש של היתוש באמצעות מדפים.מהדקים את החזה של היתוש ואת החלק האחרון של הבטן היה מלקחיים להתפרק כדי לבודד את מערכת העיכול. השתמש מדפים כדי להסיר את היבול ואת הצינור malpighian ממערכת העיכול. היבול ממוקם ב pnterior של מידגוט ובליטות לאחר בליעת מי סוכר.צינורות מלפיגיים הם קבוצה של צינורות הפרשה דקים בצומת של מידגוט והינדגוט. מניחים את האיפור נותק לתוך צינור EP עם 200 מיקרוליטר חיץ PBS סטרילי ולטחון אותו עם הכומר שחיקה סטרילית בספסל נקי. דגנים כדי לטעון את הומוגנית לשלוש הזיות קצב ב 50 microliters של כל אשליה לצלחת אגר LB וצלחת נואשת.הדגירה את הצלחת כמו 37 מעלות במשך יום עד יומיים עד מושבות בודדות אפשריות. בחר מושבות בודדות לתוך בקבוק חרוט 150 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר lb חזיות בינוני. לנער את החיידקים ב 37 מעלות לילה.זיהוי מינים. לחלץ DNA טוטו על ידי ערכת בניית DNA גנומי חיידקי להגביר 16 SRDNA על ידי PCR. התאוששות וטיהור של שברי DNA ממוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אמברוז ערכת התאוששות נסע.ביצע ריצוף דנ"א על שברי הדנ"א המטוהרים כדי לקבל רצפי שרשרת חיידקים שהושגו. הפעל חיפוש פיצוץ לשאילתה רצף הגנים 16 SRNA של לזהות את החיידקים נגד החיידקים ואת הארכאי ואת מסד הנתונים. זיהוי לרמת המין הוגדר כגדול או שווה ל- 99%16 דמיון רצף SRDNA לערך בנק הצוות הקרוב ביותר.לבודד הוקצה אותו המתאים, סוג כאשר הוא 16 SRDNA רצף, הדמיון היה פחות מ 99%, גדול או שווה ל 95% טיפול אנטיביוטי חיידקים מחדש. לשקול את הכמות הנדרשת של פניצילין סוכרוז סטרפטומיצין להכין לנו 10% פתרון סוכרוז, כולל מנסה 20 יחידות של פניצילין ואת 20 מיקרוגרם של סטרפטומיצין למיליליטר. לחדור את כדורי כותנה בתסמת סוכרוז המכיל אנטיביוטיקה ולה מניחים אותו על החלק העליון של נייר המכיל יתוש.מכסים את כדור הכותנה עם צלחת פטרי 10 ס"מ כדי למנוע קו המים להתאדות. החלף את כדורי הכותנה פעמיים ביום ולהאכיל את היתוש במשך שלושה ימים רצופים. יתושים מחולקים לשתי קבוצות.הקבוצה הראשונה הונחה ב יתושים ללא כל טיפול, כל רופא כדורי כותנה עם 10% אז הצלב ניתן מדי יום. הקבוצה השנייה טופלה באנטיביוטיקה ומגישה במשך שלושה ימים. בכל קבוצה נותפו יתושים של סרגיי.מיקה חולץ עבור מיצוי DNA הכולל QPCR בוצע באמצעות פריימרים חיידקים אוניברסליים, איור אחד מראה את הביטוי של 16 SRNA בקבוצת הביקורת ואת קבוצת הטיפול באנטיביוטיקה. התוצאות מראות כי העלות או המימוש של פניצילין וסטרפטומיצין היה מוצלח. להכין פתרון חיידקי, מודד פתרון חיידקים בנגיף עם ספקטרופוטומטר, להוסיף השעיה אחת חיידקים OT לתוך צינור EP.צנטריפוגה ההשעיה ב 5, 000 RCA במשך חמש דקות בארבע מעלות להשליך את supernatant, לשטוף את משטח החיידקים מנסה עם חיץ PBS סטרילי. השהה מחדש את משטח החיידקים עם חיץ PBS סטרילי 200 מיקרוליטר הוסף 600 מיקרוליטר, 10% פתרון סוכרוז, 200 מיקרוליטר ATP ו 200 מתלים חיידקיים microliter לתוך צינור AP חדש לערבב היטב. לחלופין, ניתן להשעות מחדש את החיידקים בחום ולהפעיל את הדם שלך.הכנת דם פעיל לחימום. קריש דם טרי עם צינור נוגד קרישה, לקחת שניים עד שלושה מיליליטר של דם טרי. צנטריפוגה ב 1000 במשך 10 דקות בארבע מעלות כדי להפריד פלזמה ותאי דם.לאסוף את הפלזמה לתוך צינור EP חדש וכאן להפעיל מופעל ב 56 מעלות במשך שעה אחת. לשטוף את בית הפיצוץ דרך הזמנים שלך עם חיץ PBS סטרילי. לשטוף בית פיצוץ מושעה עם פלזמה מופעלת חימום.להרכיב קרום מערכת האכלה. משוך את מחלת הסרט למקסימום. לתקן עם טבעת פלסטיק פרפילם במקום העבודה, כדי למנוע את הדליפה לאט להוסיף את הפתרון החיידקי מוכן ליחידת המאכיל, לארנק המרבי.כדי למנוע את הבועה נפלה מכיוון אחד ולאטום את יחידת ההזנה. חבר את ספק הכוח. המתן עד שהטמפרטורה תגיע ל-37 מעלות התקנת יחידת ההזנה עם תסכולת חיידקים על המאכיל.לפני האכלת יתושים חיידקים יש לעצור במשך 24 שעות כדי לעכל אנטיביוטיקה. עבור יחידת ההזנה על הנייר עם יתושים, ולאחר מכן לאפשר האכלה במשך 90 דקות. יתושים מעודדים לחלוטין ניתן לבחור למחקרים נוספים.תוצאות מייצגות. איור 2 מראה לנו את השבחים הממוצעים לכל יתוש. לאחר עלילה האכלה של אנטיביוטיקה טיפלו יתושים אנו רואים מנינגומפטיקום.איור 3 מציג את הביטוי של גנים הקשורים להתפתחות וריאנט 24 שעות לאחר ארוחת הדם המכילה את קרום המוח C. התוצאות מראות כי אין שינוי משמעותי בייצור הביצים של קבוצת הביקורת והקבוצה הדהויה. תודה על העניין שלך בחיידקים או חיבור האכלה עם יתושים מטופלים באנטיביוטיקה.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

הזרקת. עוברים stephensi ליצור מלריה עמידים יתושים

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

למנוע את התפשטות המלריה וקדחת דנגי באמצעות יתושים מהונדסים גנטית

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

הפרוטוקולים של זיהום אוראלי של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

זיהום חיידקי הפה ו Shedding ב דרוזופילה melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...