Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), og Science and Technology Plan Project of Hunan Province (2019RS1036).

1. Midgut disseksjon og dyrkbare bakterier isolasjon
<ol><li>Forbered myggen for disseksjon.<ol>
<li>Samle myggene 7-9 dager etter fremveksten med en aspirator. Bedøve de oppsamlede myggene ved å utsette dem for en temperatur på 4 °C i 3–5 min og holde myggene bedøvet i en iskald petriskål til disseksjon.</li>
	</ol></li>
	<li>Steriliser laboratorieinstrumenter og myggoverflaten.<ol>
<li>Steriliser eksperimentbenken, dissekere mikroskop, tang og glasssklie ved å sprøyte 75% e...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

Forskning på host-mikrobe interaksjoner har funnet at ulike tarmmikrober påvirker vertens fysiologi via divergerende mekanismer. Denne artikkelen introduserer metoden for å undersøke den respektive rollen som myggtarmmikrobe, inkludert dissekering av myggmidgut, kultiverering av kultiverende tarmbakterier, antibiotikabehandling og gjeninnføring av bakteriene av interesse.
For vellykket antibiotikabehandling må følgende detaljer vurderes for å gjennomføre eksperimentet. I denne protoko...

Mygg anses å være de viktigste vektorene av menneskelige patogene sykdommer, overfører over hundre patogener, inkludert Zika-virus, Dengue-virus og Plasmodium parasitter1. Når mygg tar et blodmåltid for å skaffe næringsstoffer til oviposisjon, kan de ved et uhell innta patogener fra en smittet vert via fordøyelseskanalen2. Viktigere, myggmidgut, som spiller en avgjørende rolle i både blodmåltid fordøyelsen og patogen inngangen, havner en svært dynamisk mikrobiome3.
Flere studier har karakterisert lab-reared og feltsamlede myggmikrobiota ved hjelp av enten en kulturavhengig metode eller en bakteriesekvenseringsanalyse4,,5,,6. Arter som Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaog Enterococcus er vanligvis isolert fra mygg i ulikestudier 5,,7,,8,,9. Interessant, mygg tarm mikrobiota svinger dynamisk i både samfunnet mangfold og mengden av bakterier arter, påvirket av utviklingsstadiet, arter, geografisk opprinnelse, og fôring atferd4. Studier viser at blodfôring dramatisk øker den totale bakterielle belastningen med rask utvidelse av arter fra Enterobacteriaceae og en reduksjon i det totale mangfoldet10,11. I tillegg blir mygg tarmmikrobiota av larvalstadiet vanligvis utryddet når insektet gjennomgår metamorfose under pupering og eclosion; dermed må nylig dukket voksne mygg befolke mikrobiota4.
Gut microbiota modulerer insektfysiologi i ulike aspekter, inkludert næringsabsorpsjon, immunitet, utvikling, reproduksjon og vektorkompetanse12. Asniske mygglarver utvikler seg ikke utover den første instar mens en bakterie oral forsyning redder utvikling, noe som indikerer at myggtarmmikroben er avgjørende forlarvalutvikling 13,14. Dessuten, uttømming av tarmbakterier retards blod måltid fordøyelse og næringsabsorpsjon, påvirker oocyte modning, og reduserer oviposisjon15. I tillegg fremkaller mygg med tarmmikroflora høyere immunresponser sammenlignet med antibiotikabehandlede mygg, med stadig forhøyet antimikrobiell peptiduttrykk mot andre patogener for åinfisere 16. Antibiotika administreres vanligvis oralt for å fjerne pan tarmbakterier i disse studiene, og deretter utføres eksperimenter for å sammenligne forskjellen mellom asnic mygg og mygg med commensal mikrober. Myggmidgut har imidlertid et mangfoldig samfunn av mikrober, og hver bakterieart kan utøve en tydelig effekt mot vertens fysiologi.
Myggmikrobiota regulerer vektorkompetanse med divergerende effekter. Kolonisering av Proteus isolert fra feltavledede mygg av dengue-endemiske områder gir oppregulert antimikrobiell peptiduttrykk og motstand mot denguevirusinfeksjon16. Den entomopathogenic sopp Beauveria bassiana aktiverer Toll og JAK-STAT immunveien mot arbovirus infeksjon17. Derimot, sopp Talaromyces isolert fra Aedes aegypti midgut forenkler dengue virusinfeksjon ved å modulere gut trypsin aktivitet18. I tillegg fremmer Serratia marcescens arbovirusoverføring gjennom et sekretorisk protein kalt SmEnhancin, som fordøyer mucinlaget på tarmepitelet av mygg19.
Denne prosedyren gir en systematisk og intuitiv metode for disseksjon av myggmidgut, isolering av kultivable bakteriekolonier, identifisering av bakterieartene og gjeninnføring via oral fôring. Det gir representative resultater av blodfôring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, på mygg eggstokkutvikling og oviposisjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

Myggmidgut har et svært dynamisk mikrobiome som påvirker vertmetabolismen, reproduksjon, fitness og vektorkompetanse. Studier er utført for å undersøke effekten av tarmmikrober som helhet; Imidlertid kan forskjellige mikrober utøve tydelige effekter mot verten. Denne artikkelen gir metodikken for å studere effekten av hver enkelt myggtarmmibe og den potensielle mekanismen.
Denne protokollen inneholder to deler. Den første delen introduserer hvordan man dissekerer myggmidgut, isolerer kultivable bakteriekolonier og identifiserer bakteriearter. Den andre delen gir prosedyren for å generere antibiotikabehandlede mygg og gjeninnføre en bestemt bakterieart.

Midguts av mygg behandlet med antibiotika og uten antibiotika ble tatt ut for DNA ekstraksjon, og qPCR ble utført med universelle bakterielle primere. Figur 1 viser uttrykket for bakteriell 16S rRNA i kontrollgruppen og antibiotikabehandlingsgruppen. Resultatene viser at ca 98% av tarmbakteriene er fjernet, og tarmen sterilisering av penicillin og streptomycin var vellykket.
Med de beskrevne metodene ble bakteriestammer isolert og identifisert. C. meningosepticum er ...

Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

En bakteriell oral fôringsanalyse med antibiotikabehandlede mygg

Denne artikkelen presenterer en protokoll for å undersøke effekten av individuelle myggtarmet bakterier, inkludert isolasjon og identifisering av mygg midgut kulterbare mikrober, antibiotikauttømming av myggtarmbakterier og gjeninnføre en bestemt bakterieart.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mygg midgut har et komplekst fellesskap av mikrober som påvirker vertens metabolisme, reproduksjon, fitness og veterinærkompetanse. Med hver tarmmibe er en annen effekt. Denne videoen introduserer prosedyren for å studere den respektive rollen til hver bakteriestamme eller vertsfysiologi.For å skaffe seg en kultur av tarmbakterielle kolonier, dissekere myggmidgut under steril tilstand. Jord den dissekere midgut, serotologinate, og spredt over agar plate. Velg enkeltkolonier fra platen, og identifiser bakteriearten via deres 16 SRNA gensekvens.Mate myggene med COD Emboss som inneholder antibiotika i påfølgende tre dager for å fjerne tarmmikrobiota. Effektiviteten av antibiotikabehandling kan bekreftes ved å dissekere midgut av aseptisk mygg for kolonidannende enhetsanalyse før påfølgende ekstremister. Deretter gjeninnfører spesifikke bakteriearter som tidligere isolert fra myggtarm via oral fôringsanalyse.Effekten av bakterier på vertsfysiologi kan evalueres ved å sammenligne de ubehandlede myggene, antibiotikabehandlede mygg og myggene gjeninnført spesifikk tilbakeholdenhet. Midgut disseksjon og dyrkingbare bakterier isolasjon. Til å begynne med, samle myggene i buret med en aspirator og celle myggene i samlingsboksen.Bedøve myggene ved å utsette en temperatur på 4 grad i tre til fem minutter. Hold myggene bedøvet ved å plassere dem i en iskald petriskål. Desinfiser benken, dissekere mikroskop og tang ved å sprøyte 75% etanol for å unngå forurensning av bakterier fra miljøet.Overflaten steriliserer myggen ved å teipe og riste dem i 75% etanol i tre minutter og skyll to ganger med PBS-buffer. Bisect myggen separat på en steril glasssklie som inneholder din dråpe PBS. Fjern forsiktig bena, vingene og myggens hode ved hjelp av tang.Klem myggens bryst og den siste delen av magen var tang og trekk fra hverandre for å isolere fordøyelseskanalen. Bruk tang for å fjerne avlingen og mispighianrøret fra fordøyelseskanalen. Avlingen er plassert på pnterior av midgut og buler etter inntak av sukkervann.Malpighian rør er gruppe av slanke ekskresjonsrør i krysset mellom midgut og bakgut. Plasser den dissekerte sminken i EP-røret med 200 mikroliter steril PBS-buffer og slip den med den sterile slipepastoren i den rene benken. Korn for å laste homogenatet til tre tempo vrangforestillinger på 50 mikroliter av hver vrangforestilling til LB agar plate og desperat plate.Inkuber platen som 37 grader i en til to dager til enkeltkolonier er mulige. Plukk enkeltkolonier i en 150 milliliter konisk kolbe som inneholder 50 milliliter lb BH-er medium. riste bakteriene på 37 grader over natten.Identifikasjon av arter. Trekk ut TOTO DNA med bakteriell genomisk DNA-konstruksjonssett og forsterke 16 SRDNA av PCR. Gjenoppretting og rensing av DNA-fragmenter fra PCR-produkter av Ambrose gel elektroforese og kjørte utvinning kit.Utførte DNA-sekvensering på de rensede DNA-fragmentene for å ha en oppnådd bakteriekjedesekvenser. Kjør blast søk til en spørring 16 SRNA gensekvens av identifisere bakterier mot bakterier og arkaea og database. Identifikasjon til artsnivået ble definert som større enn eller lik 99%16 SRDNA sekvens likhet med nærmeste team bank oppføring.Isolatet ble tildelt den til den tilsvarende slekten når det er 16 SRDNA-sekvens, likheten var mindre enn 99%og større enn eller lik 95% antibiotikabehandling og bakteriereintroduksjon. veie den nødvendige mengden sukrose penicillin og streptomycin for å forberede oss 10% sukrose løsning, inkludert å prøve 20 enheter penicillin og 20 mikrogram streptomycin per milliliter. Infiltrer bomullsballene i sukroseløsningen som inneholder antibiotika og legg den over toppen av papirkoppen som inneholder mygg.Dekk bomullsdotten med en 10 centimeter petriskål for å hindre at en vannkanten fordamper. Erstatt bomullsballene to ganger om dagen og mat myggen i påfølgende tre dager. Mygg er delt inn i to grupper.Den første gruppen ble plassert i en myggkopp uten behandling, noen bomullballer lege med 10%Så kors ble gitt daglig. Den andre gruppen ble behandlet med antibiotika og tjener i tre dager. I hver gruppe ble Sergei mygg dissekert.Mika ble ekstrahert for total DNA-ekstraksjon og QPCR ble utført ved hjelp av universelle bakterier primere, figur en viser uttrykket av 16 SRNA i kontrollgruppen og antibiotika behandlingsgruppen. Resultatene viser at kostnaden eller realiseringen av penicillin og streptomycin var vellykket. forberede bakteriell løsning, måler en bakterieløsning i viruset med et spektrofotometer, tilsett en OT bakterier suspensjon i EP-rør.Sentrifuger suspensjonen ved 5.000 RCA i fem minutter ved fire grader Kast supernatanten, vask bakteriepallforsøkene med steril PBS-buffer. Re-suspender bakteriepallen med 200 mikroliter steril PBS buffer Tilsett 600 mikroliter, 10% sukroseløsning, 200 mikroliter ATP og 200 mikroliter bakteriell suspensjon i et nytt AP-rør og bland godt. Alternativt kan bakteriene henges på nytt i varme for å aktivere blodet ditt.Fremstilling av oppvarming aktivert blod. koagulerende friskt blod med antikoagulantrør, ta to til tre milliliter friskt blod. sentrifuge ved 1000 i 10 minutter ved fire grader for å skille plasma og blodceller.Samle plasmaet i et nytt EP-rør og heraktiver aktivert i en 56 graders i en time. Vask Blast huset gjennom tidene dine med steril PBS buffer. Skyll suspendert blast hus med oppvarming aktivert plasma.Monter membran og fôringssystem. Trekk filmsyken til det maksimale. fikse med plastringen og arbeidsplassen parafilm for å unngå lekkasje sakte legge forberedt bakteriell løsning til materenheten, til maksimal lommebok.For å unngå at boblen falt fra en retning og forsegler materenheten. Koble til strømforsyningen. Vent til temperaturen når 37 grader Installert materenheten med bakterieløsning på materen.Før fôring bakterier mygg bør stoppes i 24 timer for å metabolisere antibiotika. For mateenheten på papirkoppen med mygg, la det mate i 90 minutter. Fullt oppmuntret mygg kunne plukkes ut for videre studier.Representative resultater. Figur to viser oss den gjennomsnittlige anerkjennelsen per mygg. Etter plottfôring av antibiotika behandlet myggene ser vi meningosepticum.Figur tre viser uttrykket for en variant utviklingsrelaterte gener 24 timer etter blodmåltid som inneholder C meningosepticum. Resultatene viser at det ikke er noen vesentlig endring i eggproduksjonen til kontrollgruppen og falmingsgruppen. Takk for din interesse for bakterier eller et fôringsessay med antibiotikabehandlet mygg.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediert Gene knockdown og<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay i voksen hunn<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Mygg

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-deteksjon analysen for Malaria Sending Mygg

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Høy fett Fôring Paradigm for Larve Sebrafisk: Fôring, Live Imaging, og Kvantifisering av matinntak

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Opprettholde Aedes aegypti mygg infisert med Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Muntlig bakteriell infeksjon og Shedding i Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for Testing toksisitet av romanen Insecticidal kjemikalier til mygg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Tvunget spyttsekresjon som metode for å analysere vektor kompetanse med mygg

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...