13.6K Views
•
14:57 min
•
October 10th, 2020
DOI :
October 10th, 2020
•0:00
Introduction
0:56
Preparation of the Enzymatic Solution
3:10
Michaelis-Menten Constant of CDNB with GST
4:42
Absorbance of Potential GST Inhibitors
6:08
Determination of the IC50
7:49
Determination of the Type of Inhibition and Ki
9:46
Results: Testing the Potential of Curcumin as a GST Inhibitor
13:56
Conclusion
Transcript
Glutation S-överföraser, GSTs, är metaboliska enzymer som bryts ned intracellulära elektrofila föreningar och interagerar med MAP kinaser involverade i apoptos väg. På grund av dessa två roller uttryck för GST är korrelerade med läkemedelsresistens, en lösning för att motverka denna fråga är att använda enzymatiska hämmare. Med detta protokoll, ger vi ett sätt att testa sådana molekyler.
Denna metod är riktad till alla nya till området GST-hämmare, som vill utnyttja en snabb och enkel metod för att undersöka enzym-sammansatta interaktion. Vi ger också stegen för att bestämma två karakteristiska för en inhibitor, den hämmande koncentrationen 50, IC50, och konstanten av hämning, Ki.As väl vi beskrev tekniken för att definiera läget för hämning, en viktig funktion som har olika biologiska konsekvenser. Det första steget är att bestämma den enzymatiska aktiviteten av GST i lösning per enhet.
En enhet per mil är den volym av enzym som behövs för att syntetisera en mikromolar av produkt per minut. Kvantifiera proteinkoncentrationen av enzymlösningen. Välj tekniken enligt din bekvämlighet.
Späd proteinlösningen till en slutkoncentration på 0,02 milligram per mil i vatten. Håll den enzymatiska lösningen på is. Förbered reaktionen i en 96-brunnsplatta.
Tillsätt 20 mikroliter vatten för de tomma brunnarna. Tillsätt 20 mikroliter av den enzymatiska lösningen för testväldarna. Tillsätt 20 mikroliter av GSH.
Lägg till 150 mikroliter PBS. Tillsätt 10 mikroliter CDNB vid 50 millimolar i varje brunn. Blanda plattan på en shaker i några sekunder.
Med en spektrofotometrisk tallriksläsare spelar du in absorbansen vid 340 nanometer varje minut i 10 minuter. Analysera resultaten i ett kalkylblad och med en specialiserad programvara. Enligt erhållna resultat, förbereda en GST stamlösning på 0,1 enheter per mil i vatten.
Förbered sex olika koncentrationer av CDNB 20 gånger i 95%etanol i en slutvolym på 200 mikroliter. I varje brunn, tillsätt 20 mikroliter GSH på 25 millimolar. Till test brunnarna, tillsätt 20 mikroliter av GST på 0,1 enhet per mil.
Till de tomma brunnarna, tillsätt 20 mikroliter vatten. I varje brunn, tillsätt 150 mikroliter PBS. Till test brunnarna och blank brunnarna, tillsätt 10 mikroliter av motsvarande CDNB lösning.
Varje koncentration av CDNB behöver en specifik tom. Blanda innehållet på en shaker i några sekunder, spela in absorbansen vid 340 nanometer varje minut i 10 minuter. Analysera resultaten med en specialiserad programvara.
Bestäm Km genom att rita en Michaelis-Menten tomt. Enligt resultaten, förbereda en CDNB lösning på 20 gånger den erhållna Km i 95%etanol. Späd in inhibitorlösningen till den erforderliga koncentrationen.
I en 96-brunnsplatta, tillsätt två mikroliter av den potentiella GST-hämmaren. Till de tomma brunnarna, tillsätt två mikroliter av spädningsvätskan. Tillsätt 20 mikroliter GSH vid 25 millimolar i varje brunn och 168 mikroliter PBS.
Lägg till 10 mikroliter av CDNB 20 gånger Km hittades under föregående steg. Blanda plattan på en shaker i några sekunder. Spela in absorbansen vid 340 nanometer varje minut i 10 minuter.
Analysera resultaten med en specialiserad programvara. Enligt resultaten kan samma blindprov användas för varje GST-hämmare eller måste justeras. Förbered nio koncentrationer av den testade GST-hämmaren.
Förbered uppsatslösningen bestående av 148 mikroliter pbs och 20 mikroliter av GSH vid 25 nanomolar för en reaktion. Blanda väl av lösningen. För testväldarna, tillsätt två mikroliter av GST-hämmare, 20 mikroliter gst, 0,1 enhet per mil och 168 mikroliter av analyslösningen.
För kontroll brunnarna, tillsätt två mikroliter av spädningsvätskan används för GST-hämmare, 20 mikroliter av GST 0,1 enhet per mil, och 168 mikroliter av analysen lösning. För de tomma brunnarna, tillsätt två mikroliter av spädningsvätskan som används för GST-hämmaren, 20 mikroliter vatten och 168 mikroliter av analyslösningen. Lägg till 10 mikroliter av CDNB-lösningen för varje brunn, inklusive blankt.
Blanda på skakren i några sekunder. Spela in absorbansen vid 340 nanometer varje minut i 10 minuter. Beräkna IC50 med en specialiserad programvara.
Förbered fyra CDNB-lösningar vid olika koncentrationer som förklaras i protokollet. Förbered tre GST-hämmare lösningar vid olika koncentrationer, även som förklaras i protokollet. Förbered de enzymatiska lösningarna som innehåller 148 mikroliter PBS och 20 mikroliter GSH vid 25 millimolar för en reaktion.
