13.6K Views
•
14:57 min
•
October 10th, 2020
DOI :
October 10th, 2020
•0:00
Introduction
0:56
Preparation of the Enzymatic Solution
3:10
Michaelis-Menten Constant of CDNB with GST
4:42
Absorbance of Potential GST Inhibitors
6:08
Determination of the IC50
7:49
Determination of the Type of Inhibition and Ki
9:46
Results: Testing the Potential of Curcumin as a GST Inhibitor
13:56
Conclusion
Transcript
Glutation S-transferases, GSTs, er metabolske enzymer som forringer intracellulære elektrofile forbindelser og samhandler med MAP kinaser involvert i apoptose banen. På grunn av disse to rollene til uttrykk for GST er korrelert med legemiddelresistens, en løsning for å motvirke dette problemet er å bruke enzymatiske hemmere. Med denne protokollen gir vi en måte å teste slike molekyler på.
Denne metoden er rettet mot alle nye til feltet av GST hemmere, som ønsker å utnytte en rask og enkel metode for å undersøke enzym-sammensatte interaksjon. Vi gir også trinnene for å bestemme to karakteristiske for en hemmer, den hemmende konsentrasjonen 50, IC50 og konstant hemming, Ki.As godt beskrev vi teknikken for å definere modusen for hemming, en viktig funksjon som har forskjellige biologiske konsekvenser. Det første trinnet er å bestemme den enzymatiske aktiviteten til GST i løsning per enhet.
En enhet per mil er volumet av enzym som trengs for å syntetisere en mikromos av produktet per minutt. Kvantifisere proteinkonsentrasjonen av enzymoppløsningen. Velg teknikken i henhold til din bekvemmelighet.
Fortynn proteinoppløsningen til en endelig konsentrasjon på 0,02 milligram per mil i vann. Hold den enzymatiske løsningen på is. Forbered reaksjonen i en 96-brønns plate.
Tilsett 20 mikroliter vann til de tomme brønnene. Tilsett 20 mikroliter av den enzymatiske løsningen for testbrønnene. Legg til 20 mikroliter GSH.
Tilsett 150 mikroliter PBS. Tilsett 10 mikroliter CDNB ved 50 millimolar i hver brønn. Bland platen på en shaker i noen sekunder.
Med en spektrofotometrisk plateleser registrerer du absorbansen ved 340 nanometer hvert minutt i 10 minutter. Analyser resultatene i et regneark og med en spesialisert programvare. Ifølge resultatene oppnådd, forberede en GST lagerløsning på 0,1 enheter per mil i vann.
Forbered seks forskjellige konsentrasjoner av CDNB 20 ganger i 95% etanol i et endelig volum på 200 mikroliter. I hver brønn, legg til 20 mikroliter GSH på 25 millimolar. Til testbrønnene legger du til 20 mikroliter av GST til 0,1 enhet per mil.
Til de tomme brønnene, tilsett 20 mikroliter vann. I hver brønn, legg til 150 mikroliter PBS. Til testbrønnene og de tomme brønnene, tilsett 10 mikroliter av den tilsvarende CDNB-løsningen.
Hver konsentrasjon av CDNB trenger en bestemt blank. Bland innholdet på en shaker i noen sekunder, registrer absorbansen ved 340 nanometer hvert minutt i 10 minutter. Analyser resultatene med en spesialisert programvare.
Bestem Km ved å tegne en Michaelis-Menten tomt. Ifølge resultatene, forberede en CDNB løsning på 20 ganger den oppnådde Km i 95% etanol. Fortynn inhibitoroppløsningen til ønsket konsentrasjon.
I en 96-brønns plate, tilsett to mikroliter av den potensielle GST-hemmeren. Til de tomme brønnene, legg til to mikroliter av fortynningsmiddelet. Tilsett 20 mikroliter GSH ved 25 millimolar i hver brønn og 168 mikroliter PBS.
Legg til 10 mikroliter CDNB 20 ganger Km funnet under forrige trinn. Bland platen på en shaker i noen sekunder. Registrer absorbansen ved 340 nanometer hvert minutt i 10 minutter.
Analyser resultatene med en spesialisert programvare. Ifølge resultatene kan det samme tomme brukes for hver GST-hemmer eller må justeres. Forbered ni konsentrasjoner av den testede GST-hemmeren.
Forbered essayløsningen bestående av 148 mikroliter PBS og 20 mikroliter GSH ved 25 nanomolar for en reaksjon. Bland godt av løsningen. For testbrønnene, legg til to mikroliter av GST-hemmer, 20 mikroliter gst, 0,1 enhet per mil og 168 mikroliter av analyseløsningen.
For kontrollbrønnene, legg til to mikroliter av fortynningsvæsken som brukes til GST-hemmeren, 20 mikroliter gst 0,1 enhet per mil og 168 mikroliter av analyseløsningen. For de tomme brønnene, legg til to mikroliter av fortynningsvæsken som brukes til GST-hemmeren, 20 mikroliter vann og 168 mikroliter av analyseløsningen. Tilsett 10 mikroliter av CDNB-løsningen for hver brønn, inkludert det tomme.
Bland på shakeren i noen sekunder. Registrer absorbansen ved 340 nanometer hvert minutt i 10 minutter. Beregn IC50 med en spesialisert programvare.
Forbered fire CDNB-løsninger ved ulike konsentrasjoner som forklart i protokollen. Forbered tre GST-hemmerløsninger ved forskjellige konsentrasjoner, også som forklart i protokollen. Forbered de enzymatiske løsningene som inneholder 148 mikroliter PBS og 20 mikroliter GSH ved 25 millimolar for én reaksjon.
For kontrollbrønnene, legg til to mikroliter av fortynningsmiddelet som brukes til GST-hemmeren. Og for testen og tomme brønner, to mikroliter av riktig GST-hemmerløsning. Bland i noen sekunder.
Tilsett 168 mikroliter av den enzymatiske løsningen til hver brønn. Tilsett 10 mikroliter av de tilsvarende CDNB-konsentrasjonene i hver respektive brønn. Bland i noen sekunder, og registrer deretter absorbansen ved 340 nanometer hvert minutt i 10 minutter.
Gjenta eksperimentet ved hjelp av samme plating mønster for å bruke de fire forskjellige konsentrasjonene av CDNB langs de tre forskjellige konsentrasjonene av GST-hemmer. Analyser resultatene med en spesialisert programvare for å bestemme modusen for hemming, samt Ki.Denne protokollen ble brukt på curcumin, et molekyl med kreftegenskaper. Denne forbindelsen ble valgt av beregningsforutsigelser av bindingsaffiniteten for flere GST isoformer.
Parallelt ble de samme eksperimentene utført på etakrinsyre, den mest brukte GST-hemmeren i laboratoriemiljøet som en positiv kontroll. Den hemmende styrken ble testet på en pool av GSTs fra equine lever og kan brukes til noen GST isoformer av valget. IC 50 samt type hemming og Ki ble bestemt.
For å gi de beste analyseforholdene, først, Michaelis-Menten konstant, Km av substratet CDNB med et utvalg av GSTs ble bestemt. Km er representativ for affiniteten mellom substratet og enzymet. Fastsettelsen av denne verdien er avgjørende for å bruke en ikke-mettende konsentrasjon for essayet.
Faktisk kan to høye konsentrasjoner ulempe konkurransedyktige hemmere, mens for lite mengde ikke vil være påviselig. Vennligst se tekster for mer informasjon om dette. For dette eksperimentet ble seks forskjellige konsentrasjoner av CDNB brukt med en fast konsentrasjon av GSH- og GST-enzymer.
Michaelis-Menten-grafen ble oppnådd ved å plotte substratkonsentrasjonene i millimolar på X-aksen og hastigheten i millimolar per minutter på Y-aksen. Hastigheten på reaksjonen ble beregnet med ligning en. Km bestemmes som halvparten Vmax, en verdi oppnådd etter metning av løsningen med substratet for å oppnå et platå av konjugatdannelse.
Km av CDNB for den testede GST enzymatiske løsningen ble bestemt som 0,26 millimolar basert på beregninger med spesialisert programvare. IC50 er definert som konsentrasjonen av stoffet som trengs for å hemme enzymaktiviteten til det halve. IC50 ble estimert ved hjelp av en ikke-lineær regresjonsgraf der logaritmisk konsentrasjon av GST-hemmeren ble plottet på X-aksen og prosentandelen av GST-aktivitet på Y-aksen.
Ni forskjellige konsentrasjoner av inhibitor ble brukt. GST-aktiviteten ble bestemt ved bruk av ligning én. Resultatene ble normalisert ved hjelp av kontrollen uten hemmer.
Curcumin er dårlig løselig i vann. Dermed var høyere konsentrasjoner ikke mulig å bruke, noe som gjør det vanskelig å oppnå maksimal hemming. Likevel var en spesialisert programvare i stand til å forutsi IC50 av pensum for denne pool av GST til en verdi av 31,4 mikromolar.
Parallelt ble det samme eksperimentet utført med etakrinsyre som en positiv kontroll. Som forventet ble dette molekylet bekreftet som en GST-hemmer med en IC50 på 6,7 mikromos. Disse resultatene bekreftet at curcumin er også en GST-hemmer med en IC50 i mikromolarområdet, lik ethakrynsyre.
For å studere mer i detalj curcumin som en GST-hemming, type hemming, samt konstant hemming, Ki, ble bestemt. Først ble typen hemming vurdert med Michaelis-Menten grafer. Ved å bruke ulike konsentrasjoner av substratet CDNB mens du øker konsentrasjonene av GST-hemmeren, økte Kms signifikant i korrelasjon med curcuminkonsentrasjoner mens Vmax forble uendret til tross for de varierende forholdene.
Denne modusen for hemming er typisk for en konkurransedyktig modus for hemming. For ytterligere detaljer om de andre typer hemninger, vennligst se teksten. Ki ble beregnet tilsvarende basert på typen hemming ved hjelp av samme datasett, noe som gir en verdi på 23,3 mikromos curcumin.
De forklarede metodene er grunnleggende enzymatiske essays, som krever forsiktighet gjennom visse trinn for å gi riktige og reproduserbare resultater. Bestemmelse av Michaelis-Menten konstant Km, som avgrenser affiniteten av substratet til enzymet er et av de avgjørende trinnene. Faktisk, når substratkonsentrasjonen er for høy eller for lav, gjør det det vanskelig å identifisere riktig modus for hemming og Ki er ikke riktig beregnet.
Denne prosedyren kan brukes på humane rekombinante GSTs, som eksempel GSTA1 og en av P1, brukes i cellekulturstudier for å vurdere potensialet som skal brukes i kombinasjon med elektrofile midler for å redusere legemiddelresistens.
Glutation S-transferases (GSTs) er avgiftning enzymer involvert i metabolismen av mange kjemoterapeutiske legemidler. Overuttrykk av GSTs er korrelert med kreft kjemoterapi resistens. En måte å motvirke denne fenotypen på er å bruke inhibitorer. Denne protokollen beskriver en metode ved hjelp av en spektrofotometrisk analyse for å screene for potensielle GST-hemmere.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved