Name: spectrophotometric screening for potential inhibitors of cytosolic glutathione s-transferases
Uploaded: 2020-10-10T14:30:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door de CANSEARCH Foundation. De auteurs willen mevrouw Laurence Lesne en de heer Yoann Sarmiento erkennen voor technische bijstand, vooral bij het uitvoeren van de replicerende experimenten, terwijl het standaardiseren van de tests met remmers. Vruchtbare discussies en input van de heer Denis Marino, Dr Simona Mlakar en Dr Vid Mlakar worden zeer erkend. Wij danken Dr.Patricia Huezo-Diaz Curtis voor haar hulp met de vertelling van de video. We danken Dr Muthukumar voor zijn inbreng in silico voorspellingen. We danken ook de heer Darren Hart voor zijn hulp in het Engels bewijs lezen van dit manuscript.

1. Bereiding van de GST-enzymoplossing
OPMERKING: De procedure voor de bereiding van de enzymoplossing hangt af van de vraag of de eenheden van enzymatische activiteit al dan niet vóór de test bekend zijn. Een enzymatische eenheid is de hoeveelheid enzym die nodig is om 1 μmol product per minuut te synthetiseren. Enzymatische activiteit wordt vertegenwoordigd in eenheid/mL of μmol/min/mL en is afhankelijk van de verdunning van de enzymatische oplossing. Specifieke enzymatische activiteit wordt vertegenwoordigd in eenheid/mg of μmol/min/mg en is uitsluitend afhankelijk van de zuiverheid van de oplossing. Beide kenmerken worden hieronder bepaald. Als de enzymatische eenheid van een geïsoleerde GST-isovorm onbekend is, moet worden geschat dat de enzymatische concentraties voor elke reactie worden aangepast en reproduceerbare resultaten worden opgeleverd.
<ol><li>Als de enzymatische eenheid van de GST die in de test wordt gebruikt, bekend is:<ol>
<li>Bereid een verse voorraadoplossing van het GST-enzym op 0,1 U/mL in water en ga vervolgens verder met stap 2. LET OP: Deze oplossing kan gedurende enkele maanden of voor langere perioden bij -20 °C in aliquots of bij -80 °C worden bewaard, maar de vries-/dooicyclus moet worden vermeden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als de enzymatische eenheid van de GST gebruikt in de test is onbekend:<ol>
<li>Kwantificeer de eiwitconcentratie van de enzymoplossing met behulp van een bicinchoninic acid (BCA) eiwittest, of een andere kit.</li>
		<li>Verdun de eiwitoplossing tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 0,02 mg/mL.</li>
		<li>Voeg 20 μL van de enzymoplossing, 20 μL GSH 25 mM (moleculair gewicht: 307,32 g/mol) en 150 μL van dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) toe aan een plaat met 96 put. Voeg voor de blanco 20 μL water toe in plaats van de enzymoplossing.</li>
		<li>Voeg 10 μL CDNB 50 mM (moleculair gewicht: 202,55 g/mol) substraat toe aan elke put.</li>
		<li>Stel op een spectrofotometrische microplaatlezer de parameters voor het lezen van de putten in op 340 nm. Het wordt aanbevolen om de absorptie van elke minuut gedurende 10 minuten te meten.</li>
		<li>Plaats de plaat in de microplatelezer en begin met met meten volgens de instellingen van stap 1.2.5.</li>
		<li>Bereken de verandering in absorptie per minuut voor de enzymatische monsters en de blanco. OPMERKING: Controleer of de reactie lineair is door absorptie op y-as en minuten op de x-as in te plotten. Als de reactie niet lineair is en een plateau bereikt, betekent dit dat al het substraat wordt gebruikt en de reactie te snel is. Dus, vermindering van de hoeveelheid enzym toegevoegd aan de put door het verdunnen van de voorraad oplossing met twee.</li>
		<li>De absorptiewaarden van de testmonsters corrigeren.</li>
		<li>Met vergelijking 1, die de Beer-Lambert wet vertegenwoordigt, bereken de concentratie van GS-DNB gevormd (in μM) door de reactie elke minuut. Vergelijking 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ01v2.jpg"> wanneer C de concentratie van het substraat in μM is, is A340/min de verandering in absorptie per minuut, gemeten in stap 1.2.7, ε de molaire extinctiecoëfficiënt is voor de CDNB-conjugaat bij 340 nm (0,0096 μM-1*cm-1),en l is de lengte van het lichtpad in de put (in cm). Voor een 96-put plaat gevuld met 200 μL enzymatische oplossing, de padlengte is ongeveer 0,55 cm. Deze waarde kan variëren afhankelijk van het plaatmodel en moet worden geverifieerd met de fabrikant.</li>
		<li>Om de hoeveelheid product in één put in μmol/min te bepalen, vermenigvuldigt u de gevonden resultaten met vergelijking 1 met het volume van de oplossing, 2 x 10-4 L.</li>
		<li>Normaliseer de activiteit per hoeveelheid eiwit die wordt gebruikt door de resultaten van stap 1.2.9 te delen door 4 x 10-4 mg. Het resultaat is de specifieke enzymatische activiteit in eenheid/mg of μmol/min/mg. OPMERKING: Als de verdunning in stap 1.2.6 werd gewijzigd, vanwege een niet-lineaire reactie, pas dan de eiwithoeveelheid dienovereenkomstig aan.</li>
		<li>Om de enzymatische activiteit te vinden, pas de resultaten aan de eiwitconcentratie in mg/mL aan door de specifieke enzymatische activiteit in stap 1.2.10 met 0,002 mg/mL te vermenigvuldigen. Dit geeft de enzymatische activiteit in eenheid/mL of μmol/min/mL. OPMERKING: In tegenstelling tot de enzymatische activiteit zal deze maatregel niet veranderen afhankelijk van de verdunning van de eiwitoplossing. Zelfde noot als stap 1.2.10 maar voor de eiwitconcentratie.</li>
		<li>Bereid een voorraadoplossing van het GST-enzym voor op 0,1-eenheid/mL in water en ga vervolgens verder met stap 2. LET OP: Deze oplossing kan gedurende enkele maanden of voor langere perioden bij -20 °C in aliquots of bij -80 °C worden bewaard, maar de vries-/dooicyclus moet worden vermeden. Controle van de enzymatische activiteit wordt aanbevolen als de experimenten gedurende een langere periode worden uitgevoerd omdat de eiwitoplossing kan worden aangetast.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Meting van de Michaelis-Menten constante van de GST-isoform voor CDNB
LET OP: De procedure wordt uitgelegd voor een CDNB substraat, maar kan worden toegepast op elk ander substraat, zoals GSH. Elke concentratie van CDNB heeft zijn eigen blanco nodig, omdat de absorptie bij 340 nm zal toenemen volgens de CDNB-concentratie.
<ol><li>Bereid zes verschillende concentraties van CDNB voor, variërend van 10 mM tot 100 mM, in ethanol 95% (v/v).</li>
	<li>Bereid de testoplossing voor met 10 μL CDNB, 20 μL GST-enzym, 20 μL GSH 25 mM en 150 μL DPBS. Voeg voor de blanco, in plaats van de CDNB-oplossing, slechts 10 μL ethanol 95% toe.</li>
	<li>Bereid een blanco voor elke CDNB-concentratie, met 10 μL CDNB, 20 μL water, 20 μL GSH 25 mM en 150 μL DPBS.</li>
	<li>Neem de absorptie op bij 340 nm per minuut gedurende 10 minuten met een microplate lezer.</li>
	<li>De absorptie loos door de resultaten van de blanco af te trekken van die van de juiste andere testputten. Bereken volgens de gemeten waarden de snelheid van de reactie met vergelijking 2. Vergelijking 2: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ02v2.jpg"> wanneer A340/min de experimenteel bepaalde verandering in absorptie per minuut is, is hettotaal V (totaal volume) gelijk aan 0,2 mL,V-enzym (volume enzym) 0,02 mL en εGS-DNB de molaire extinctiecoëfficiënt is van de GS-DNB-conjugaat op 340 nm (9,6 mM-1*cm-1). In een 200 μL put van een 96-put plaat is de padlengte 0,55 cm (afhankelijk van het plaattype) en de uitstervingscoëfficiënt gelijk aan 5,3 mM-1. De snelheid kan worden weergegeven door μmol/mL/min of mM/min.</li>
	<li>Zet de Michaelis-Menten grafiek met de snelheid (op de y-as) tegen de substraatconcentratie (op de x-as).</li>
	<li>Definieer de maximale snelheid (Vmax)van de reactie en de Michaelis-Menten constante (Km) (d.w.z., de substraatconcentratie op de helft van Vmax). OPMERKING: Met behulp van software zoals GraphPad Prism kan de enzymkinetiekcurve worden gemonteerd met behulp van een niet-lineaire regressie voor de berekening van de enzymkinetiekparameters van Michaelis-Menten, zoals Vmax en Km.</li>
	<li>Bereid een CDNB voorraadoplossing voor op 20 keer de berekende Km in ethanol 95% (v/v).</li>
</ol>3. Absorptie van de potentiële GST-remmer
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om te onderzoeken of de potentiële GST-remmer die in de reactie wordt gebruikt, een metaboliet produceert dat de absorptie verhoogt bij de golflengte die wordt gemeten. Als dit het gebeurt, zal de hoeveelheid gebruikte remmer een impact hebben op de resultaten en moet voor elke concentratie een specifieke blanco worden voorbereid.
<ol><li>Verdun de remmer tot de vereiste concentraties. OPMERKING: Bereid drie verschillende verdunningen voor, bij voorkeur de laagste, middelste en hoogste concentraties die tijdens de remmingstest zijn getest. De maximale DMSO-concentratie in de put moet gelijk zijn aan of minder dan 1% (v/v). We testten het effect van de DMSO-concentratie op de test in ons laboratorium, en 1% heeft de GST-activiteit niet significant veranderd.</li>
	<li>Voeg in een plaat met 96 putten 2 μL van de potentiële GST-remmer, 20 μL GSH 25 mM en 168 μL DPBS toe. Gebruik een passende controle, zonder remmer, door het toevoegen van gelijke volumes van het oplosmiddel gebruikt voor de remmer monsters.</li>
	<li>Broed de reactie gedurende 10 minuten uit om de enzymatische reactie te beginnen. OPMERKING: Deze stap kan worden geoptimaliseerd, door het testen van verschillende incubatietijden, met de dubbele doelstellingen van het begin van de reactie, terwijl het vermijden van totale uitputting van het substraat.</li>
	<li>Voeg 10 μL van CDNB toe aan elke put om een definitieve concentratie te bereiken op de Km in stap 2.</li>
	<li>Schud de plaat enkele seconden.</li>
	<li>Neem de absorptie op bij 340 nm per minuut gedurende 10 minuten met een microplate lezer.</li>
	<li>Bereken de verandering in absorptie per minuut.</li>
	<li>Controleer de verandering in absorptie in vergelijking met zowel de blanco reactie als de negatieve controlereactie zonder remmer.<ol>
<li>Als er een significante verandering is, gebruikt u blanco voor elke remmerconcentratie om de resultaten aan te passen. OPMERKING: Dit resultaat geeft aan dat de bestanddelen van de reactie, zonder GST-enzym, spontaan reageren en een metaboliet produceren dat de absorptie bij 340 nm verhoogt. Om deze extra absorptie te corrigeren, moet voor elke concentratie een specifieke blanco worden gemeten.</li>
		<li>Als er geen significante verandering in absorptie is, gebruik dan een algemene blanco, die alleen het oplosmiddel bevat dat wordt gebruikt voor de GST-remmerverdunning, voor alle concentraties.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Remmingstest van de beoordeling van GST en IC50
<ol><li>Bereid negen concentraties van de potentiële GST-remmer voor. LET OP: De concentraties kunnen worden aangepast aan de hand van de resultaten. Het doel is om de onderste en bovenste plateaus van de niet-lineaire regressiecurve te definiëren. Zie de discussiesectie voor meer informatie over deze stap.</li>
	<li>Bereid de testoplossing voor door 20 μL van de GSH-oplossing op 25 mM te verdunnen met 148 μL DPBS. Pas het volume aan op basis van het aantal putten dat in de test wordt gebruikt.</li>
	<li>Bereid de enzymatische reactie in een duidelijke plaat van 96 put in een eindvolume van 190 μL. Het wordt aanbevolen om een meerkanaals pipet te gebruiken voor deze stappen.<ol>
<li>Voeg voor de testputten 20 μL van de enzymoplossing, 2 μL van de potentiële GST-remmeroplossing en 168 μL van de testoplossing toe.</li>
		<li>Voeg voor het besturingselement 20 μL van de enzymoplossing, 2 μL van het verdunningsmiddel dat wordt gebruikt voor de GST-remmer en 168 μL van de testoplossing.</li>
		<li>Voeg voor de lege putten 20 μL water, 2 μL van de potentiële GST-remmer en 168 μL van de testoplossing toe. OPMERKING: Als de GST-remmer de golflengte van 340 nm absorbeert, moet voor elke geteste concentratie een specifieke blanco worden voorbereid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 10 μL van de CDNB-oplossing toe op 20x Km aan elke put, inclusief de blanco. Het wordt aanbevolen om een meerkanaals pipet te gebruiken voor deze stap.</li>
	<li>Schud de plaat enkele seconden.</li>
	<li>Meet de absorptie op 340 nm per minuut gedurende 10 minuten met behulp van een microplate-lezer.</li>
	<li>De absorptie loos maken door de resultaten van de testput blanks af te trekken.</li>
	<li>Normaliseer de resultaten door de waarden verkregen met behulp van de GST-remmeroplossing te delen door de absorptie van de controle per minuut zonder remmer.</li>
	<li>Zet de niet-lineaire regressiegrafieken van de logaritmische concentratie (x-as) van de remmer in kaart tegen de GST-activiteit (y-as) en bepaal zo de IC50. OPMERKING: GraphPad Prism berekent de IC50 van de niet-lineaire regressiepercelen door de concentratie te voorspellen die 50% van de enzymatische activiteit in de controle zal weergeven. De voorspelling is gebaseerd op de onderste en bovenste plateaus, evenals de curve van de helling gevormd door de sigmoid grafiek.</li>
</ol>5. Beoordeling van de Kien het type remming
<ol><li>Bereid vier verschillende CDNB-concentraties voor: drie hoger en één gelijk aan de eerder gevonden Km.</li>
	<li>Bereid drie verschillende GST-remmerconcentraties voor, gelijk aan of onder de eerder gevonden IC50.</li>
	<li>Voer de remmingstest uit zoals beschreven in de stappen 4.2 tot en met 4.7.</li>
	<li>Bereken de snelheid van de reacties met vergelijking 2.</li>
	<li>Plot de Michaelis-Menten grafieken voor elke remmer concentratie en bereken de Vmax en Km van elke reactie.</li>
	<li>Volgens de veranderingen in Vmax en Km bij het gebruik van verschillende concentraties, beoordelen van de GST remmer de wijze van remming. OPMERKING: Deze stap wordt nader uitgelegd in de resultaten- en discussiesecties.</li>
	<li>Op basis van de wijze van remming, bereken de Ki. OPMERKING: In GraphPad Prism worden verschillende vergelijkingen gebruikt om de Ki te berekenen op basis van de aard van de remming. De gebruikte vergelijkingen zijn gebaseerd op de waargenomen Km en Vmax na toevoeging van de remmer en vergeleken met de controle Km en Vmax.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mannervik, B., Danielson, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+transferases--structure+and+catalytic+activity.">Glutathione transferases--structure and catalytic activity.</a> CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).</li><li>Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glutathione+S-transferases.">Human glutathione S-transferases.</a> The International Journal of Biochemistry. 26 (3), 295-308 (1994).</li><li>Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+diversity+and+tissue+distribution+of+human+glutathione+S-transferases:+interpretations+based+on+electrospray+ionization-MS+and+peptide+sequence-specific+antisera.">Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera.</a> Biochemical Journal. 325, 481-486 (1997).</li><li>Beckett, G. J., Hayes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+S-transferases:+biomedical+applications.">Glutathione S-transferases: biomedical applications.</a> Advances in Clinical Chemistry. 30, 281-380 (1993).</li><li>Oakley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+transferases:+a+structural+perspective.">Glutathione transferases: a structural perspective.</a> Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).</li><li>Townsend, D. M., Tew, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutathione-S-transferase+in+anti-cancer+drug+resistance.">The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance.</a> Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).</li><li>Tew, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-associated+Enzymes+in+Anticancer+Drug+Resistance.">Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance.</a> Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).</li><li>Laborde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+transferases+as+mediators+of+signaling+pathways+involved+in+cell+proliferation+and+cell+death.">Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death.</a> Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).</li><li>Adler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+JNK+signaling+by+GSTp.">Regulation of JNK signaling by GSTp.</a> The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).</li><li>Cho, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+S-Transferase+Mu+Modulates+the+Stress-activated+Signals+by+Suppressing+Apoptosis+Signal-regulating+Kinase+1.">Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).</li><li>Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+Transferases.">Glutathione Transferases.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 45 (1), 51-88 (2005).</li><li>Lo, H. W., Ali-Osman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+polymorphism+and+function+of+glutathione+S-transferases+in+tumor+drug+resistance.">Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance.</a> Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).</li><li>Ansari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+S-transferase+gene+variations+influence+BU+pharmacokinetics+and+outcome+of+hematopoietic+SCT+in+pediatric+patients.">Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients.</a> Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).</li><li>Mahajan, S., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+inhibitors+and+pro-drugs+targeted+to+glutathione+S-transferases.">The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).</li><li>Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+transferases:+substrates,+inihibitors+and+pro-drugs+in+cancer+and+neurodegenerative+diseases.">Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases.</a> Oncogenesis. 7 (1), 8 (2018).</li><li>Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+potential+of+curcumin:+preclinical+and+clinical+studies.">Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies.</a> Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).</li><li>Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+causes+the+growth+arrest+and+apoptosis+of+B+cell+lymphoma+by+downregulation+of+egr-1,+c-myc,+bcl-XL,+NF-kappa+B,+and+p53.">Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53.</a> Clinical Immunology. 93 (2), 152-161 (1999).</li><li>Golonko, A., Lewandowska, H., &#346;wis&#322;ocka, R., Jasi&#324;ska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+as+tyrosine+kinase+inhibitor+in+cancer+treatment.">Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512 (2019).</li><li>Awasthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-glutathione+interactions+and+the+role+of+human+glutathione+S-transferase+P1-1.">Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1.</a> Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).</li><li>Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+glutathione+S-transferases+by+curcumin+and+analogues.">Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues.</a> Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).</li><li>Dubey, V., Owusu-Apenten, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+Restores+Glutathione-S-Transferase+Activity+for+LNCaP+Prostate+Cancer+Cells.">Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells.</a> Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).</li><li>Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+S-transferases.+The+first+enzymatic+step+in+mercapturic+acid+formation.">Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).</li><li>Johnson, K. A., Goody, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Original+Michaelis+Constant:+Translation+of+the+1913+Michaelis-Menten+Paper.">The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper.</a> Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).</li><li>Ochs, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Enzyme+Inhibition.">Understanding Enzyme Inhibition.</a> Journal of Chemical Education. 77 (11), 1453 (2000).</li><li>Bisswanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+assays.">Enzyme assays.</a> Perspectives in Science. 1 (1), 41-55 (2014).</li><li>Acker, M. G., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+design+and+reporting+of+enzyme+assays+in+high-throughput+screening+applications.">Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications.</a> Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).</li><li>Cheng, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).</li><li>Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Balanced+Conditions+for+Inhibitor+Screening+Assays+That+Target+Bisubstrate+Enzymes.">Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).</li><li>Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+putative+substrates+and+inhibitors+for+Glutathione+S-transferases+using+computational+methods.">Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods.</a> Zenodo. , (2017).</li><li>Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intuitive+Look+at+the+Relationship+of+Ki+and+IC50:+A+More+General+Use+for+the+Dixon+Plot.">An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot.</a> Journal of Chemical Education. 80 (2), 214 (2003).</li><li>Wang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+curcumin+in+buffer+solutions+and+characterization+of+its+degradation+products.">Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).</li><li>Copeland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+enzyme+inhibitors+in+drug+discovery.+A+guide+for+medicinal+chemists+and+pharmacologists.">Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists.</a> Methods of Biochemical Analysis. 46, 1 (2005).</li><li>Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparability+of+Mixed+IC50+Data+-+A+Statistical+Analysis.">Comparability of Mixed IC50 Data - A Statistical Analysis.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+inhibitor+Ki+and+inhibitor+type+from+the+concentration+of+inhibitor+for+50%+inhibition+for+Michaelis-Menten+enzymes.">Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes.</a> Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).</li><li>Brooks, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+Enzymatic+Assays+for+HTS.">Basics of Enzymatic Assays for HTS.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).</li><li>Arakawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hepatic+glutathione+transferase+Mu+1+and+Theta+1+activities+in+humans+and+mice+using+genotype+information.">Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).</li><li>Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+human+class+Theta+glutathione+S-transferase+T1-1+can+catalyse+the+activation+of+dichloromethane,+a+liver+and+lung+carcinogen+in+the+mouse.+Comparison+of+the+tissue+distribution+of+GST+T1-1+with+that+of+classes+Alpha,+Mu+and+Pi+GST+in+human.">Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human.</a> The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We bieden een protocol dat elke stap van een spectrofotometrische GST-enzymtest beschrijft, om putatieve remmers te screenen(figuur 1, tabel 1) en hun remmende potentie te kwantificeren. We hebben ook de nadruk gelegd op de meest cruciale criteria om te overwegen voor nauwkeurige enzymtesten die reproduceerbare resultaten opleveren. Belangrijke voordelen van het beschreven protocol ten opzichte van andere colorimetrische methoden of massaspectrometrie is dat dit protocol snel en gemakkelijk uit te voeren is en kwantitatieve metingen van de GST-activiteit en de remmingskracht van gescreende moleculen biedt.
We presenteren de manier van berekenen van de twee belangrijkste Michaelis-Menten parameters van een enzymremmer: de IC50 en de Ki. Een krachtige remmer zal de laagst mogelijke Ki en IC50 uitoefenen, wat aangeeft dat de affiniteit tussen de remmer en het enzym hoog is30. Aangezien IC50 afhankelijk is van de enzymconcentratie en testomstandigheden33, kan het moeilijk zijn om deze waarde te gebruiken om remmers uit verschillende experimenten te vergelijken of verkregen te zijn met behulp van andere testvoorwaarden34. Met behulp van de constante van remming Ki is een betere indicator van de remmende potentie van potentiële verbindingen. Kik kan worden gebruikt om twee remmers te vergelijken met verschillende wijzen van remming, omdat het uitsluitend afhankelijk is van de affiniteit tussen de remmer en het enzym. Echter, om een duidelijk idee van de aard van de remming moet men bepalen zowel van de parameters van de remmer30. We maten de IC50 en Ki van curcumins als respectievelijk 31,6 ± 3,6 μM en 23,2 ± 3,2 μM, wat aangeeft dat deze verbinding een krachtige GST-remmer is. Deze resultaten bevestigden de in silico voorspellingen, die de Ki waarden geschat tussen 27,4 tot 78,1 μM voor verschillende menselijke GST isoforms en curcumine.
Enzymatische activiteit of reactiesnelheid en hoeveelheid enzym Zoals hierboven vermeld, ic50 is afhankelijk van de enzymconcentratie, en het uitvoeren van een experiment met een onbekend niveau van enzymatische activiteit kan leiden tot valse conclusies33. Om te controleren op andere factoren, die remmende activiteit kunnen verminderen, moet men overwegen en meten enzymatische activiteit voor elke nieuwe partij van GST's. Bijvoorbeeld, afbraak van een enzymatische partij, veroorzaakt door te veel bevriezing / dooi cycli, kan de activiteit te verminderen en dus leiden tot een lagere IC50, zelfs als het experiment werd uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden. Met andere woorden, met behulp van 0,01 eenheden enzym zal niet dezelfde resultaten als het gebruik van 1 eenheid. Het gebruik van te veel enzymen kan leiden tot een snelle uitputting van het substraat en de reactie zal geen lineaire vorm hebben. Deze parameter zou dus kunnen leiden tot een onnauwkeurig resultaat, omdat er na een lange incubatietijd geen verandering in absorptietijd zou worden waargenomen.
