Name: a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), och Science and Technology Plan Project of Hunan-provinsen (2019RS1036).

1. Midgut dissekering och cultivable bakterier isolering
<ol><li>Förbered myggan för dissektion.<ol>
<li>Samla myggorna 7–9 dagar efter uppkomsten med en aspirator. Söva de insamlade myggorna genom att utsätta dem för en temperatur på 4 °C i 3–5 min och håll myggorna sövda i en iskall Petriskål fram till dissekering.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilisera laboratorieinstrument och myggytan.<ol>
<li>Sterilisera experimentbänken, dissekera mikroskop, tång, och glas slide genom...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li><li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbovirus+lifecycle+in+mosquito:+acquisition,+propagation+and+transmission.">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).</li><li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes.">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).</li><li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses.">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li><li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus.">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).</li><li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species.">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti.">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li><li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity.">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641 (2013).</li><li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+(Diptera:+Culicidae).">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut.">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).</li><li>Gu&#233;gan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota.">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).</li><li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li><li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development.">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li><li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+(diptera:+culicidae)(L).">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites &amp; Vectors. 4 (1), 105 (2011).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti.">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li><li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity.">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844 (2017).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses.">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host &amp; Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li><li>M&#246;hlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes.">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li><li>Llorca, M., Gros, M., Rodr&#237;guez-Mozaz, S., Barcel&#243;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water.">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li><li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection.">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives &amp; Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure &amp; Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li><li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti.">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li><li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).</li><li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria:+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents.">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).</li><li>Gon&#231;alves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes.">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174 (2019).</li><li>Kuss, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+promote+enteric+virus+replication+and+systemic+pathogenesis.">Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis.</a> Science. 334 (6053), 249-252 (2011).</li><li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector.">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li><li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus.">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).</li><li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+microbiota+and+metagenomics,+and+its+relevance+to+disease+transmission.">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li><li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome.">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li></ol>

Forskning om värd-mikrob interaktioner har funnit att olika gut mikrober påverkar deras värd fysiologi via olika mekanismer. Denna artikel introducerar metoden för att undersöka respektive roll mygga gut mikrob, inklusive dissekera mygga midgut, culturing cultivable tarmbakterier, antibiotikabehandling, och återinföra bakterier av intresse.
För framgångsrik antibiotikabehandling måste följande detaljer beaktas vid genomförandet av experimentet. I detta protokoll behandlades myggor ...

Myggor anses vara de viktigaste vektorerna av mänskliga patogena sjukdomar, som överför över hundra patogener inklusive Zika virus, Denguevirus, och Plasmodium parasiter1. När myggor tar en blodmåltid för att förvärva näringsämnen för oviposition, kan de oavsiktligt inta patogener från en infekterad värd via matsmältningskanalen2. Viktigt, mygga midgut, som spelar en central roll i både blod måltid matsmältning och patogen entré, hamnar en mycket dynamisk mikrobiom3.
Flera studier har karakteriserat lab-uppfödda och fältuppsamlade mygga mikrobiota med antingen en odlingsberoende metod eller en bakterier sekvensering assay4,5,6. Arter inklusive Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, och Enterococcus är vanligen isolerade från myggor i olikastudier 5,7,8,9. Intressant nog mygga gut mikrobiota fluktuerar dynamiskt i både samhället mångfald och mängden bakterier arter, påverkas av utvecklingsstadiet, arter, geografiskt ursprung, och utfodring beteende4. Studier visar att blodmatning dramatiskt ökar den totala bakteriebelastningen med snabb expansion av arter från Enterobacteriaceae och en minskning av den totala mångfalden10,11. Dessutom utrotas myggeminfektionsflovanta av larvstadiet vanligtvis när insekten genomgår metamorfos under pupation och eclosion; således, nyuppträdda vuxna myggor måste återbefolka sin mikrobiota4.
Gut mikrobiota modulerar insekt fysiologi i olika aspekter, inklusive näringsämne absorption, immunitet, utveckling, reproduktion, och vektor kompetens12. Axenic mygglarver misslyckas med att utvecklas bortom den första instar medan en bakterie oral leverans räddar utvecklingen, vilket tyder på att mygga tarmmikroben är avgörande för larvutveckling13,14. Förutom, utarmning av tarmbakterier retards blod måltid matsmältning och näringsämne absorption, påverkar oocyte mognad, och minskar oviposition15. Dessutom mygg med gut mikroflora framkalla högre immunsvar jämfört med antibiotikabehandlade myggor, med ständigt förhöjda antimikrobiella peptiduttryck mot andra patogener att infektera16. Antibiotika är vanligtvis oralt administreras för att ta bort pan gut bakterier i dessa studier, och sedan experiment utförs för att jämföra skillnaden mellan axenic myggor och myggor med commensal mikrober. Men mygga midgut hyser en mångsidig gemenskap av mikrober, och varje bakterie art kan utöva en tydlig effekt mot värden fysiologi.
Myggfloran reglerar vektorkompetens med divergerande effekter. Kolonisering av Proteus isolerad från fält-härledda myggor av denguefeber-endemiska områden ger upregulated antimikrobiell peptid uttryck och resistens mot denguevirusinfektion16. Den entomopathogenic svampen Beauveria bassiana aktiverar Toll och JAK-STAT immun väg mot arbovirus infektion17. Däremot svampen Talaromyces isolerade från Aedes aegypti midgut underlättar denguevirusinfektion genom modulering gut trypsin aktivitet18. Dessutom, Serratia marcescens främjar arbovirus överföring genom en sekretorisk protein som kallas SmEnhancin, som smälter mucin lagret på tarmepitelet av myggor19.
Detta förfarande ger en systematisk och intuitiv metod för dissekering av mygga midgut, isolering av cultivable bakterier kolonier, identifiering av bakterien arter, och återintroduktion via oral utfodring. Det ger representativa resultat av blod utfodring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, på mygga äggstocken utveckling och oviposition.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A2383</td>
			<td >Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aedes aegypti</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Female mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anticoagulant tube</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>363095</td>
			<td>Collect fresh blood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F601620-0010</td>
			<td>1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton balls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Tissue Grinding Pestle</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619072-0001</td>
			<td>70 mm Long, Conical, Blue, Sterile</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td>Paini</td>
			<td></td>
			<td>Dilute it to 75% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11029</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemotek Membrane Feeding System</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td></td>
			<td>Components of the feeding system, including&#160; Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator shaker</td>
			<td></td>
			<td>ZQZY-78AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculation Loops</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F619312-0001</td>
			<td>10 &#956;l, Yellow</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Agar Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507003</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g&#65307; Agar 15.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB Broth Powder</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A507002</td>
			<td>Tryptone 10.0 g&#65307; Yeast Extract 5.0 g&#65307; NaCl 10.0 g.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place mosquito</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F104002</td>
			<td>4 inx 125 ft</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F611203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin G procaine salt hydrate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606248</td>
			<td>White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channal Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610494</td>
			<td>Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td>Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TIANamp Bacteria DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP302</td>
			<td>Extract DNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Utility Fabric-Mosquito Netting White</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td>Scintic Industries</td>
			<td>S1-0246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5ml EP tube</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS buffer</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607016</td>
			<td>This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bacterial oral feeding assay with antibiotic-treated mosquitoes

Mygga midgut hamnar en mycket dynamisk mikrobiomet som påverkar värdmetabolism, reproduktion, fitness och vektorkompetens. Studier har utförts för att undersöka effekten av gut mikrober som helhet; olika mikrober kunde dock utöva tydliga effekter mot värden. Denna artikel ger metodiken för att studera effekten av varje specifik mygga gut mikrob och den potentiella mekanismen.
Det här protokollet innehåller två delar. Den första delen introducerar hur man dissekerar mygga midgut, isolera cultivable bakterier kolonier, och identifiera bakterier arter. Den andra delen ger förfarandet för att generera antibiotikabehandlade myggor och återinföra en specifik bakterieart.

Midguts av myggor behandlas med antibiotika och utan antibiotika togs ut för DNA extraktion, och qPCR utfördes med universella bakteriella primers. Figur 1 visar uttrycket av bakteriell 16S rRNA i kontrollgruppen och antibiotikabehandling gruppen. Resultaten visar att cirka 98% av tarmbakterierna har tagits bort, och tarmsterilisering av penicillin och streptomycin var framgångsrik.
Med de beskrivna metoderna isolerades och identifierades bakteriestammar. C. meningosept...

Watch this Scientific Journal Video about A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes at JoVE.com

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

En bakteriell oral utfodring assay med antibiotikabehandlade myggor

Denna artikel presenterar ett protokoll för att undersöka effekten av enskilda mygga tarmbakterier, inklusive isolering och identifiering av mygga midgut cultivable mikrober, antibiotika utarmning av mygga tarmbakterier, och återinföra en specifik bakterie arter.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mosquito midgut hamnar en komplex gemenskap av mikrober som påverkar värdmetabolism, reproduktion, fitness, och veterinär kompetens. Med varje gut mikrob är en annan effekt. Denna video introducerar förfarandet för att studera respektive roll för varje bakterie stam eller värd fysiologi.För att förvärva en kultur av tarmbakteriella kolonier dissekerar mygga midgut under sterilt tillstånd. Jorda dissekt midgut, serotologinate, och sprids över agar plattan. Plocka enstaka kolonier från plattan, och identifiera bakteriearter via deras 16 SRNA-gensekvens.Mata myggorna med COD Emboss som innehåller antibiotika i på varandra följande av tre dagar för att ta bort tarmfloran. Effektiviteten av antibiotikabehandling kan bekräftas genom att dissekera midgut av aseptiska mygga för kolonibildande enhet assay före efterföljande extremister. Sedan återinföra specifika bakterier arter som tidigare isolerats från mygga gut via oral utfodring assay.Bakteriernas inverkan på värdfysiologin skulle kunna utvärderas genom att jämföra de obehandlade myggorna, de antibiotikabehandlade myggorna och myggorna återinförde specifik återhållsamhet. Midgut dissekering och de odlingsbara bakterier isolering. Till att börja med samlar myggorna i bur med en aspirator och cell myggorna i uppsamlingslådan.Bedöva myggorna genom att utsätta för en temperatur på 4 grader i tre till fem minuter. Håll myggorna sövda genom att placera dem i en iskall Petriskål. Desinficera bänken, dissekera mikroskop, och tlyktor genom att spruta 75%etanol för att undvika kontaminering av bakterier från miljön.Ytbehandla myggan sterilisera genom tejpning och skakning dem i 75%etanol i tre minuter och skölj två gånger med PBS buffert. Bisekt myggan separat på en steril glasrutschbana som innehåller din droppe PBS. Ta försiktigt bort benen, vingarna och huvudet på myggan med hjälp av tsnare.Kläm myggans bröst och den sista delen av buken var tämpningar och dra isär för att isolera matsmältningskanalen. Använd forceps för att ta bort grödan och det malpighian röret från matsmältningskanalen. Grödan är placerad vid pnterior av midgut och utbuktningar efter intagande av socker vatten.Malpighian rör är grupp av slanka utsöndringsrör på korsningen av midgut och hindgut. Placera den dissekerade makeupen i EP-röret med 200 mikroliters steril PBS-buffert och slipa den med den sterila slippastoren i den rena bänken. Spannmål för att ladda homogenatet till tre tempo vanföreställningar vid 50 mikroliter av varje villfarelse till LB agar plattan och desperat platta.Inkubera plattan som 37 grader i en till två dagar tills enstaka kolonier är genomförbara. Plocka enstaka kolonier i en 150 milliliter konisk kolv som innehåller 50 milliliter lb behåar medium. skaka bakterierna i 37 grader över natten.Artidentifikation. Extrahera TOTO DNA genom bakteriell genomisk DNA konstruktion kit och förstärka 16 SRDNA av PCR. Återvinning och rening av DNA-fragment från PCR-produkter av Ambrose gelelektrofores och den drösåtervinningssatsen.Utförde DNA-sekvensering på de renade DNA-fragmenten för att ha en uppnådd bakterie kedjar ordnar. Kör blast sökning till en fråga 16 SRNA gensekvens identifiera bakterier mot bakterier och arkéer och databas. Identifiering till artnivån definierades som större än eller lika med 99%16 SRDNA-sekvenslikhet med närmaste lagbankpost.Isolatet tilldelades den till motsvarande, släkte när är 16 SRDNA sekvens, likhet var mindre än 99%och större än eller lika med 95%antibiotika behandling och bakterien återintroduktion. väga den erforderliga mängden sackaros penicillin och streptomycin för att förbereda oss 10%sackaroslösning, inklusive att försöka 20 enheter penicillin och 20 mikrogram streptomycin per milliliter. Infiltrera bomullstussarna i sackaroslösningen som innehåller