För kontroll brunnarna, tillsätt två mikroliter av spädningsvätskan används för GST-hämmaren. Och för test- och blank brunnar, två mikroliter av rätt GST-hämmare lösning. Blanda i några sekunder.
Tillsätt 168 mikroliter av den enzymatiska lösningen till varje brunn. Tillsätt 10 mikroliter av motsvarande CDNB-koncentrationer i varje respektive brunn. Blanda i några sekunder, spela sedan in absorbansen vid 340 nanometer varje minut i 10 minuter.
Upprepa experimentet med samma pläteringsmönster för att kunna använda de fyra olika koncentrationerna av CDNB längs de tre olika koncentrationerna av GST-hämmare. Analysera resultaten med en specialiserad programvara för att bestämma läget för hämning, liksom Ki.This protokollet tillämpades på curcumin, en molekyl med anticancer egenskaper. Denna förening valdes av beräkningsprognoser av bindningsaffiniteten för flera GST-isoformer.
Parallellt genomfördes samma experiment på ethacrynic syra, den mest använda GST-hämmaren i laboratoriemiljön som en positiv kontroll. Den hämmande potensen testades på en pool av allmänna lysen från hästlever och kan appliceras på eventuella GST-isoformer som valts. IC 50 samt typ av hämning och Ki bestämdes.
För att ge de bäst assayna villkorar, först, Michaelis-Menten konstant, Km av substraten CDNB med en slå samman av GSTs var beslutsamt. Km är representativt för samhörigheten mellan substratet och enzymet. Fastställandet av detta värde är avgörande för att använda en icke-mättande koncentration för uppsatsen.
I själva verket kan två höga koncentrationer missgynna konkurrenshämmare, medan för lite mängd inte kommer att kunna upptäckas. Vänligen se texter för mer detaljer om detta. För detta experiment användes sex olika koncentrationer av CDNB med en fast koncentration av GSH- och GST-enzymer.
Michaelis-Menten-grafen erhölls genom att man ritade substrathalterna i millimolar på X-axeln och hastigheten i millimolar per minuter på Y-axeln. Hastighet av reaktionen beräknades med ekvation ett. Km bestäms som hälften Vmax, ett värde som erhålls efter mättnad av lösningen med substratet för att erhålla en platå av konjugatbildning.
Km of CDNB för den testade GST-enzymatiska lösningen bestämdes som 0,26 millimolar baserat på beräkningar med en specialiserad programvara. IC50 definieras som den koncentration av substans som behövs för att hämma enzymaktiviteten med hälften. IC50 uppskattades genom att använda en ickelinjär regressionsgraf där den logaritmiska koncentrationen av GST-hämmaren ritades på X-axeln och procentandelen GST-aktivitet på Y-axeln.
Nio olika koncentrationer av inhibitor användes. GST-aktiviteten fastställdes med tillämpning av ekvation ett. Resultaten normaliserades med hjälp av kontrollen med ingen inhibitor.
Curcumin är dåligt löslig i vatten. Således var högre koncentrationer inte möjligt att använda, vilket gör det svårt att få maximal hämning. Ändå kunde en specialiserad programvara förutsäga IC50 av läroplanen för denna pool av GST till ett värde av 31,4 mikromolar.
Parallellt genomfördes samma experiment med etanakrynsyra som en positiv kontroll. Som väntat bekräftades denna molekyl som en GST-hämmare med en IC50 på 6,7 mikromolar. Dessa resultat bekräftade att curcumin är lika bra en GST-hämmare med en IC50 i mikromolarområdet, liknande ethacrynic syra.
För att studera mer i detalj curcumin som en GST-hämmare, typ av hämning, liksom konstanten av hämning, Ki, bestämdes. Först bedömdes typen av hämning med Michaelis-Menten-graferna. Genom att använda olika koncentrationer av substratet CDNB medan de stegade in gst-hämmarens koncentrationer, ökade Kms signifikant i korrelation med curcuminkoncentrationer medan Vmax var oförändrad trots de varierande förhållandena.
Detta läge av hämning är typisk för ett konkurrenskraftigt funktionsläge av hämning. För ytterligare detaljer om de andra typerna av hämningar, se texten. Ki beräknades i enlighet med detta baserat på typen av hämning med hjälp av samma datamängd, vilket gav ett värde på 23,3 mikromolar av curcumin.
De förklarade metoderna är grundläggande enzymatiska uppsatser, som kräver försiktighet genom vissa steg för att ge korrekta och reproducerbara resultat. Beslutsamhet av Den Michaelis-Menten konstanten Km, det delineates underlagets affinitet till enzymet är ett av de avgörande stegen. Faktum är att när substratkoncentrationen är för hög eller för låg, gör det svårt att identifiera rätt läge för hämning och Ki är inte korrekt beräknat.
Detta förfarande kan tillämpas på human rekombinant GSTs, som exempel GSTA1 och en av P1, används i cellodlingsstudier för att bedöma potentialen att användas i kombination med elektrofila medel för att minska läkemedelsresistens.
Glutation S-överföraser (GSTs) är avgiftning enzymer som deltar i metabolismen av ett flertal kemoterapeutiska läkemedel. Överuttryck av GSTs är korrelerade med cancer kemoterapi motstånd. Ett sätt att motverka denna fenotyp är att använda inhibitorer. Detta protokoll beskriver en metod med hjälp av en spektrofotometrisk analys för att skärmen för potentiella GST-hämmare.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved