Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
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この研究は中国国立自然科学財団(グラント81902094、81600497)と湖南省の科学技術計画プロジェクト(2019RS1036)によって支援されました。

1. 中腸の解剖と分節性細菌の分離
<ol><li>解剖のために蚊を準備します。<ol>
<li>アスピレーターで出現から7~9日後に蚊を集める。採取した蚊を4°Cの温度に3〜5分間加え、蚊を氷冷ペトリ皿で解剖するまで麻酔します。</li>
	</ol></li>
	<li>実験室の器具および蚊の表面を殺菌する。<ol>
<li>環境からの細菌による汚染を避けるために75%エタノールを噴霧することによって実?...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

宿主と微生物の相互作用に関する研究は、異なる腸内微生物が発散メカニズムを介して宿主生理学に影響を与えることを発見した。本稿では、蚊の中腸を解剖し、培養可能な腸内細菌を培養し、抗生物質処理、関心のある細菌を再導入するなど、蚊の腸内微生物のそれぞれの役割を調査する方法を紹介する。
抗生物質治療を成功させるためには、実験を行う際に以下の?...

蚊は、ジカウイルス、デング熱ウイルス、および マラリア 原虫1を含む百の病原体を介して伝染する、ヒト病原性疾患の最も重要なベクターであると考えられている。蚊が卵子の栄養を得るために血液を摂取すると、感染した宿主から消化管2を介して誤って病原体を摂取する可能性がある。重要なことに、血液食事の消化と病原体の入り口の両方で重要な役割を果たす蚊の中腸は、非常にダイナミックなマイクロバイオーム3を抱えています。
いくつかの研究は、培養依存的な方法または細菌シーケンシングアッセイ44、5、65のいずれかを使用して、実験室で飼育され、フィールドに集められた蚊の微生物叢を特徴付けている。パントア、セラチア、クレブシエラ、エリザベスキンキヤ、エンテロコッカスなどの種は、一般的に様々な研究55、7、8、97,8,9で蚊から分離されています。興味深いことに、蚊の腸内微生物叢は、開発段階、種、地理的起源、および摂食行動4の影響を受ける、コミュニティの多様性と細菌種の量の両方で動的に変動する。研究は、血液供給が劇的に腸内細菌科からの種の急速な拡大と全体的な多様性の減少と総細菌負荷を増加することを示しています10,,11.さらに、幼虫期の蚊の腸内微生物叢は、通常、昆虫が子犬や分化の間に変態を受けると根絶される。したがって、新たに出現した成虫蚊は、微生物叢4を再移植する必要がある。
腸内微生物叢は、栄養吸収、免疫、発達、生殖、およびベクター能力12を含む様々な側面で昆虫生理学を調節する。無菌蚊の幼虫は、細菌の経口供給が発達を救う間、最初のインスターを超えて発達することができない、蚊の腸内微生物が幼虫の発達に不可欠であることを示す13、14。13,また、腸内細菌の枯渇は、血液の食事の消化と栄養吸収を遅らせる、卵母細胞の成熟に影響を与え、そして、卵子15を減少させる。さらに、腸内微生物叢を有する蚊は、抗生物質処理された蚊と比較してより高い免疫応答を引き出し、他の病原体に対して絶えず上昇した抗菌ペプチド発現を16に感染させる。抗生物質は通常、これらの研究でパン腸内細菌を除去するために経口投与され、その後、無菌蚊と蚊の違いを合成微生物と比較する実験が行われる。しかし、蚊の中腸は微生物の多様なコミュニティを収容し、各細菌種は宿主生理学に対して明確な効果を発揮する可能性があります。
蚊の微生物叢は、発散効果を持つベクター能力を調節します。デング熱流行地域のフィールド由来の蚊から分離されたプロテウスによる植民地化は、デング熱ウイルス感染に対する上駆除された抗菌ペプチド発現および耐性を与える。病原性真菌のボーベリア・バシアナは、アルボウイルス感染に対するトールおよびJAK-STAT免疫経路を活性化する。対照的に、Aedes aegypti midgutから単離された真菌タラロマイセスは、腸トリプシン活性18を調節することによってデング熱ウイルス感染を促進する。さらに、セラチア・マルセセンスは、蚊19の腸上皮上のムチン層を消化するSmコンハクチンと呼ばれる分泌タンパク質を介したアルボウイルス感染を促進する。
この手順は、蚊の中腸の解剖、品種細菌コロニーの分離、細菌種の同定、および経口摂食による再導入のための体系的かつ直感的な方法を提供する。これは、蚊の卵巣の発達と卵位に対する生来細菌、 菊えおろく髄膜炎菌との血液供給の代表的な結果を提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

蚊の中腸は宿主の代謝、生殖、適性およびベクトルの能力に影響を与える非常に動的なマイクロバイオームを収容する。腸内微生物全体の効果を調査するための研究が行われています。しかし、異なる微生物が宿主に対して明確な効果を発揮する可能性がある。本稿では、それぞれの特定の蚊の腸内微生物の効果と潜在的なメカニズムを研究するための方法論を提供する。
このプロトコルには 2 つの部分が含まれています。最初の部分では、蚊の中腸を解剖し、殺虫性細菌のコロニーを分離し、細菌種を同定する方法を紹介します。第2部は、抗生物質処理蚊を生成し、1つの特定の細菌種を再導入する手順を提供する。

抗生物質で治療された蚊の中腸と抗生物質なしでDNA抽出のために取り出され、qPCRは普遍的な細菌プライマーで行われた。 図1 は、対照群および抗生物質治療群における細菌16S rRNAの発現を示す。その結果、腸内細菌の約98%が除去され、ペニシリンとストレプトマイシンの腸管滅菌が成功した。
記載された方法により、細菌株を単離し、同定した。 C. 髄膜?...

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A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

抗生物質処理された蚊による細菌性経口摂食アッセイ

本稿では、蚊中腸の品種微生物の単離と同定、蚊腸内細菌の抗生物質枯渇、特定の細菌種の再導入など、個々の蚊腸内細菌の影響を調査するためのプロトコルを提示する。

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

蚊の中腸は、宿主の代謝、生殖、フィットネス、獣医の能力に影響を与える微生物の複雑なコミュニティを抱えています。各腸内微生物と異なる効果です。このビデオでは、各細菌株または宿主生理学のそれぞれの役割を研究する手順を紹介します。腸内細菌コロニーの培養を取得するには、無菌状態で蚊の中腸を解剖する。解剖中腸、セロトガネートを接地し、寒天プレートの上に広がります。プレートから単一のコロニーを選び、16個のSRNA遺伝子配列を介して細菌種を同定する。腸内微生物叢を取り除くために、連続して3日間抗生物質を含むCODエンボスで蚊を養います。抗生物質治療の有効性は、その後の過激派の前にコロニー形成ユニットアッセイのための無菌蚊の中腸を解剖することによって確認することができる。その後、経口摂食アッセイを介して以前に蚊の腸から単離された特定の細菌種を再導入する。宿主生理学に対する細菌の影響は、未治療の蚊、抗生物質処理された蚊、および蚊が特定の拘束を再導入したのを比較することによって評価することができる。中腸の解剖と培養可能な細菌の分離.まず、アスピレーターでケージ内の蚊を収集し、収集ボックス内の蚊を細胞にします。蚊を麻酔し、3~5分間4度の温度を下します。蚊を氷の冷たいペトリ皿に入れて麻酔をかけ続けます。ベンチを消毒し、顕微鏡を解剖し、環境からの細菌による汚染を避けるために75%エタノールを噴霧して鉗子を除去する。表面は、テーピングし、3分間75%エタノールでそれらを振ることによって蚊を殺菌し、PBSバッファーで2回リンスします。PBSのあなたの滴を含む無菌ガラススライド上で別々に蚊を二分します。慎重に鉗子を使用して蚊の足、翼と頭を取り除きます。蚊の胸と腹部の最後の部分をクランプし、消化管を分離するために引き離しました。鉗子を使用して、消化管から作物とマルピギアンチューブを取り除きます。作物は、中腸のpnteriorに配置され、砂糖水を摂取した後に膨らみます。マルピギアンチューブは、中腸と後腸の接合部にある細い排泄管のグループです。解剖した化粧を200マイクロリットルの無菌PBSバッファーを備えたEPチューブに入れ、クリーンベンチで無菌研削牧師と一緒に粉砕します。シリアルは、LB寒天プレートと絶望的なプレートに各妄想の50マイクロリットルで3つのテンポ妄想にホモジネートをロードします。単一のコロニーが実現可能になるまで、1〜2日間プレートを37度としてインキュベートする。50ミリリットルlbブラジャー培地を含む150ミリリットルの円錐形フラスコに単一のコロニーを選びます。一晩で37度で細菌を振る。種の識別。細菌ゲノムDNA構築キットによりTOTO DNAを抽出し、PCRにより16SRDNAを増幅します。アンブローズゲル電気泳動と駆動回収キットによるPCR産物からのDNA断片の回収と精製。精製されたDNA断片にDNAシーケンシングを行い、達成された細菌鎖配列を有する。細菌および古細菌およびデータベースに対して細菌を同定する16個のSRNA遺伝子配列を問い合わせにブラスト検索を実行する。種レベルの同定は、最も近いチームバンクエントリと類似性99%16 SRDNA配列以上と定義した。この分離株を対応する、16 SRDNA配列である場合に属に割り当て、類似性は99%未満であり、95%以上の抗生物質治療および細菌再導入であった。