Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), e dal Science and Technology Plan Project della provincia di Hunan (2019RS1036).

1. dissezione midgut e isolamento batterico cultivable bacteria isolation
<ol><li>Preparare la zanzara per la dissezione.<ol>
<li>Raccogliere le zanzare 7-9 giorni dopo l'emergere con un aspiratore. Anestetizzare le zanzare raccolte sottoponendole a una temperatura di 4 gradi centigradi per 3-5 min e mantenere le zanzare anestetizzate in un piatto Petri ghiacciato fino alla dissezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilizzare gli strumenti di laboratorio e la superficie della zanzara.<ol>
<l...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

La ricerca sulle interazioni ospite-microbi ha scoperto che diversi microbi intestinali influenzano la loro fisiologia ospite attraverso meccanismi divergenti. Questo articolo introduce il metodo per studiare il rispettivo ruolo del microbo intestinale della zanzara, tra cui sezionare la zanzara midgut, culturing batteri intestinali culti, trattamento antibiotico, e reintrodurre i batteri di interesse.
Per un trattamento antibiotico di successo, i seguenti dettagli devono essere considerati ne...

Le zanzare sono considerate i vettori più importanti delle malattie patogene umane, trasmettendo oltre un centinaio di patogeni tra cui il virus zoika, il virus Dengue e i parassiti del Plasmodium 1. Quando le zanzare prendono un pasto di sangue per acquisire nutrienti per l'oviposizione, possono accidentalmente ingerire agenti patogeni da un ospite infetto tramite il tratto digestivo2. È importante sottolineare che la zanzara midgut, che svolge un ruolo fondamentale sia nella digestione dei pasti sanguigni che nell'ingresso di agenti patogeni, ospita un microbiomaaltamente dinamico 3.
Diversi studi hanno caratterizzato il microbiota di zanzara allevato in laboratorio e raccolto sul campo utilizzando un metodo dipendente dalla coltura o un asquencing di sequenziamentobatterico 4,5,6. Specie tra cui Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, e Enterococcus sono comunemente isolati dalle zanzare in varistudi 5,7,8,9. È interessante notare che il microbiota dell'intestino di zanzara fluttua dinamicamente sia nella diversità della comunità che nella quantità di specie batteriche, influenzate dalla fase di sviluppo, dalle specie, dall'origine geografica e dal comportamento alimentare4. Gli studi dimostrano che l'alimentazione del sangue aumenta drammaticamente il carico batterico totale con una rapida espansione delle specie da Enterobacteriaceae e una riduzione della diversitàcomplessiva 10,11. Inoltre, il microbiota intestinale della zanzara dello stadio larvale viene solitamente sradicato quando l'insetto subisce la metamorfosi durante la pupazione e l'eclosione; quindi, le zanzare adulte appena emerse hanno bisogno di ripopolare il loro microbiota4.
Il microbiota intestinale modula la fisiologia degli insetti in vari aspetti, tra cui l'assorbimento dei nutrienti, l'immunità, lo sviluppo, la riproduzione e la competenzavettoriale 12. Le larve di zanzara ascia non riescono a svilupparsi oltre la prima instar mentre un approvvigionamento orale batterico salva lo sviluppo, indicando che il microbo intestinale della zanzara è essenziale per lo sviluppo larvale13,14. Inoltre, l'esaurimento dei batteri intestinali ritarda la digestione dei pasti nel sangue e l'assorbimento dei nutrienti, influisce sulla maturazione degli oociti e diminuisce l'oviposizione15. Inoltre, le zanzare con microflora intestinale suscitano risposte immunitarie più elevate rispetto alle zanzare trattate con antibiotici, con espressione di peptidi antimicrobici costantemente elevata contro altri patogeni perinfettare 16. Gli antibiotici sono di solito somministrati per via orale per rimuovere i batteri intestinali pan in questi studi, e poi vengono condotti esperimenti per confrontare la differenza tra zanzare asceniche e zanzare con microbi commensal. Tuttavia, la zanzara midgut ospita una comunità diversificata di microbi, e ogni specie di batteri potrebbe esercitare un effetto distinto verso la fisiologia ospite.
Il microbiota delle zanzare regola la competenza vettoriale con effetti divergenti. La colonizzazione da parte di Proteus isolato dalle zanzare derivate dal campo delle aree dengue-endemiche conferisce l'espressione di peptidi antimicrobici e la resistenza contro l'infezione da virus dengue16. Il fungo entomopatogenico Beauveria bassiana attiva il percorso immunitario Toll e JAK-STAT contro l'infezione da arbovirus17. Al contrario, il fungo Talaromyces isolato da Aedes aegypti midgut facilita l'infezione da virus dengue modulando l'attività di trypsinaintestinale 18. Inoltre, Serratia marcescens promuove la trasmissione dell'arbovirus attraverso una proteina secretoria chiamata SmEnhancin, che digerisce lo strato di mucina sull'epitelio intestinale delle zanzare19.
Questa procedura fornisce un metodo sistematico e intuitivo per la dissezione della zanzara midgut, l'isolamento delle colonie di batteri cultizzabili, l'identificazione delle specie batteriche e la reintroduzione tramite alimentazione orale. Fornisce risultati rappresentativi dell'alimentazione del sangue con un batterio commensal, Chryseobacterium meningosepticum, sullo sviluppo dell'ovaio delle zanzare e sull'oviposizione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

La zanzara midgut ospita un microbioma altamente dinamico che influenza il metabolismo dell'ospite, la riproduzione, la forma fisica e la competenza vettoriale. Sono stati condotti studi per studiare l'effetto dei microbi intestinali nel loro complesso; tuttavia, microbi diversi potrebbero esercitare effetti distinti verso l'ospite. Questo articolo fornisce la metodologia per studiare l'effetto di ogni microbo specifico dell'intestino di zanzara e il potenziale meccanismo.
Questo protocollo contiene due parti. La prima parte introduce come sezionare la zanzara midgut, isolare colonie batteriche cultivable, e identificare le specie di batteri. La seconda parte fornisce la procedura per generare zanzare trattate con antibiotici e reintrodurre una specie di batteri specifici.

I midguts di zanzare trattate con antibiotici e senza antibiotici sono stati prelevati per l'estrazione del DNA, e qPCR è stato eseguito con primer batterici universali. La figura 1 mostra l'espressione del rRNA 16S batterico nel gruppo di controllo e nel gruppo di trattamento antibiotico. I risultati mostrano che circa il 98% dei batteri intestinali sono stati rimossi e la sterilizzazione intestinale della penicillina e della streptomicina ha avuto successo.
Con i metodi des...

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A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

Un saggio di alimentazione orale batterico con zanzare trattate con antibiotici

Questo articolo presenta un protocollo per studiare l'effetto dei singoli batteri dell'intestino di zanzara, tra cui l'isolamento e l'identificazione di microbi cultivable delle zanzare, l'esaurimento antibiotico dei batteri dell'intestino di zanzara e reintrodurre una specie di batteri specifici.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mosquito midgut ospita una complessa comunità di microbi che influenzano il metabolismo dell'ospite, la riproduzione, la forma fisica e la competenza veterinaria. Con ogni microbo intestinale è un effetto diverso. Questo video introduce la procedura per studiare il rispettivo ruolo di ogni ceppo batterico o fisiologia ospite.Per acquisire una coltura di colonie batteriche intestinali, sezionare il midgut della zanzara in condizioni sterili. Macinate la midgut sezionata, serotologinate e sparpanate sul piatto di agar. Scegli singole colonie dalla piastra e identifica le specie di batteri attraverso la loro sequenza genica di 16 SRNA.Nutrire le zanzare con goffratura COD contenente antibiotici per un periodo consecutivo di tre giorni per rimuovere il microbiota intestinale. L'efficacia del trattamento antibiotico può essere confermata sezionando il midgut della zanzara asettica per il test dell'unità di formazione della colonia prima dei successivi estremisti. Quindi reintrodurre specifiche specie di batteri che in precedenza si isolavano dall'intestino delle zanzare tramite test di alimentazione orale.L'effetto dei batteri sulla fisiologia dell'ospite potrebbe essere valutato confrontando le zanzare non trattate, le zanzare trattate con antibiotici e le zanzare reintrodotta un contenimento specifico. Dissezione del midgut e isolamento batterica coltivabile. Per cominciare, raccogli le zanzare in gabbia con un aspiratore e celli le zanzare nella scatola di raccolta.Anestetizza le zanzare sottosondo una temperatura di 4 gradi per tre o cinque minuti. Mantenere le zanzare anestetizzate mettendole in una piastra di Petri ghiacciata. Disinfettare il banco, sezionando il microscopio e le bombolette spruzzando il 75% di etanolo per evitare la contaminazione da batteri dall'ambiente.Sterilizzare in superficie la zanzara nastrandole e scuotendole al 75% di etanolo per tre minuti e risciacquare due volte con tampone PBS. Bisect la zanzara separatamente su uno scivolo di vetro sterile contenente la goccia di PBS. Rimuovere con cura le gambe, le ali e la testa della zanzara usando le forcep.Bloccare il torace della zanzara e l'ultima sezione dell'addome era pinza e separarsi per isolare il tratto digestivo. Utilizzare le forcep per rimuovere il raccolto e il tubo malpighiano dal tratto digestivo. Il raccolto viene posizionato sul pnterior di midgut e rigonfiamenti dopo aver ingerito acqua zuccherata.I tubi malpighiani sono un gruppo di tubi escretori sottili sulla giunzione di midgut e hindgut. Mettere il trucco sezionato in tubo EP con tampone PBS sterile da 200 microlitri e macinarlo con il pastore di macinazione sterile nella panca pulita. Cereali per caricare l'omogeneato a tre delusioni di tempo a 50 microlitri di ogni illusione sul piatto di agar LB e piatto disperato.Incubare la piastra come 37 gradi per uno o due giorni fino a quando le singole colonie sono fattibili. Raccogliere singole colonie in un pallone conico da 150 millilitri contenente 50 milliliter lb bras medium. scuotere i batteri a 37 gradi durante la notte.Identificazione delle specie. Estrarre il DNA TOTO dal kit di costruzione del DNA genomico batterico e amplificare 16 SRDNA da PCR. Recupero e purificazione dei frammenti di DNA dai prodotti PCR mediante elettroforesi in gel ambrogio e kit di recupero guidato.Ha eseguito il sequenziamento del DNA sui frammenti di DNA purificati per avere una sequenza di catene batteriche raggiunta. Esegui la ricerca dell'esplosione per una query sulla sequenza genica di 16 SRNA di identificare i batteri contro i batteri e l'archea e il database. L'identificazione al livello della specie è stata definita come maggiore o uguale alla somiglianza della sequenza SRDNA del 99%16 con l'ingresso bancario della squadra più vicino.L'isolato è stato assegnato al genere corrispondente, quando è di 16 sequenze SRDNA, la somiglianza era inferiore al 99% e maggiore o uguale al 95% di trattamento antibiotico e ri-introduzione del batterio. pesare la quantità richiesta di penicillina di saccarosio e streptomicina per prepararci la soluzione di saccarosio al 10%, incluso provare 20 unità di penicillina e 20 microgrammi di streptomicina per millilitro. Infiltrarsi nei batuffoli di cotone nella soluzione di saccarosio contenente antibiotici e posizionarlo sopra la parte superiore del foglio di carta contenente zanzara.Coprire il batuffolo di cotone con una piastra di Petri di 10 centimetri per evitare che un lungomare evapori. Sostituire i batuffoli di cotone due volte al giorno e nutrire la zanzara per un periodo consecutivo di tre giorni. Le zanzare sono divise in due gruppi.Il primo gruppo è stato collocato in una tazza di zanzara senza alcun trattamento, qualsiasi medico batuffolo di cotone con 10%Quindi la croce è stata data ogni giorno. Il secondo gruppo è stato trattato con antibiotici e servire per tre giorni. In ogni gruppo, le zanzare Sergei sono state sezionate.La Mika è stata estratta per l'estrazione totale del DNA e il QPCR è stato eseguito utilizzando primer di batteri universali, la figura uno mostra l'espressione di 16 SRNA nel gruppo di controllo e nel gruppo di trattamento antibiotico. I risultati mostrano che il costo o la realizzazione della penicillina e della streptomicina ha avuto successo. preparare una soluzione batterica, misurare una soluzione batterica nel virus con uno spettrofotometro, aggiungere una sospensione batterica OT nel tubo EP.Centrifugare la sospensione a 5.000 RCA per cinque minuti a quattro gradi Scartare il supernatante, lavare i tentativi di pallet batterici con tampone PBS sterile. Sospendere di nuovo il pallet batterico con tampone PBS sterile da 200 microlitri Aggiungere 600 microlitri, soluzione di saccarosio al 10%, 200 microlitri ATP e sospensione batterica a 200 microlitri in un nuovo tubo AP e mescolare bene. In alternativa, i batteri possono essere sospesi di calore per attivare il sangue.Preparazione del riscaldamento del sangue attivato. coagulare sangue fresco con tubo anticoagulante, assumere da due a tre millilitri di sangue fresco. centrifuga a 1000 per 10 minuti a quattro gradi per separare plasma e cellule del sangue.Raccogliere il plasma in un nuovo tubo EP e attivare attivato a 56 gradi per un'ora. Lavare blast house attraverso i tempi con tampone PBS sterile. Risciacquare l'esplosione sospesa con plasma attivato dal riscaldamento.Assemblare membrana e sistema di alimentazione. Tirare la malattia del film al massimo. fissare con l'anello di plastica e il parafilm del posto di lavoro per evitare perdite aggiungere lentamente la soluzione batterica preparata all'unità di alimentazione, al portafoglio massimo.Per evitare che la bolla cadesse da una direzione e sigillare l'unità di alimentazione. Collegare l'alimentatore. Attendere che la temperatura raggiunga i 37 gradi Installato l'unità di alimentazione con soluzione batteria sull'alimentatore.Prima di nutrire i batteri le zanzare devono essere fermate per 24 ore per metabolizzare gli antibiotici. Per l'unità di alimentazione sulla tazza di carta con zanzare, quindi consentire l'alimentazione per 90 minuti. Le zanzare pienamente incoraggiate potrebbero essere scelte per ulteriori studi.Risultati rappresentativi. La figura due ci mostra il riconoscimento medio per zanzara. Dopo l'alimentazione della trama di antibiotico trattato le zanzare vediamo meningosepticum.La figura tre mostra l'espressione di una variante dei geni correlati allo sviluppo 24 ore dopo la farina di sangue contenente il meningosettico C. I risultati mostrano che non vi è alcun cambiamento significativo nella produzione di uova del gruppo di controllo e del gruppo di sbiadimento. Grazie per il tuo interesse per i batteri o un saggio di alimentazione con zanzare trattate con antibiotici.

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