Km Waarde Om de beste omstandigheden te garanderen voor de beoordeling van het type remming dat door een remmer wordt vertoond, moet de substraatconcentratie gelijk zijn aan of lager zijn dan de Michaelis-Menten-constante (Km). Km wordt vertegenwoordigd door de concentratie van substraat die nodig is om de helft van de actieve plaatsen op het enzym28te bezetten. Een hogere substraatconcentratie kan bijvoorbeeld een concurrerende remmer tegengaan en het beoordelen van dit soort remming zal in een dergelijke instelling moeilijk zijn. Een van de cruciale stappen in deze methodiek is dus de bepaling van de Km van het enzym voor het geselecteerde substraat (hier CDNB). In sommige studies werd deze waarde niet bepaald en dit kan leiden tot verkeerde conclusies over het patroon van remming veroorzaakt door de remmer, en, als de wijze van remming onjuist is, zal de Ki onjuist worden berekend als de vergelijking zich baseert op het patroon van remming26,28. Als een andere GST-isoform wordt getest, is een nieuwe beoordeling van de Km-waarde verplicht, omdat deze waarde uniek is voor een paar enzymen en liganden. Omdat we een concentratie van CDNB iets lager gebruikten dan de Km (0,2 mM), die we omschreven als 0,26 ± 0,08 mM, werd de voorspelde concurrentiemodus van remming van curcumine op GST nauwkeurig bepaald.
IC50 Het verkrijgen van een goede sigmoïdale curve waarmee de IC50 te schatten vereist het vinden van zowel de bodem en top plateaus. Het onderste plateau vertegenwoordigt de concentraties van een remmer die de maximale remmende activiteit bieden. In sommige gevallen kan een verbinding het enzym niet volledig remmen, zelfs niet bij hoge concentraties, vanwege technische problemen zoals oplosbaarheid. Echter, tools zoals GraphPad Prism kan het onderste plateau vrij nauwkeurig passen. Het bovenste plateau bestaat uit concentraties van de remmer, die onvoldoende zijn om het enzym te remmen, en daarom is de activiteit maximaal. Beide plateaus zijn cruciaal voor het bepalen van de IC50 en concentraties daartussen, om de helling van de curve te vinden, dan kan de IC50 worden afgeleid van de vorm van de sigmoïde curve35. Curcumine is slecht oplosbaar in water, dus de maximale concentratie die in deze test wordt gebruikt, is beperkt, om neerslag in de testoplossing te voorkomen. Zo werden minder geconcentreerde oplossingen gebruikt, die de GST-activiteit niet volledig remmen. Dit bracht problemen met zich mee voor de bepaling van het onderste plateau. Om dit probleem tegen te gaan, voorspelden we bodemwaarden op basis van de niet-lineaire regressiegrafiek, die een IC50 van 31,6 ± 3,6 μM voor curcumine(figuur 3A). Voor ethacrynic zuur, was er geen noodzaak om de waarden voor het onderste plateau te voorspellen als deze verbinding is oplosbaar in de testoplossing en de IC50 werd gemeten op 6,6 ± 1,1 μM.
Deze methode kan worden toegepast op de meest uitgedrukte GST-isovormen bij de mens, namelijk GSTA1, GSTM1 of GSTP1. Dit protocol is echter niet geschikt om de activiteit van de GSTT1-isovorm te kwantificeren, aangezien CDNB geen substraat is voor dit subtype. 36. Ondertussen kan het protocol enigszins worden gewijzigd om dit probleem tegen te gaan. Bijvoorbeeld , met behulp van 1,2-epoxy-3-(4'-nitrofenoxy)propaan (ENPP) als substraat voor GSTT1 en meet de hoeveelheid conjugaat op 360nm in plaats van 340nm. 37.
Stappen van protocol kan worden aangepast en toegepast om GST activiteit en remmer testen in celcultuur experimenten te testen. Meting van de GST-activiteit op cellen die met en zonder GST-remmer worden behandeld, geeft aan of deze verbinding in een dergelijke experimentele omgeving kan worden gebruikt. Het is vooral interessant wanneer de remmer lipofiel is. We hebben bijvoorbeeld gepresenteerd dat curcumine een krachtige GST-remmer is met behulp van dit protocol. Niettemin kan de toepassing ervan op cellulaire studies worden beperkt, omdat het molecuul slecht oplosbaar is in water en snel degradeert in medium. 31 Een andere verbetering van dit protocol is mogelijk met betrekking tot de niet-isoforme specificiteit van het substraat CDNB. Met behulp van dit protocol in celstudies geeft alleen informatie over de algehele GST-activiteit, maar niet over de activiteit van het nauwkeurige GST-subtype. Door isoform-specifiek substraat toe te voegen en/of specifieke recombinant GST-isoform toe te voegen, kunnen isoform-specifieke GST-remmers worden getest.
Tot slot beschrijven we een volledige procedure om GST-remmers te testen die potentieel hebben om te worden gebruikt in combinatie met elektrofiele chemotherapie. We benadrukten de cruciale stappen van een GST enzym en remming test, om potentiële interessante molecuul te testen en hun efficiëntie te bepalen als remmer met kwantitatieve waarden, de IC50 en de Ki. Deze methode kan worden toegepast op elke vermeende verbinding en uitgevoerd op de meest uitgedrukte menselijke GST-isovormen (GSTA1, GSTM1 en GSTP1), of enigszins aangepast om celkweekstudies uit te voeren met GST-remmers of de activiteit van andere interessante GST-isoform van keuze te meten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" fo:text-align="center"><tbody>
<tr>
<td>Reagentia</td>
			<td>Naam</td>
			<td>Concentratie in de testoplossing</td>
			<td>Andere</td>
		</tr>
<tr>
<td>Substraat</td>
			<td>CDNB</td>
			<td>Gemeten Km (mM)</td>
			<td>Verdund in 95% ethanol. De uiteindelijke ethanolconcentratie moet ≤ 5% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Verconjugatingssubstraat</td>
			<td rowspan="2">Gsh</td>
			<td rowspan="2">2,5 mM</td>
			<td>Verdund in water.</td>
		</tr>
<tr>
<td>De concentratie moet de oplossing verzadigen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer</td>
			<td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>pH = 7,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym</td>
			<td>Pool van GST-isovormen of zuivere isoform</td>
			<td>0,01 eenheid/mL, experimenteel bepaald.</td>
			<td>Verdund in water.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">GST-remmer</td>
			<td rowspan="2">Potentiële verbinding naar keuze</td>
			<td>IC50: 3 concentraties die maximaal remmen, 3 die minimaal remmen, en 3 ertussen.</td>
			<td rowspan="2">Verdund in DMSO en vervolgens in water, om een uiteindelijke concentratie van DMSO ≤ 1% (v/v) te hebben</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ki: 3 concentraties rond de IC50.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4" style="text-align:center;">Parameters</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4" style="text-align:center;">Kamertemperatuur (25°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4" style="text-align:center;">pH = 7,1</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4" style="text-align:center;">DMSO ≤ 1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4" style="text-align:center;">Ethanol ≤ 5% (v/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Samenvatting van de reagentia en parameters die u tijdens een GST-remmingstest moet overwegen.

Cytosolische glutathion s-transferase enzymen (GST's, EC 2.5.1.18) katalyseren de vervoeging van glutathion (GSH) in verschillende elektrofiele verbindingen, zoals chemotherapeutische agentia, om ze gemakkelijk te ontgiften en te elimineren uit het lichaam1. Zeven isovormen van cytosolic GST zijn geïdentificeerd als alfa, mu, pi, sigma, omega, theta en zeta. GST's worden voornamelijk uitgedrukt in de lever, teelballen, longen en maag-darmkanaal2. De GST alpha 1 (GSTA1) isoform is zeer uitgedrukt in hepatocyten. Het lichaam heterogeen drukt andere subtypes, met inbegrip van GST pi 1 (GSTP1) voornamelijk in de hersenen, hart en longen, en GST mu 1 (GSTM1) in de lever en teelballen3. Hoewel er een hoge sequentie homologie tussen GST isoforms, elk vertoont substraat specificiteit en is betrokken bij het metabolisme van geneesmiddelen en kanker op verschillende manieren, volgens de differentiële expressie4,5.
Elektrofiele verbindingen ofwel in het lichaam exogeen of worden endogene geproduceerd. Pesticiden, prostaglandines, kankerverwekkende stoffen en chemotherapeutische geneesmiddelen zijn enkele van de potentiële substraten voor glutathionvervoegingsreacties6. Bijvoorbeeld, elke elektro-deficiënte reactieve verbinding gevormd in een cel is waarschijnlijk een elektrofiel substraat te worden. Alkylating middelen zoals chlorambucil of melfalan worden geëlimineerd als conjugates van GSH gekatalyseerd door GST's, en verhoogde niveaus van deze enzymen zijn gecorreleerd met weerstand tegen deze verbindingen6,7.
Een andere belangrijke rol van cytosolische GST's is het reguleren van de activiteit van mitogene geactiveerde eiwitkinasen (MAPK) zoals MAPK8 (ook bekend als c-Jun N-terminal kinase, of JNK1) en MAP3K5 (ook bekend als apoptose signaalregulerende kinase 1, of ASK1)8. Sommige isovormen in hun monomerische conformatie zullen zich binden aan deze eiwitten en zo de fosforylatiecascade blokkeren. Onder normale omstandigheden zal de GSTP1 isoform MAPK8 (de activator van het c-Jun eiwit) in beslag nemen. Het combineren van de c-Jun met het c-Fos eiwit vormt de activator eiwit 1 (AP-1) transcriptiefactor, die verantwoordelijk is voor het transcriberen van indoptische genen. In gestreste cellen scheidt het complex gevormd door GSTP1 en MAPK8, wordt c-Jun geactiveerd en beginnen de genen die leiden tot apoptose te worden uitgedrukt9. Grotere expressie van deze GST isoform kan daarom blokkeren het traject, wat leidt tot een verhoogde levensvatbaarheid van de cel, meer cellulaire proliferatie, en lagere cellulaire gevoeligheid voor chemotherapie. Vergelijkbare scenario's kunnen optreden met paralogs van GSTP1, bijvoorbeeld GSTM1, die interageert met MAP3K510.
De rollen gespeeld door GST's in de drug metabolisme en in de sekwestratie van MAPKs leidde tot de hypothese dat een grotere expressie van GST's een teken van een tumorale resistentie mechanisme voor chemotherapeutische behandeling6,11zou kunnen zijn . GSTP1 is bijvoorbeeld overuitgedrukt bij tal van vormen van kanker en de aanwezigheid ervan is gecorreleerd met een slechte prognose en een verhoogde incidentie van terugval8. Polymorfisme in deze genen heeft ook aangetoond differentiële blootstelling aan geneesmiddelen en overlevingskansen voor patiënten die verschillende ziekten, versterking van het idee dat deze enzymen zijn van cruciaal belang voor mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen. Bijvoorbeeld, individuen met de GSTM1 null genotype worden geassocieerd met een lagere drug klaring en een betere overleving12,13. Er zijn verschillende mogelijke middelen om deze overexpressie tegen te gaan, zoals het gebruik van GSH-analogen, prodrugs die worden geactiveerd door vervoeging met GST's, of directe GST-remmers14,15.
Al deze methoden worden momenteel onderzocht, en een paar verbindingen zijn begonnen met klinische proeven voor hun potentieel gebruik bij patiënten. Echter, voor zover wij weten, zijn er geen verbindingen in gebruik als GST-remmers in klinische omgevingen15. Een gebrek aan specificiteit voor bepaalde isovormen of de uitputting van GSH in normale cellen, die kunnen leiden tot toxiciteiten veroorzaakt door de accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in orgaansystemen , zijn slechts enkele van de nadelen die het potentieel van GST-remmersverminderen 14,15. Het risico dat deze verbindingen andere farmacodynamische effecten op het lichaam kunnen uitoefenen, beperkt ook het gebruik ervan. Ethacrynic zuur, bijvoorbeeld, is de meest bestudeerde GST remmer in laboratoriumomgevingen, maar omdat het voornamelijk wordt gebruikt als een sterke diureticum, deze eigenschap beperkt het gebruik ervan in combinatie met andere geneesmiddelen in klinische omgevingen. Curcumine is een andere natuurlijke verbinding met succes gescreend als een GST remmer. Dit molecuul is een polyfenol ether gewonnen uit de Curcuma longa soorten kurkuma. Het heeft veelbelovende resultaten als een mogelijke behandeling optie tegen kanker door het induceren van de apoptose van verschillende soorten tumorcellijnen16,17. De verbinding kan reguleren diverse cellulaire trajecten, zoals de tyrosine kinase18 of de GST-route. Studies met zuivere eiwitten hebben zijn remmingskracht aangetoond op GSTA1, GSTM1 en GSTP119,20. Er werden echter tegenstrijdige resultaten waargenomen in kankercellen, waar een grotere intracellulaire GST-activiteit werd gemeten wanneer cellen werden behandeld met curcumine21. Zo is het belangrijk om half-maximale remmingsconcentratie (IC50) en de constante van remming (Ki)van een vermeende GST-remmer te onderzoeken met behulp van een duidelijk beschreven protocol met de juiste controles voordat verdere cellulaire experimenten worden gepland.
Screening en testen potentiële nieuwe GST-remmers is daarom van significant klinisch belang, en elke nieuwe stof gevonden moet veilig en efficiënt zijn voor gebruik in combinatie met elektrofiele geneesmiddelen. Het concentreren van onderzoek op isoform-specifieke remmers zou GST-remming in tumorweefsels kunnen toelaten die specifieke patronen van GST-expressie vertonen, waardoor de ontwikkeling van een effectieve combinatietherapie mogelijk wordt. Het vinden van remmers met differentiële remmingswijzen kan ook van belang zijn. Een concurrerende remmer die GSH als substraat gebruikt, kan bijvoorbeeld de uitputting ervan veroorzaken. Deze vermindering van de GSH-concentratie in cellen bleek oxidatieve stress in neuronen te veroorzaken, wat leidt tot apoptose. Een andere veel voorkomende remmingswijze – niet-concurrerende remming – kan niet worden teruggedraaid, zelfs niet als het substraat in hoge concentraties aanwezig is.
De snelheid van enzymatische activiteit wordt vertegenwoordigd door de Michaelis-Menten constante (Km) en de maximale snelheid (Vmax), die kan worden bepaald door het plotten van een Michaelis-Menten grafiek, met de substraat concentratie tegen de snelheid van de reactie23. Km is de concentratie van substraat die nodig is om de helft van de enzymatische actieve sites te bezetten, wat betekent dat een hoge Km minder affiniteit vertegenwoordigen. Vmax vertegenwoordigt de maximale snelheid van de reactie, bereikt wanneer alle actieve plaatsen worden bezet door het substraat. Km is gelijk aan de helft van Vmax. Er zijn drie meest voorkomende remmingswijzen: concurrerend, niet-concurrerend en niet-concurrerend. In geval van concurrentieremming bindt de remmer zich aan de actieve plaats van het enzym en concurreert met het substraat. Daarom verandert Vmax niet na toevoeging van de remmer, maar Km neemt toe, omdat er meer substraat nodig is om de remming tegen te gaan. Niet-concurrerende remming treedt alleen op wanneer het substraat een complex vormt met het enzym. In dit geval, omdat het remmingsniveau afhankelijk is van het substraat en de enzymconcentratie, dalen Vmax en Km wanneer de remmer aan de reactie wordt toegevoegd. De laatste remmingswijze is niet concurrerend en is een mix van de twee andere remmingspatronen. De remmer kan binden aan de actieve plaats van het enzym of het enzym is gebonden aan het substraat of niet. Hier Vmax vermindert na toevoeging van de remmer, maar Km verandert niet24.
Een spectrofotometrische test die de GST-activiteit gemeten werd voor het eerst ontwikkeld door Habig et al. in 1974 met behulp van 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) als substraat voor de reactie22. Vervoeging tussen GSH en CDNB vormt GS-DNB, dat een maximale lichtabsorptie vertoont op de golflengte van 340 nm, opneembaar met een spectrofotometer. Het merendeel van de techniek hieronder uitgelegd is afgeleid van Habig et al., met inbegrip van informatie over de beste instellingen en belangrijke optimalisatie punten voor een remmende test. De techniek kan worden toegepast op het screenen van potentiële GST-remmers, of gekozen door rationele selectie van geneesmiddelen met behulp van computationele voorspellingen of door literatuuronderzoek. Hoe het protocol aan te passen aan nieuw gesynthetiseerde GST eiwitten of specifieke isoforms wordt ook besproken. Bijvoorbeeld, het testen van de remmende potentie van GST isovormen vertonen een klinisch relevante polymorfisme of van single-nucleotide polymorfismen (SNPs) kan potentiële toepassingen voor dit protocol, gericht op patiënt-specifieke GST's.
Dit protocol biedt een snelle, haalbare en effectieve methode voor de screening van potentiële GST-remmers in vitro vóór andere functionele studies. De stappen die nodig zijn om de meest gemeten kenmerken van een enzymatische remmer te evalueren, worden beschreven: de remmende concentratie 50 (IC50) die een concentratie van remmer is die nodig is om de enzymatische activiteit met de helft te verminderen; en de constante van remming (Ki)die de evenwichtsconstante van de dissociatie tussen de remmer en het enzym vertegenwoordigt, kenmerkend voor de affiniteit tussen deze twee moleculen. Deze twee waarden worden gemeten door niet-lineaire regressie en het gebruik van vergelijkingen die specifiek zijn voor elke remmingswijze, respectievelijk. We tonen ook de beoordeling van dit patroon van remming, met behulp van Michaelis-Menten percelen om de verandering van Vmax en Km te bepalen na toevoeging van de remmer23,25,26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237329</td>
			<td>Substrate used for the GST enzymatic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning UV-Transparent Microplates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3635</td>
			<td>Transparent plate to perform the enzymatic assay. 
			When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8511</td>
			<td>Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>To prepare the stock of the putative inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Buffer for the enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10542382</td>
			<td>To dilute the CDNB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione S-Transferase from equine liver</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6511</td>
			<td>Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251</td>
			<td>Co-substrate for the GST enzymatic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax iD3</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>To do spectrophotometric measurments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric screening for potential inhibitors of cytosolic glutathione s-transferases

Glutathion S-transferases (GST's) zijn metabole enzymen die verantwoordelijk zijn voor de eliminatie van endogene of exogene elektrofiele verbindingen door glutathion (GSH) vervoeging. Bovendien zijn GST's regelgevers van mitogeneactiveerde eiwitkinases (MAPKs) die betrokken zijn bij apoptotische paden. Overexpressie van GST's is gecorreleerd met verminderde therapeutische werkzaamheid bij patiënten die chemotherapie ondergaan met elektrofiele alkylaatmiddelen. Het gebruik van GST-remmers kan een potentiële oplossing zijn om deze tendens om te keren en de behandelingspotentie te vergroten. Het bereiken van dit doel vereist de ontdekking van dergelijke verbindingen, met een nauwkeurige, snelle en gemakkelijke enzymtest. Een spectrofotometrische protocol met behulp van 1-chloro-2,4-dinitrobenzeen (CDNB) als het substraat is de meest gebruikte methode in de literatuur. De reeds beschreven GST-remmingsexperimenten bieden echter geen protocol dat elke fase van een optimale remmingstest detailleert, zoals het meten van de Michaelis-Menten-constante (Km)voor CDNB of indicatie van de gebruikte enzymconcentratie, cruciale parameters om de remmingskracht van een geteste verbinding te beoordelen. Daarom beschrijven we met dit protocol elke stap van een geoptimaliseerde spectrofotometrische GST-enzymtest, om bibliotheken van potentiële remmers te screenen. We verklaren de berekening van zowel de half-maximale remmingsconcentratie (IC50) als de constante van remming (Ki)-tweekenmerken die worden gebruikt om de potentie van een enzymremmer te meten. De beschreven methode kan worden geïmplementeerd met behulp van een pool van GST's gewonnen uit cellen of zuivere recombinante menselijke GST's, namelijk GST alpha 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) of GST pi 1 (GSTP1). Dit protocol kan echter niet worden toegepast op GST theta 1 (GSTT1), omdat CDNB geen substraat is voor deze isoform. Deze methode werd gebruikt om de remmingspotentie van curcumine te testen met behulp van GST's van paardenlever. Curcumine is een molecuul vertonen anti-kanker eigenschappen en toonde affiniteit met GST isoforms na in silico docking voorspellingen. We hebben aangetoond dat curcumine een krachtige concurrerende GST-remmer is, met een IC50 van 31,6 ± 3,6 μM en een Ki van 23,2 ± 3,2 μM. Curcumine heeft potentieel om te worden gecombineerd met elektrofiele chemotherapie medicatie om de werkzaamheid te verbeteren.

Michaelis-Menten constante (Km) van CDNB met GST van paardenlever Curcumine is een veilige natuurlijke verbinding, zelfs na inname bij hogere doses27 die antikankereigenschappen16vertoonde. De remmende potentie van dit molecuul is aangetoond op menselijke recombinant GST's19,20. Door gebruik te maken van het beschreven protocol, evalueerden we het effect van curcumine op de GST-activiteit met behulp van een pool van GST-isovormen van paardenlever. Volgens de leverancier is de specifieke activiteit van deze mix van eiwitten 25 U/mg. Een voorraadoplossing van 0,1 U/mL werd voorbereid door het lyophilized poeder op te lossen in de juiste hoeveelheid water. Ethacrynic zuur werd parallel gebruikt als een positieve controle als deze verbinding is de meest gebruikte GST remmer in studies. Stappen bij het opzetten van een GST-activiteitstest en het testen van remmers worden beschreven in figuur 1.
De Km moet voor elke enzymsubstraatreactie worden gedefinieerd, omdat het gebruik van de substraatconcentratie gelijk aan Km geen vooringenomenheid zou garanderen met betrekking tot de bepaling van de remmingswijze28. Zes verschillende concentraties van CDNB, variërend van 0,5 mM tot 5 mM, werden getest om deze parameter te meten, met behulp van een vaste concentratie van 2,5 mM GSH.
Het uiteindelijke volume van de reactie was 200 μL, in een 96-put plaat. Voor elk experiment werd een specifieke blanco gebruikt, waarbij dezelfde concentratie van CDNB als de test goed werd gebruikt omdat spontane vervoeging van CDNB en GSH zou kunnen optreden en de absorptie zou kunnen toenemen. Voor alle reacties werd een laatste enzymconcentratie van 0,01 eenheid/mL gebruikt, door 20 μL van de voorraadoplossing aan de testmix toe te voegen. Absorptie op 340 nm werd geregistreerd elke minuut gedurende 10 minuten. De snelheid (in mM/min) van de reactie werd berekend met vergelijking 2. Een Michaelis-Menten grafiek werd uitgezet van de substraatconcentratie (mM) tegen de snelheid (μM/min) (Figuur 2), en de Km van de reactie werd berekend. Het experiment werd herhaald totdat ten minste drie sets van gegevens vergelijkbare resultaten vertoonden. De Km van CDNB met GST uit paardenlever werd gemeten als 0,26 ± 0,08 mM. Voor elke remmende test werd een concentratie van 0,2 mM CDNB gebruikt met behulp van deze partij GST's.
Geen spontane vorming van een metaboliet die op 340 nm werd geabsorbeerd werd gemeten tijdens experimenten met behulp van curcumine alleen met GSH en CDNB. Dezelfde blanco werd gebruikt voor elke remmer concentratie in elk experiment.
Curcumine remmende potentie op GST's Curcumine's remmende potentie werd voorspeld met behulp van een in silico docking simulatie met software (bijvoorbeeld AutoDock Vina versie 1.1.2). 29 De vrije bindende energie tussen verschillende GST-isovormen (namelijk GSTA1, GSTM1 en GSTP1) en curcumine werd voorspeld (gegevens niet getoond). Dan, de constante van remming Kik werd berekend met behulp van Vergelijking 3.
Vergelijking 3: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ03v2.jpg"> waar ∆G de vrije bindende energie is die wordt gevonden met behulp van de in silico-analyse, is R de gasconstante van 1.987 cal*K-1*mol-1, en T is de temperatuur tijdens het experiment, in dit geval in Kelvin (298 K).
Op basis van de vrije bindende energieresultaten die door de AutoDock Vina worden geretourneerd, is curcumine een krachtige GST-remmer van menselijke GSTA1, GSTM1 en GSTP1, met Ki-waarden van respectievelijk 78,1 μM, 78,1 μM en 27,4 μM. De eerste remmende tests werden uitgevoerd met behulp van deze computationele Ki schattingen, en de concentraties werden aangepast aan de resultaten, indien nodig.
Ten eerste werd de IC50 geschat. Dit kenmerk is de concentratie van remmer die de reactiesnelheid van een enzym met 50% vermindert. Het is dus afhankelijk van de enzymconcentratie30. Negen laatste concentraties van de remmer werden voorbereid, variërend van 0,39 μM tot 100 μM, waarbij elke concentratie het dubbele is van de vorige. De testoplossing bestond uit 20 μL GSH 2,5 mM, 20 μL GST uit paardenlever bij 0,01 U/mL finale, 2 μL van de curcumineoplossing en 148 μL PBS. De controle bestond uit dezelfde oplossing met het verdunningsmiddel dat voor curcumine werd gebruikt. Dit mengsel werd 15 minuten uitgebroed om te beginnen met de enzymtest en om afbraak van de curcumine in de testoplossing te voorkomen, omdat deze verbinding instabiel is in bufferoplossingen31. Vervolgens werd 10 μL CDNB-oplossing op 4 mM toegevoegd aan elke put, voor een uiteindelijke concentratie van 0,2 mM CDNB. Absorptie op 340 nm werd gedurende 10 minuten elke minuut geregistreerd om veranderingen in absorptie per minuut te berekenen. Om de IC50 te berekenen, werd elk monster dat met curcumine wordt geïncubeerd, genormaliseerd naar het besturingselement, om het percentage van de activiteit te geven. Deze resultaten werden geanalyseerd met behulp van de plotting software door het berekenen van de niet-lineaire regressie van de logaritmische concentratie van de remmer versus de remming. De IC50 gevonden voor curcumine op GST van paardenlever was 31,6 ± 3,6 μM (Figuur 3A).
Hetzelfde experiment werd parallel uitgevoerd met behulp van ethacrynic zuur als een positieve controle, met concentraties variërend van 0,39 tot 100 μM, zoals bij curcumine. De IC50 bleek 6,6 ± 1,1 μM te zijn (figuur 3B).
De volgende stap was het beoordelen van curcumine's wijze van remming op deze transferases. Vier verschillende concentraties curcumine werden getest: 0, 7,5, 15 en 30 μM, samen met vier verschillende concentraties van CDNB: 0,2, 0,4, 1 en 1,5 mM. Het protocol was hetzelfde als voor het vorige experiment. De snelheid van elke voorwaarde werd berekend met vergelijking 2. Voor elke remmerconcentratie werd een curve uitgezet, waarbij de snelheid (in μM/min) tegen de substraatconcentratie (mM)(figuur 3C)werd uitgezet. De Vmax en Km werden bepaald op basis van elk perceel met GraphPad Prism. De remmingswijze van de potentiële remmer werd beoordeeld op basis van de veranderingen in deze twee parameters en de verschillende conditie van de tests. 24 Aangezien Vmax niet significant veranderde tussen de omstandigheden, maar Km met de verschillende remmerconcentraties is toegenomen, is de remming van GST's door curcumine concurrerend. Dit patroon van remming treedt op wanneer de remmer concurreert met het substraat voor de actieve plaats van het enzym. Om de Ki van een concurrerende remmer te meten, gebruikt GraphPad Vergelijking 4 en Vergelijking 5 zoals beschreven door Copeland et al.32. Vergelijking 4: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ04v2.jpg"> Vergelijking 5: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ05v2.jpg"> waar Km obs is de waargenomen Michaelis-Menten constante, Km is de Michaelis-Menten constante van de controle, [Ik] is de remmer concentratie, Ki is de constante van remming, Y is de snelheid, en X is het substraat concentratie.
De berekeningen zijn gebaseerd op dezelfde experimenten als de beoordeling van de wijze van remming. De Kschatte voor curcumine remming van GST van paardenlever 23,2 ± 3,2 μM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61347/61347fig01.jpg"> Figuur 1: Flowchart beschrijft de stappen van de GST enzymatische en remmingstesten. Details over de procedure worden gepresenteerd in de sectie protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61347/61347fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61347/61347fig02.jpg"> Figuur 2: Michaelis-Menten plot van GST enzym activiteit. Verhoogde concentratie van het substraat CDNB werd gebruikt met een vaste concentratie van GSH (2,5 mM) om de GST-activiteit uit een pool van GST uit paardenlever te bepalen. De waarde van Km voor CDNB werd bepaald als 0,26 ± 0,08 mM volgens de curve van de grafiek. Elk gegevenspunt op de plot vertegenwoordigt het gemiddelde van vier verschillende experimentele runs met SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61347/61347fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61347/61347fig03.jpg"> Figuur 3: Effect van curcumine en ethacrynic zuur op GST enzym activiteit. (A-B) Toevoeging van stijgende concentraties van curcumine (A) of het positieve bestrijdingsethacrynic zuur(B),terwijl dezelfde GST (0,01 U/mL), GSH (2,5 mM) en CDNB (0,2 mM) werden gebruikt om de IC50 van beide verbindingen voor GST uit paardenlever met een niet-lineaire regressie te berekenen. IC50 werd bepaald als 31,6 ± 3,6 μM voor curcumine en 6,6 ± 1,1 μM voor ethacrynic zuur. (C) Michaelis-Menten plot van verschillende concentraties van curcumine, getest tegen verschillende concentraties van CDNB substraat wat wijst op een concurrerende wijze van remming. Zonder remmer werden Vmax en Km gemeten als respectievelijk 132,7 ± 4,6 μM en 0,5 ± 0,08 μM. Met 30 μM curcumine, Vmax en Km waren 130,4 ± 13,1 μM en 1,08 ± 0,39 μM. Datapunten in alle grafieken (A-C) vertegenwoordigen de middelen van drie verschillende experimentele runs met SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61347/61347fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases at JoVE.com

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spectrofotometrische screening op potentiële remmers van Cytosolic Glutathione S-Transferases

Glutathion S-transferases (GST's) zijn ontgiftingsenzymen die betrokken zijn bij het metabolisme van talrijke chemotherapeutische geneesmiddelen. Overexpressie van GST's is gecorreleerd met kanker chemotherapie resistentie. Een manier om dit fenotype tegen te gaan is het gebruik van remmers. Dit protocol beschrijft een methode met behulp van een spectrofotometrische test om te screenen op potentiële GST-remmers.

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

Glutathion S-transferases, GST's, zijn metabole enzymen die intracellulaire elektrofiele verbindingen degraderen en interageren met MAP kinases die betrokken zijn bij apoptose traject. Vanwege deze twee rollen van expressie van GST is gecorreleerd met resistentie tegen geneesmiddelen, een oplossing om dit probleem tegen te gaan is het gebruik van enzymatische remmers. Met dit protocol bieden we een manier om dergelijke moleculen te testen.Deze methode is gericht op iedereen die nieuw is op het gebied van GST-remmers, die een snelle en eenvoudige methode willen gebruiken voor het onderzoeken van de interactie van enzymverbindingen. We bieden ook de stappen om twee kenmerken van een remmer te bepalen, de remmende concentratie 50, IC50, en de constante van remming, Ki.As goed beschreven we de techniek om de wijze van remming te definiëren, een belangrijk kenmerk dat verschillende biologische gevolgen heeft. De eerste stap is het bepalen van de enzymatische activiteit van GST in oplossing per eenheid.Eén eenheid per mil is het volume enzym dat nodig is om één micromolar product per minuut te synthetiseren. Kwantificeer de eiwitconcentratie van de enzymoplossing. Kies de techniek op basis van uw gemak.Verdun de eiwitoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,02 milligram per mil in water. Houd de enzymatische oplossing op ijs. Bereid de reactie voor in een 96-put plaat.Voeg 20 microliter water toe voor de lege putten. Voeg 20 microliter van de enzymatische oplossing toe voor de testputten. Voeg 20 microliter GSH toe.Voeg 150 microliter PBS toe. Voeg 10 microliter van CDNB op 50 millimolar in elke put. Meng de plaat op een shaker voor een paar seconden.Met een spectrofotometrische plaatlezer, record de absorptie op 340 nanometer elke minuut gedurende 10 minuten. Analyseer de resultaten in een spreadsheet en met een gespecialiseerde software. Volgens de verkregen resultaten, bereid een GST voorraad oplossing op 0,1 eenheden per mil in water.Bereid zes verschillende concentraties van CDNB 20 keer in 95% ethanol in een uiteindelijk volume van 200 microliter. Voeg in elke put 20 microliter GSH toe bij 25 millimolar. Voeg aan de testputten 20 microliter van de GST toe bij 0,1 eenheid per mil.Voeg aan de lege putten 20 microliter water toe. Voeg in elke put 150 microliter PBS toe. Voeg aan de testputten en de lege putten 10 microliters van de bijbehorende CDNB-oplossing toe.Elke concentratie van CDNB heeft een specifieke blanco nodig. Meng de inhoud op een shaker voor een paar seconden, neem de absorptie op 340 nanometer elke minuut gedurende 10 minuten. Analyseer de resultaten met een gespecialiseerde software.Bepaal de Km door het tekenen van een Michaelis-Menten plot. Bereid volgens de resultaten een CDNB-oplossing voor op 20 keer de verkregen Km in 95% ethanol. Verdun de remmeroplossing tot de vereiste concentratie.Voeg in een plaat met 96 putten twee microliters van de potentiële GST-remmer toe. Voeg aan de lege putten twee microliter van het verdunningsmezzo toe. Voeg 20 microliter GSH bij 25 millimolar toe aan elke put en 168 microliter PBS.Voeg 10 microliter van CDNB 20 keer km gevonden tijdens de vorige stap. Meng de plaat op een shaker voor een paar seconden. Noteer de absorptie op 340 nanometer per minuut gedurende 10 minuten.Analyseer de resultaten met een gespecialiseerde software. Volgens de resultaten kan dezelfde blanco worden gebruikt voor elke GST-remmer of moet deze worden aangepast. Bereid negen concentraties van de geteste GST-remmer voor.Bereid de essayoplossing voor bestaande uit 148 microliters PBS en 20 microliter GSH bij 25 nanomolar voor één reactie. Meng goed van de oplossing. Voeg voor de testputten twee microliters GST-remmer, 20 microliter GST, 0,1 eenheid per mil en 168 microliters van de testoplossing toe.Voor de controleputten voegt u twee microliter van het verdunningsmiddel toe dat wordt gebruikt voor de GST-remmer, 20 microliter GST 0,1-eenheid per mil en 168 microliter van de testoplossing. Voeg voor de lege putten twee microliter van het verdunningsmiddel toe dat wordt gebruikt voor de GST-remmer, 20 microliter water en 168 microliters van de testoplossing. Voeg 10 microliters van de CDNB-oplossing toe voor elke put, inclusief de blanco.Meng op de shaker voor een paar seconden. Noteer de absorptie op 340 nanometer per minuut gedurende 10 minuten. Bereken de IC50 met een gespecialiseerde software.Vier CDNB-oplossingen op verschillende concentraties voorbereiden, zoals in het protocol wordt uitgelegd. Bereid drie GST-remmeroplossingen voor in verschillende concentraties, ook zoals uitgelegd in het protocol. Bereid de enzymatische oplossingen met 148 microliter PBS en 20 microliter GSH bij 25 millimolar voor op één reactie.Voeg voor de controleputten twee microliters van het verdunningsmiddel toe dat wordt gebruikt voor de GST-remmer. En voor de test en lege putten, twee microliters van de juiste GST remmer oplossing. Meng voor een paar seconden.Voeg 168 microliters van de enzymatische oplossing toe aan elke put. Voeg 10 microliter van de bijbehorende CDNB-concentraties toe aan elke respectievelijke put. Meng gedurende een paar seconden en neem de absorptie op bij 340 nanometer per minuut gedurende 10 minuten.Herhaal het experiment met hetzelfde beplatingspatroon om de vier verschillende concentraties van CDNB te gebruiken langs de drie verschillende concentraties van GST-remmer. Analyseer de resultaten met een gespecialiseerde software om de wijze van remming te bepalen, evenals het Ki.This protocol werd toegepast op curcumine, een molecuul met antikankereigenschappen. Deze verbinding werd geselecteerd door computationele voorspellingen van de bindende affiniteit voor verschillende GST isoforms.Tegelijkertijd werden dezelfde experimenten uitgevoerd op ethacrynic zuur, de meest gebruikte GST-remmer in de laboratoriumomgeving als een positieve controle. De remmende potentie werd getest op een pool van GST's uit paardenlever en kan worden toegepast op alle GST-isovormen naar keuze. De IC 50 evenals het type remming en de Ki werden bepaald.Om de beste testvoorwaarden te bieden, werd eerst Michaelis-Menten constant, Km van het substraat CDNB met een pool van GST's bepaald. Km is representatief voor de affiniteit tussen het substraat en het enzym. De bepaling van deze waarde is van cruciaal belang om een niet-verzadigende concentratie te gebruiken voor het essay.In feite kunnen twee hoge concentraties concurrentieremmers benadelen, terwijl er te weinig aantoonbaar is. Zie teksten voor meer details over dit. Voor dit experiment werden zes verschillende concentraties van CDNB gebruikt met een vaste concentratie van GSH- en GST-enzymen.De Michaelis-Menten grafiek werd verkregen door het plotten van de substraatconcentraties in millimolar op de X-as en de snelheid in millimolar per minuut op de Y-as. De snelheid van de reactie werd berekend met vergelijking één. Km wordt bepaald als de helft Vmax, een waarde verkregen na verzadiging van de oplossing met het substraat om een plateau van conjugaatvorming te verkrijgen.De km van CDNB voor de geteste GST enzymatische oplossing werd bepaald als 0,26 millimolar op basis van berekeningen met een gespecialiseerde software. IC50 wordt gedefinieerd als de concentratie van de stof die nodig is om de enzymactiviteit met de helft te remmen. IC50 werd geschat met behulp van een niet-lineaire regressiegrafiek waarbij de logaritmische concentratie van de GST-remmer werd uitgezet op de X-as en het percentage GST-activiteit op de Y-as.Negen verschillende concentraties van remmer werden gebruikt. De GST-activiteit werd bepaald met toepassing van vergelijking één. De resultaten werden genormaliseerd met behulp van de controle met de no inhibitor.Curcumine is slecht oplosbaar in water. Hogere concentraties waren dus niet te gebruiken, waardoor het moeilijk was om maximale remming te verkrijgen. Niettemin, een gespecialiseerde software was in staat om de IC50 van curriculum voor deze pool van GST voorspellen tegen een waarde van 31,4 micromolar.Tegelijkertijd werd hetzelfde experiment uitgevoerd met ethacrynic zuur als een positieve controle. Zoals verwacht werd dit molecuul bevestigd als een GST-remmer met een IC50 van 6,7 micromolar. Deze resultaten bevestigden dat curcumine ook een GST-remmer is met een IC50 in het micromolarbereik, vergelijkbaar met etacrynisch zuur.Om meer in detail curcumine als een GST-remmer te bestuderen, werden het type remming, evenals de constante van remming, Ki, bepaald. Eerst werd het type remming beoordeeld met de Michaelis-Menten grafieken. Door het gebruik van verschillende concentraties van het substraat CDNB terwijl de concentraties van de GST-remmer toenamen, stegen km's aanzienlijk in correlatie met curcumineconcentraties, terwijl Vmax ondanks de wisselende omstandigheden onveranderd bleef.Deze manier van remming is typerend voor een concurrerende remmingswijze. Voor meer informatie over de andere soorten remmingen verwijzen wij u naar de tekst. Ki werd dienovereenkomstig berekend op basis van het type remming met dezelfde gegevensset, met een waarde van 23,3 micromolar curcumine.De uitgelegde methoden zijn fundamentele enzymatische essays, die zorgvuldigheid vereisen door bepaalde stappen om correcte en reproduceerbare resultaten te bieden. Bepaling van de constante Michaelis-Menten Km, die de affiniteit van het substraat aan het enzym afbakent is één van de essentiële stappen. In feite, wanneer de substraatconcentratie te hoog of te laag is, maakt het het moeilijk om de juiste remmingswijze te identificeren en Ki is niet correct berekend.Deze procedure kan worden toegepast op menselijke recombinant GST's, zoals bijvoorbeeld GSTA1 en een van P1, worden gebruikt in celkweekstudies om het potentieel te beoordelen dat kan worden gebruikt in combinatie met elektrofiele agentia om resistentie tegen geneesmiddelen te verminderen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Nanodifferentiële scanningfluormetrie voor screening in fragmentgebaseerde looddetectie

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...