antibiotika och placera den över toppen av pappersmuggen som innehåller mygga.Täck bomullstussen med en 10 centimeter Petriskål för att förhindra att en vattnet avdunstar. Byt ut bomullstussarna två gånger dagen och mata myggan i på varandra följande tre dagar. Myggor är indelade i två grupper.Den första gruppen placerades i en myggkopp utan någon behandling, någon bomullstuss läkare med 10%Så kors gavs dagligen. Den andra gruppen behandlades med antibiotika och servera i tre dagar. I varje grupp dissekerades Sergei myggor.Mikan extraherades för total DNA-extraktion och QPCR utfördes med hjälp av universella bakterieprimrar, figur ett visar uttrycket av 16 SRNA i kontrollgruppen och antibiotikabehandlingsgruppen. Resultaten visar att kostnaden eller förverkligandet av penicillin och streptomycin var framgångsrik. förbereda bakteriell lösning, mäter en bakterie lösning i viruset med en spektrofotometer, tillsätt en OT bakterier suspension i EP-röret.Centrifugera suspensionen vid 5, 000 RCA i fem minuter i fyra grader Kassera supernatanten, tvätta bakteriepallen försöker med steril PBS-buffert. Åter upphäva bakteriell pall med 200 mikroliters steril PBS buffert Lägg 600 microliter, 10%sackaroslösning, 200 microliter ATP och 200 microliter bakteriell suspension i en ny AP-röret och blanda väl. Alternativt kan bakterierna åter suspenderas i värme i aktivera ditt blod.Förberedelse av uppvärmning aktiverat blod. koagulera färskt blod med antikoagulantia röret, ta två till tre milliliter färskt blod. centrifug vid 1000 i 10 minuter i fyra grad för att separera plasma och blodkroppar.Samla in plasman i ett nytt EP-rör och häri aktiveras aktiveras i 56 grader i en timme. Tvätta Blast hus genom dina tider med steril PBS buffert. Skölj suspenderat spränghus med uppvärmning aktiverad plasma.Montera membran och utfodring system. Dra filmsjukan maximalt. fixera med plastringen och arbetsplatsens parafilm för att undvika att läcka långsamt tillsätter den beredda bakterielösningen till matarenheten, till maximal plånbok.För att undvika att bubblan föll från en riktning och försegla matarenheten. Anslut strömförsörjningen. Vänta tills temperaturen når 37 grader Monterat matarenheten med bakterielösning på mataren.Innan utfodring bakterier myggor bör stoppas i 24 timmar för att metabolisera antibiotika. För matarenheten på papperskoppen med myggor, låt sedan utfodring i 90 minuter. Fullt uppmuntras myggor skulle kunna plockas ut för vidare studier.Representativa resultat. Figur två visar oss den genomsnittliga utmärkelsen per mygga. Efter tomt utfodring av antibiotika behandlas myggorna vi ser meningosepticum.Figur tre visar uttrycket av en variant utveckling relaterade gener 24 timmar efter blod måltid som innehåller C meningosepticum. Resultaten visar att det inte sker någon betydande förändring i kontrollgruppens och fadinggruppens äggproduktion. Tack för ditt intresse för bakterier eller en utfodring uppsats med antibiotika behandlade myggor.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Injektion av ett. stephensi embryon till Generera malaria resistenta myggor

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

Förhindra spridning av malaria och denguefeber att använda genetiskt modifierade myggor

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Protokoll för oral infektion av ordningen fjärilar larver med baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated gene Knockdown och<em&gt; In Vivo</em&gt; Diures Analys hos vuxna kvinnliga<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Myggor

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-detektion analys för Malaria Överföring Myggor

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Fettrik Utfodring Paradigm för Larvernas Zebrafish: Feeding, Live avbildning och kvantifiering av matkonsumtionen

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Att upprätthålla Aedes aegypti myggor infekterade med Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Muntliga bakterieinfektion och Shedding i Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoll för testning av romanen insektsbekämpning kemier mygg toxicitet

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Tvingade salivering som en metod att analysera vektor kompetens av myggor

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...