スクロースペニシリンとストレプトマイシンの必要量を量って、ペニシリンの20単位とミリリットル当たりストレプトマイシンの20マイクログラムを試すことを含む10%スクロース溶液を調製する。抗生物質を含むスクロース溶液中の綿球に浸透し、蚊を含む紙コップの上に置きます。水辺が蒸発するのを防ぐために、綿のボールを10センチメートルのペトリ皿で覆います。綿のボールを2日2回交換し、3日間連続して蚊に餌を与えます。蚊は2つのグループに分かれています。最初のグループは何の治療もなく蚊のカップに入れられ、綿球の医師は10%だから十字架が毎日与えられた。2番目のグループは抗生物質で治療され、3日間務める。各群で、セルゲイ蚊を解剖した。このミカを全DNA抽出のために抽出し、QPCRを普遍的な細菌プライマーを用いて実施した、図1は、対照群および抗生物質処理群における16SRNAの発現を示す。結果は、ペニシリンおよびストレプトマイシンのコストまたは実現が成功したことを示す。細菌溶液を調製し、分光光度計でウイルス中の細菌溶液を測定し、EPチューブに1つのOT細菌懸濁液を加える。5,000 RCAで懸濁液を4度で5分間遠心分離して上清を捨て、細菌パレットを滅菌PBS緩衝液で洗浄する。200マイクロリットルの無菌PBSバッファーで細菌パレットを再中断600マイクロリットル、10%スクロース溶液、200マイクロリットルATP、200マイクロリットルの細菌懸濁液を新しいAPチューブに加え、よく混ぜます。あるいは、細菌は、あなたの血液を活性化する熱で再懸濁することができます。加熱活性化血液の調製。抗凝固管で新鮮な血液を凝固し、2〜3ミリリットルの新鮮な血液を摂取する。遠心分離機は、血漿および血液細胞を分離するために4度で10分間10分間、1000で。プラズマを新しいEPチューブに集め、ここで1時間56度で活性化活性化する。滅菌PBSバッファーであなたの時間を通してブラストハウスを洗浄します。加熱活性化プラズマとの懸濁爆風の家をすすい。膜および供給システムを組み立てる。フィルム病を最大限に引き出します。プラスチックリングと職場のパラフィルムを固定して、準備された細菌溶液をフィーダーユニットに最大財布にゆっくりと追加します。気泡が一方向から落ちるのを避けるために、フィーダーユニットをシールします。電源を接続します。温度が37度に達するまで待って、フィーダーに細菌溶液とフィーダーユニットを取り付けます。細菌の餌を与える前に蚊は抗生物質を代謝するために24時間停止する必要があります。蚊と紙コップのフィードユニットのために、その後、90分間の給餌を許可します。完全に奨励された蚊は、さらなる研究のために選ぶことができました。代表結果。図2は、蚊1人当たりの平均称賛を示しています。抗生物質のプロット給餌が蚊を治療した後、我々は髄膜炎菌を見る。図3は、Cメニンゴセプチカムを含む血液食後24時間の変異発症関連遺伝子の発現を示す。結果は、対照群および退色群の卵の生産に有意な変化がないことを示す。細菌や抗生物質処理蚊との摂食エッセイに興味を持ってくれてありがとう。

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

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In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAiによる遺伝子ノックダウンと<emインビボで&gt;</em大人の女性の&gt;利尿アッセイ<em&gt;ネッタイシマカ</em&gt;蚊

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マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析

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High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

ネッタイシマカ蚊ボルバキアに感染維持

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

口腔の細菌感染とキイロショウジョウバエの開口

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

蚊を殺虫化合物小説の毒性試験のプロトコル

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

蚊のベクトル能力を分析する方法として唾液の分泌を強制

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...