Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81902094, 81600497), y el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Hunan (2019RS1036).

1. Disección de la parte media y aislamiento de bacterias cultivables
<ol><li>Preparen el mosquito para la disección.<ol>
<li>Recoger los mosquitos 7-9 días después de la aparición con un aspirador. Anestesia a los mosquitos recogidos sometiéndolos a una temperatura de 4oC durante 3-5 min y mantén a los mosquitos anestesiados en un plato de Petri helado hasta la disección.</li>
	</ol></li>
	<li>Esterilice los instrumentos de laboratorio y la superficie del mosquito.<ol>
<li>Est...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

Las investigaciones sobre las interacciones huésped-microbio han encontrado que diferentes microbios intestinales afectan su fisiología huésped a través de mecanismos divergentes. Este artículo presenta el método para investigar el papel respectivo del microbio intestinal del mosquito, incluyendo la disección de la mitad del mosquito en la bles, el cultivo de bacterias intestinales cultivables, el tratamiento antibiótico y la reintroducción de las bacterias de interés.
Para un tratam...

Los mosquitos se consideran los vectores más importantes de las enfermedades patógenas humanas, transmitiendo más de un centenar de patógenos, incluyendo el virus del Zika, el virus del Dengue y los parásitos Plasmodium 1. Cuando los mosquitos toman una comida de sangre para adquirir nutrientes para la oviposición, pueden ingerir accidentalmente patógenos de un huésped infectado a través del tracto digestivo2. Es importante destacar que el medio mosquito, que desempeña un papel fundamental tanto en la digestión de las comidas en sangre como en la entrada de patógenos, alberga un microbioma altamente dinámico3.
Varios estudios han caracterizado la microbiota de mosquitos criada en laboratorio y recogida en el campo utilizando un método dependiente del cultivo o un ensayo de secuenciación de bacterias4,,5,,6. Especies como Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiay Enterococcus se suelen aislar de los mosquitos en diversos estudios5,7,8,9. Curiosamente, la microbiota intestinal de los mosquitos fluctúa dinámicamente tanto en la diversidad comunitaria como en la cantidad de especies bacterianas, afectadas por la etapa de desarrollo, las especies, el origen geográfico y el comportamiento de alimentación4. Los estudios muestran que la alimentación sanguínea aumenta dramáticamente la carga bacteriana total con una rápida expansión de las especies de Enterobacteriaceae y una reducción de la diversidad general10,11. Además, la microbiota intestinal del mosquito de la etapa larval generalmente se erradica cuando el insecto sufre metamorfosis durante la pupación y eclosión; por lo tanto, los mosquitos adultos recién surgidos necesitan repoblar su microbiota4.
La microbiota intestinal modula la fisiología de los insectos en diversos aspectos, como la absorción de nutrientes, la inmunidad, el desarrollo, la reproducción y la competencia vectorial12. Las larvas de mosquitos estribicos no se desarrollan más allá de la primera estrella, mientras que un suministro oral de bacterias rescata el desarrollo, lo que indica que el microbio intestinal del mosquito es esencial para el desarrollo larvario13,14. Además, el agotamiento de las bacterias intestinales retrasa la digestión de las comidas en la sangre y la absorción de nutrientes, afecta la maduración de los ovocitos y disminuye la oviposición15. Además, los mosquitos con microflora intestinal provocan respuestas inmunitarias más altas en comparación con los mosquitos tratados con antibióticos, con una expresión de péptido antimicrobiano constantemente elevada contra otros patógenos para infectar a16. Por lo general, los antibióticos se administran por vía oral para eliminar las bacterias del intestino de la sartén en estos estudios, y luego se llevan a cabo experimentos para comparar la diferencia entre los mosquitos oxenicos y los mosquitos con microbios commensales. Sin embargo, el mosquito midgut alberga una comunidad diversa de microbios, y cada especie de bacteria podría ejercer un efecto distintivo hacia la fisiología anfitriona.
La microbiota de mosquitos regula la competencia vectorial con efectos divergentes. La colonización por Proteus aislada de mosquitos derivados del campo de las zonas endémicas de dengue confiere la expresión de péptidos antimicrobianos reguladas y la resistencia contra la infección por el virus del dengue16. El hongo entomopatógeno Beauveria bassiana activa la vía inmune Toll y JAK-STAT contra la infección por arbovirus17. Por el contrario, el hongo Talaromyces aislado de Aedes aegypti midgut facilita la infección por el virus del dengue mediante la modulación de la actividad de tripsina intestinal18. Además, Serratia marcescens promueve la transmisión del arbovirus a través de una proteína secretora llamada SmEnhancin, que digiere la capa de mucina en el epitelio intestinal de los mosquitos19.
Este procedimiento proporciona un método sistemático e intuitivo para la disección del pasto del mosquito, el aislamiento de colonias de bacterias cultivables, la identificación de las especies de bacterias y la reintroducción a través de la alimentación oral. Proporciona resultados representativos de la alimentación de la sangre con una bacteria commensal, Chryseobacterium meningosepticum,sobre el desarrollo del ovario de mosquitos y la oviposición.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

El mosquito midgut alberga un microbioma altamente dinámico que afecta el metabolismo del huésped, la reproducción, la aptitud física y la competencia vectorial. Se han realizado estudios para investigar el efecto de los microbios intestinales en su conjunto; sin embargo, diferentes microbios podrían ejercer efectos distintos hacia el huésped. Este artículo proporciona la metodología para estudiar el efecto de cada microbio intestinal específico del mosquito y el mecanismo potencial.
Este protocolo contiene dos partes. La primera parte introduce cómo diseccionar el mosquito en la parte media del intestino, aislar colonias de bacterias cultivables e identificar especies de bacterias. La segunda parte proporciona el procedimiento para generar mosquitos tratados con antibióticos y reintroducir una especie específica de bacterias.

Las vías medias de los mosquitos tratados con antibióticos y sin antibióticos fueron sacados para la extracción de ADN, y qPCR se realizó con imprimaciones bacterianas universales. La Figura 1 muestra la expresión de RRNA bacteriana 16S en el grupo de control y en el grupo de tratamiento antibiótico. Los resultados muestran que alrededor del 98% de las bacterias intestinales se han eliminado, y la esterilización intestinal de penicilina y estreptomicina fue exitosa.
Co...

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A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

Un ensayo de alimentación oral bacteriana con mosquitos tratados con antibióticos

Este artículo presenta un protocolo para investigar el efecto de las bacterias intestinales de mosquitos individuales, incluyendo el aislamiento y la identificación de microbios cultivables de mosquitos en la mitad del intestino, agotamiento de antibióticos de bacterias intestinales de mosquitos, y reintroducir una especie específica de bacterias.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mosquito midgut alberga una compleja comunidad de microbios que afectan el metabolismo del huésped, la reproducción, la aptitud física y la competencia veterinaria. Con cada microbio intestinal es un efecto diferente. Este video introduce el procedimiento para estudiar el papel respectivo de cada cepa bacteriana o fisiología del huésped.Para adquirir un cultivo de colonias bacterianas intestinales, disecciona el dorso en condiciones estériles. Aterrizar el punto medio diseccionado, serotologinar, y extenderse sobre la placa de agar. Escoja colonias individuales de la placa e identifique las especies de bacterias a través de su secuencia de 16 genes SRNA.Alimentar a los mosquitos con COD Emboss que contiene antibióticos durante tres días consecutivos para eliminar la microbiota intestinal. La eficacia del tratamiento con antibióticos puede confirmarse diseccionando el encuse de mosquito aséptico para el ensayo de la unidad formadora de colonias antes de los extremistas subsiguientes. Luego reintroducir especies de bacterias específicas que previamente se aislaron del intestino del mosquito a través del ensayo de alimentación oral.El efecto de las bacterias en la fisiología del huésped podría evaluarse comparando los mosquitos no tratados, los mosquitos tratados con antibióticos y la restricción específica de los mosquitos. Disección de la parte media y el aislamiento de bacterias cultivables. Para empezar, recoge los mosquitos en jaula con un aspirador y celda de los mosquitos en la caja de recolección.Anestesiar a los mosquitos sometiendo a una temperatura de 4 grados durante tres a cinco minutos. Mantenga los mosquitos anestesiados colocándolos en un plato de Petri helado. Desinfecte el banco, el microscopio de disección y los fórceps pulverizando un 75% de etanol para evitar la contaminación por bacterias del medio ambiente.La superficie esteriliza al mosquito enroscándolo y sacudiéndolo en 75%etanol durante tres minutos y enjuáguelo dos veces con el tampón PBS. Bisect el mosquito por separado en un portaobjetos de vidrio estéril que contenga su gota de PBS. Retire con cuidado las patas, las alas y la cabeza del mosquito con fórceps.Sujeta el pecho del mosquito y la última sección del abdomen fue fórceps y desmonta para aislar el tracto digestivo. Use fórceps para extraer el cultivo y el tubo malpighiano del tracto digestivo. El cultivo se coloca en el pnterior de la parte media y protuberancias después de ingerir agua azucarada.Los tubos malpighianos son un grupo de tubos excretores delgados en la unión de la parte media y la parte posterior. Coloque el maquillaje diseccionado en el tubo EP con 200 microlitros estériles PBS buffer y molerlo con el pastor de molienda estéril en el banco limpio. Cereal para cargar el homogeneización a tres delirios de tempo a 50 microlitros de cada delirio a la placa de agar LB y placa desesperada.Incubar la placa como 37 grados durante uno o dos días hasta que las colonias individuales sean factibles. Escoja colonias individuales en un matraz cónico de 150 mililitros que contenga un medio de sujetadores de 50 mililitros lb. agitar las bacterias a 37 grados durante la noche.Identificación de especies. Extraiga ADN TOTO mediante un kit de construcción de ADN genómico bacteriano y amplifique 16 SRDNA por PCR. Recuperación y purificación de fragmentos de ADN de productos de PCR por electroforesis de gel de Ambrose y el kit de recuperación de impulsión.Se realizó la secuenciación de ADN en los fragmentos de ADN purificado para tener una secuencia de cadena de bacterias alcanzada. Realizar la búsqueda de granallado a una consulta de la secuencia de 16 genes SRNA de identificar las bacterias contra las bacterias y la arquea y la base de datos. La identificación al nivel de la especie se definió como mayor o igual que 99%16 SRDNA similar a la entrada de banco del equipo más cercana.El aislado se asignó al género correspondiente, cuando es 16 secuencia SRDNA, la similitud era menor que 99% y mayor o igual a 95%tratamiento antibiótico y re-introducción de bacterias. pesar la cantidad necesaria de penicilina de sacarosa y estreptomicina para prepararnos 10%solución de sacarosa, incluyendo probar 20 unidades de penicilina y los 20 microgramos de estreptomicina por mililitro. Infíltrate en las bolas de algodón en la solución de sacarosa que contiene antibióticos y colóquela sobre la parte superior de la taza de papel que contiene el mosquito.Cubra la bola de algodón con un plato Petri de 10 centímetros para evitar que un paseo marítimo se evapore. Sustituya las bolas de algodón dos veces al día y alimente al mosquito durante tres días consecutivos. Los mosquitos se dividen en dos grupos.El primer grupo se colocó en una taza de mosquito sin ningún tratamiento, cualquier médico de bolas de algodón con 10%Así que la cruz se dio diariamente. El segundo grupo fue tratado con antibióticos y sirvió durante tres días. En cada grupo, los mosquitos Sergei fueron diseccionados.El Mika fue extraído para la extracción total de ADN y el QPCR se realizó utilizando imprimaciones de bacterias universales, figura uno muestra la expresión de 16 ARNs en el grupo de control y grupo de tratamiento antibiótico. Los resultados muestran que el costo o realización de penicilina y estreptomicina fue exitoso. preparar la solución bacteriana, mide una solución bacteriana en el virus con un espectrofotómetro, añadir una suspensión de bacterias OT en el tubo EP.Centrifugar la suspensión a 5.000 RCA durante cinco minutos a cuatro grados Deseche el sobrenadante, lave el palé de bacterias intenta con tampón PBS estéril. Re-suspender el palet bacteriano con 200 microlitros estériles PBS buffer Añadir 600 microlitros, 10% solución de sacarosa, 200 microlitros ATP y 200 microlitros suspensión bacteriana en un nuevo tubo AP y mezclar bien. Alternativamente, las bacterias pueden ser re-suspendidas en calor en activar la sangre.Preparación de la sangre activada por calentamiento. clot sangre fresca con tubo anticoagulante, tomar de dos a tres mililitros de sangre fresca. centrífuga a 1000 durante 10 minutos a cuatro grados para separar el plasma y las células sanguíneas.Recoger el plasma en un nuevo tubo EP y aquí activar activado a 56 grados durante una hora. Lave Blast house a través de sus tiempos con tampón PBS estéril. Enjuague la casa de la explosión suspendida con el plasma activado por calefacción.Montar membrana y sistema de alimentación. Tire de la enfermedad de la película al máximo. arreglar con el anillo de plástico y la parafilmación del lugar de trabajo para evitar que las fugas agreguen lentamente la solución bacteriana preparada a la unidad alimentadora, al máximo monedero.Para evitar que la burbuja cayera desde una dirección y sellar la unidad alimentadora. Conecte la fuente de alimentación. Espere hasta que la temperatura alcance los 37 grados Instalado la unidad alimentador con solución bacteriana en el alimentador.Antes de alimentar a los mosquitos bacterias se deben detener durante 24 horas para metabolizar los antibióticos. Para la unidad de alimentación en la taza de papel con mosquitos, luego deje alimentar durante 90 minutos. Los mosquitos totalmente alentados podrían ser recogidos para más estudios.Resultados representativos. La figura dos nos muestra el galardón promedio por mosquito. Después de la alimentación de la trama de antibióticos tratados los mosquitos vemos meningosepticum.La figura tres muestra la expresión de una variante de genes relacionados con el desarrollo 24 horas después de la comida de sangre que contiene el meningosepticum C. Los resultados muestran que no hay ningún cambio significativo en la producción de huevos del grupo de control y el grupo de desvanecimiento. Gracias por su interés en las bacterias o un ensayo de alimentación con mosquitos tratados con antibióticos.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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