Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة الدماغ والسلوك ، جائزة NARSAD للباحثين الشباب. تم تصميم العديد من المكونات المطبوعة 3D في الأصل من قبل فابيان رابوسو (العلاج الموجه بالصور ، فرنسا). يشكر المؤلف جون هيث (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) ومارغريت سويفت (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) للمساعدة الفنية في إعداد المخطوطة.

لا يوجد تضارب في المصالح.

يتطلب ATAC التنفيذ الناجح للعديد من التقنيات للتعديل العصبي الناجح لدوائر عصبية محددة ، بما في ذلك الاستهداف الدقيق الموجه بالتصوير بالرنين المغناطيسي ، FUS-BBBO ، والتقييم النسيجي للتعبير الجيني. تم تطوير مكونات قابلة للطباعة 3D لتبسيط استهداف هياكل الدماغ الصغيرة باستخدام FUS-BBBO الموجه بالتصوير.
تشكل إدارة الموجات فوق الصوتية المركزة الموجهة بالتصوير بالرنين المغناطيسي (MRIgFUS) عددا من التحديات. أولا ، يحتوي ملف التصوير بالرنين المغناطيسي النموذجي على مساحة محدودة مصممة لاستيعاب عينة فقط وليس أجهزة الموجات فوق الصوتية. تزيد التجاويف الأكبر للتصوير بالرنين المغناطيسي من تكلفة المعدات وتقلل من جودة الصورة ، حيث ترتبط الإشارة بعامل ملء الملف32. وبالتالي ، فإن أي جهاز FUS يوضع أعلى صورة في التصوير بالرنين المغناطيسي سيضر بجودة التصوير. ثانيا ، تصميم الأجهزة المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي أمر صعب ومكلف. يجب أن تكون المواد المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي مغناطيسية ، ولها ميل منخفض لإنشاء تيارات دوامية أثناء تشعيع الترددات الراديوية ، ولها حساسية مغناطيسية منخفضة في المجالات المغناطيسية العالية. في أي مادة موصلة ، فإن إنشاء التيارات الدوامة أو قابليتها المغناطيسية سيؤثر سلبا أيضا على جودة التصوير. أخيرا ، تتميز المواد المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي المتاحة بوحدات ومتانة يونغ أقل من المعادن المستخدمة عادة في إنتاج آلات الاستهداف الدقيقة ، على سبيل المثال ، الإطارات المجسمة. يجب أن تكون المحركات المستخدمة في التعديلات الموضعية متوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي وتوضع خارج تجويف التصوير بالرنين المغناطيسي نظرا لحجمها. يجب توصيل هذه المحركات على مسافة بمحول الطاقة داخل تجويف التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام مواد متوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي. أثرت مشكلات تزييف البلاستيك ، وعدم وجود مساحة كافية داخل التجويف لتنفيذ مكونات قوية الحجم ، وعدم كفاية المساحة لتغيير مواضع الاستهداف عبر الدماغ بأكمله على دقة الاستهداف في العمل السابق.
لحل هذه المشاكل ، تم اتخاذ قرار بإجراء التصوير في التصوير بالرنين المغناطيسي وإدارة FUS-BBBO خارج الماسح الضوئي. للسماح بتوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي ، تم وضع الفئران داخل تقييد مطبوع 3D يحتوي على دليل استهداف مرئي للتصوير بالرنين المغناطيسي يمكن استخدامه لتوطين هياكل دماغ الفأر في كل من التصوير بالرنين المغناطيسي وفي مساحة إحداثيات التركيب المجسم. نظرا لأن كل من جمجمة الفأر ودليل الاستهداف مرتبطان بقوة بحاملات قضبان الأذن (الشكل 1أ ، ب) ، يمكن استخدام دليل الاستهداف لربط الإحداثيات المكانية داخل صورة التصوير بالرنين المغناطيسي وصفر الأدوات المجسمة. لا يحتوي التقييد على أجزاء متحركة ولا يحتوي على محول طاقة ، مما سمح لنا بجعله قويا وصغيرا بما يكفي ليتناسب مع التصوير بالرنين المغناطيسي وإزالة تداخل الإشارة من إلكترونيات محول الطاقة. تم تجويف المساحة الموجودة داخل دليل الاستهداف حيث أن الدعم المطبوع ثلاثي الأبعاد لبعض المواد مرئي في التصوير بالرنين المغناطيسي (الشكل 1 ج). تم إدخال ثقوب في التجميع لتمكين معايرة التجميع التجسيمي (الشكل 3). تم توصيل محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية بحامل قطب كهربائي من بناء مجسم ، وتم إجراء الاستهداف كما هو موضح في القسم 4 (الشكل 1 د). يجب دعم محول الطاقة على طوله عن طريق إسكان قضبان الأذن ، مما يمنع أي انحراف عن مستوى المستوى. يمكن تحقيق الاستهداف في الاتجاه الظهري البطني باستخدام تحولات الطور في مجموعة حلقية.
يتم تحديد دقة الاستهداف العملية من خلال التركيز بالموجات فوق الصوتية وتوهين الجمجمة. تم وصف إجراء FUS-BBBO بالتفصيل للفئران11 وتم تنفيذه في عدد من الكائنات النموذجية الأخرى23،33،34 وفي البشر 16،17. العلاقة بين حجم تركيز الموجات فوق الصوتية تتناسب عكسيا مع التردد ، حيث يمكن أن تؤدي الترددات الأعلى إلى توصيل أكثر دقة. ومع ذلك ، فإن توهين الجمجمة يزداد مع الترددات35 مما قد يؤدي إلى تسخين الجمجمة وتلف المناطق القشرية. تعتمد استراتيجية الاستهداف الدقيقة على موقع الدماغ. تسمح المواقع التي يتناسب فيها الضغط الأقصى بنصف العرض الكامل داخل أنسجة المخ بفتح BBB يمكن التنبؤ به وآمن في العديد من هياكل الدماغ مثل المخطط والدماغ المتوسط والحصين. تشكل المناطق القريبة من قاعدة الدماغ تحديا محددا في الفئران. يقيس دماغ الفأر حوالي 8-10 مم في الاتجاه الظهري البطني ، وهو ما يمكن مقارنته بنصف الحجم الأقصى للعرض الكامل للعديد من محولات الطاقة المتاحة تجاريا. وبالتالي ، يمكن أن يؤدي الاستهداف في الجزء السفلي من الجمجمة إلى انعكاس الموجات فوق الصوتية من العظام والهواء الموجود في قنوات الأذن أو الفم أو القصبة الهوائية مما قد يؤدي إلى أنماط غير متوقعة من الضغوط العالية والمنخفضة36. يمكن لبعض هذه الضغوط عبور عتبة التجويف بالقصور الذاتي والتي ثبت أنها تسبب النزيف وتلف الأنسجة37. لاستهداف المناطق التي تقع بالقرب من قاعدة الجمجمة ، قد يكون من الأفضل استخدام ATAC7 المتقاطع ، حيث يتم استخدام علم الوراثة التقاطعي38 لتقييد التعبير الجيني إلى منطقة أصغر من تلك المستهدفة بحزمة FUS. في المثال المنشور ل ATAC المتقاطع ، تم استهداف معدل وراثيا يعبر عن إنزيم تحرير الجينات (Cre38) في خلايا الدوبامين بالموجات فوق الصوتية في القسم الفرعي من المنطقة التي تحتوي على خلايا الدوبامين. أخيرا ، يمكن استهداف المناطق القشرية باستخدام FUS ، ولكن قد يحدث حيود وانعكاس الموجات فوق الصوتية مما يؤدي إلى ملامح ضغط غير متساوية. لا يغطي هذا البروتوكول استهداف المناطق القشرية لأنه سيعتمد اعتمادا كبيرا على الأنواع المستخدمة. ومع ذلك ، فقد لوحظ بعض استهداف القشرة فوق الحصين 7 (على سبيل المثال ، الشكل 7) مما يشير إلى أنه من الممكن ، على الأقل في الفئران.
يعتمد اختيار المنشط الكيميائي والجرعات على الاحتياجات التجريبية المحددة. أظهر عدد من الدراسات ، بما في ذلك إحدى دراسات المؤلفين7 ، عدم وجود استجابة غير محددة كبيرة39,40 ، في حين أن الجرعات العالية (على سبيل المثال ، 10 مجم / كجم) يمكن أن تنتج آثارا جانبية ، على الأقل في بعض الحالات 41. ومع ذلك ، كما هو الحال مع جميع التجارب السلوكية ، فإن الضوابط المناسبة31 ضرورية بسبب النشاط المحتمل خارج الهدف ل CNO ومستقلباته42. يمكن أن تشمل هذه الضوابط إعطاء CNO والضوابط الملحية للحيوانات التي تعبر عن DREADDs وإعطاء CNO للحيوانات البرية أو في بعض الحالات المحددة مقارنة بين المواقع المماثلة والمقابلة للدماغ التي تعبر ولا تعبر عن المستقبلات الكيميائية الجينية على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت الأبحاث الحديثة عن عدد من منبهات DREADD الجديدة ذات الخصوصيةالمحسنة 28،29،43. يمكن أيضا استخدام المستقبلات الكيميائية الجينية الأخرى5،25،44 جنبا إلى جنب مع إجراء ATAC.
التقييم النسيجي للتعبير الجيني ضروري بعد الوفاة لكل. يظهر جزء صغير من الحيوانات تعبيرا جينيا ضعيفا بعد FUS-BBBO7. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري إظهار الدقة المكانية وخصوصية التعبير الجيني لأن سوء الاستهداف ممكن. من الجدير بالذكر أن بعض AAVs قد تظهر قدرة تتبع رجعية أو أمامية45 ويمكن أن تسبب انتقالا بعيدا عن الموقع المستهدف بالموجات فوق الصوتية على الرغم من الاستهداف الدقيق بالموجات فوق الصوتية. إذا تم دمج المستقبل الكيميائي الجيني المعبر عنه أو شارك في التعبير عن الفلوروفور ، فقد يكون تصوير الفلوروفور في أقسام الأنسجة كافيا لتقييم التوطين وشدة التعبير. ومع ذلك ، فإن العديد من البروتينات الفلورية تتضرر بسبب عملية تثبيت الأنسجة ، كما أن التلوين المناعي لبروتين mCherry الذي يستخدم بشكل متكرر مع DREADDs أسفر عن إشارة أفضل في الدراسات السابقة7. أخيرا ، نظرا لكثافة الخلايا العصبية في أجزاء معينة من الدماغ (على سبيل المثال ، طبقة الخلايا الحبيبية في الحصين) ، فإن استخدام الفلوروفورات الموضعية نوويا المعبر عنها بموجب IRES ، بدلا من عمليات الاندماج ، لأداء تعداد الخلايا قد يكون مفيدا حيث يمكن تجزئة النوى بسهولة وتلطيخها بالبقع النووية ، مثل DAPI أو TO-PRO-3. لتقييم التعديل العصبي عن طريق تلطيخ c-Fos ، من الضروري إجراء تلطيخ نووي مضاد وحساب نوى c-Fos الموجبة ، بدلا من أي إشارة مضان. في بعض الحالات ، يمكن أن يظهر الحطام الخلوي مضان ويربك قياسات الخلايا الإيجابية.
تشمل قيود توصيل الدواء والجينات باستخدام FUS-BBBO دقة أقل من التسليم بالحقن الغازية داخل الجمجمة والحاجة إلى كميات أكبر من الأدوية المحقونة أو النواقل الفيروسية. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن الحقن المباشر في الدماغ يؤدي إلى توصيل حصري إلى موقع الحقن ، يستخدم FUS-BBBO طريقا وريديا مما يؤدي إلى إمكانية التوصيل إلى الأنسجة المحيطية. تشمل قيود استخدام علم الوراثة الكيميائي للتعديل العصبي نطاقا زمنيا بطيئا ، والذي قد يكون غير كاف لبعض البروتوكولات السلوكية التي تتطلب تغييرات سريعة في شدة التعديل العصبي.

أدى استخدام تقنيات التعديل العصبي الخاصة بالدائرة ، مثل علم البصرياتالوراثي 1،2 وعلم الوراثة الكيميائي3،4،5 ، إلى تعزيز فهمنا للحالات النفسية مثل اضطرابات الدائرة العصبية. من الصعب دراسة الدوائر العصبية ويصعب التحكم فيها في علاج اضطرابات الدماغ لأنها عادة ما يتم تحديدها من خلال أنواع معينة من الخلايا ومناطق الدماغ ومسارات الإشارات الجزيئية وتوقيت التنشيط. من الناحية المثالية لكل من التطبيقات البحثية والسريرية ، سيتم ممارسة هذا التحكم بشكل غير جراحي ، ولكن تحقيق كل من التعديل العصبي الدقيق وغير الباضع يمثل تحديا. على سبيل المثال ، في حين أن الأدوية العصبية يمكن أن تصل إلى الدماغ بشكل غير جراحي ، إلا أنها تفتقر إلى الخصوصية المكانية من خلال العمل في جميع أنحاء الدماغ. من ناحية أخرى ، يمكن للتحفيز الكهربائي العميق للدماغ التحكم في مناطق معينة من الدماغ ولكنه يواجه صعوبة في التحكم في أنواع معينة من الخلايا ويتطلب جراحة ووضع الجهاز6.
يوفر علم الوراثة الكيميائية المستهدفصوتيا 7 (ATAC) تعديلا عصبيا بخصوصية مكانية ونوع الخلية والزمانية. فهو يجمع بين ثلاث تقنيات: فتح الحاجز الدموي الدماغي المستحث بالموجات فوق الصوتية المركزة (FUS-BBBO) للاستهداف المكاني ، واستخدام النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي (AAVs) لتوصيل الجينات بشكل غير جراحي تحت سيطرة المروجين من نوع الخلية ، والمستقبلات الكيميائية المهندسة لتعديل الدوائر العصبية المنقولة بشكل انتقائي عن طريق إدارة الدواء. FUS هي تقنية معتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) تستفيد من قدرة الموجات فوق الصوتية على التركيز بعمق داخل الأنسجة ، بما في ذلك الدماغ البشري ، بدقة مكانية ملليمترية. في الطاقة العالية ، يتم استخدام FUS للاستئصال المستهدف غير الباضع ، بما في ذلك العلاج المعتمد من إدارة الغذاء والدواء للرعاشالأساسي 8. يجمع FUS-BBBO بين الموجات فوق الصوتية منخفضة الكثافة والفقاعات الدقيقة التي تدار بشكل منهجي ، والتي تتذبذب في الأوعية الدموية عند تركيز الموجات فوق الصوتية ، مما يؤدي إلى فتح موضعي ومؤقت (6-24 ساعة) وقابل للانعكاس ل BBB9. تسمح هذه الفتحة بتوصيل البروتينات9،10 ، والجزيئات الصغيرة 11 ، والنواقل الفيروسية7،12،13،14 إلى الدماغ دون تلف كبير في الأنسجة في القوارض 10 والرئيسيات غير البشرية 15. التجارب السريرية جارية ل FUS-BBBO16,17 ، مما يشير إلى التطبيقات العلاجية المحتملة لهذه التقنية.
كما أن توصيل الجينات الفيروسية باستخدام AAV يتقدم بسرعة في الاستخدام السريري لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي ، مع الموافقات التنظيمية الأخيرة لإدارة الغذاء والدواء والاتحاد الأوروبي كمعالم رئيسية. أخيرا ، تستخدم المستقبلات الكيميائيةالجينية 18 ، مثل المستقبلات المصممة التي يتم تنشيطها حصريا بواسطة الأدوية المصممة (DREADDs) ، على نطاق واسع من قبل علماء الأعصاب لتوفير التحكم الدوائي في الإثارة العصبية في الحيوانات المعدلة وراثيا أو المنقولة19,20. DREADDs هي مستقبلات مقترنة بالبروتين G (GPCRs) تم هندستها وراثيا للاستجابة للجزيئات الكيميائية الاصطناعية بدلا من الروابط الداخلية ، بحيث تزيد الإدارة الجهازية لهذه الروابط أو تقلل من استثارة الخلايا العصبية المعبرة عن DREADD. عندما يتم دمج هذه التقنيات الثلاث في ATAC ، يمكن استخدامها للتعديل غير الباضع للدوائر العصبية المختارة بدقة مكانية ونوع الخلية والزمانية.
هنا ، نقوم بتوسيع وتحديث بروتوكول تم نشره مسبقا ل FUS-BBBO11 من خلال تضمين منهجية للاستهداف الدقيق لمناطق الدماغ باستخدام FUS-BBBO في الفئران باستخدام معدات استهداف مطبوعة 3D بسيطة. نعرض أيضا تطبيقا ل FUS-BBBO على ATAC. نعرض الخطوات اللازمة لتسليم AAVs التي تحمل مستقبلات كيميائية وراثية ، وتقييم التعبير الجيني والتعديل العصبي عن طريق الأنسجة. هذه التقنية قابلة للتطبيق بشكل خاص لاستهداف مناطق كبيرة أو متعددة من الدماغ للتعبير الجيني أو التعديل العصبي. على سبيل المثال ، يمكن بسهولة تحويل مساحة واسعة من القشرة باستخدام FUS-BBBO وتعديلها باستخدام علم الوراثة الكيميائي. ومع ذلك ، فإن توصيل الجينات بتقنية بديلة ، الحقن داخل الجمجمة ، يتطلب عددا كبيرا من الحقن الغازية وحج القحف. يمكن توسيع نطاق FUS-BBBO وتطبيقه ، ATAC ، إلى ذات أحجام مختلفة ، حيث تكون مناطق الدماغ أكبر ويصعب استهدافها بشكل غازي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

يسمح علم الوراثة الكيميائية المستهدف صوتيا (ATAC) بالتحكم غير الجراحي في دوائر عصبية محددة. يحقق ATAC هذا التحكم من خلال مزيج من الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) التي يسببها فتح الحاجز الدموي الدماغي (FUS-BBBO) ، وتوصيل الجينات باستخدام النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي (AAV) ، وتنشيط الإشارات الخلوية باستخدام مستقبلات البروتين المهندسة والكيميائية والروابط المشابهة لها. مع ATAC ، من الممكن تحويل كل من مناطق الدماغ الكبيرة والصغيرة بدقة ملليمتر باستخدام تطبيق واحد للموجات فوق الصوتية غير الباضعة. يمكن أن يسمح هذا النقل لاحقا بتعديل عصبي طويل الأمد وغير جراحي وخالي من الأجهزة في الحيوانات التي تتحرك بحرية باستخدام دواء. نظرا لاستخدام FUS-BBBO و AAVs وعلم الوراثة الكيميائية في متعددة ، يجب أن يكون ATAC أيضا قابلا للتطوير للاستخدام في الأنواع الحيوانية الأخرى. تتوسع هذه الورقة في بروتوكول تم نشره سابقا وتحدد كيفية تحسين توصيل الجينات باستخدام FUS-BBBO إلى مناطق الدماغ الصغيرة باستخدام توجيه التصوير بالرنين المغناطيسي ولكن دون الحاجة إلى جهاز FUS معقد متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي. يصف البروتوكول أيضا تصميم مكونات استهداف الماوس وتقييد النفس التي يمكن طباعتها 3D بواسطة أي مختبر ويمكن تعديلها بسهولة لأنواع مختلفة أو معدات مخصصة. للمساعدة في التكاثر ، يصف البروتوكول بالتفصيل كيفية استخدام الفقاعات الدقيقة و AAVs وبزل الوريد في تطوير ATAC. أخيرا ، يتم عرض مثال على البيانات لتوجيه التحقيقات الأولية للدراسات التي تستخدم ATAC.

الخطوة الأولى لتنفيذ بروتوكول ATAC هي استهداف FUS-BBBO لمناطق الدماغ المطلوبة. على سبيل المثال ، باتباع البروتوكول الموصوف ، تم استهداف الحصين باستخدام FUS-BBBO ، وتم حقن عامل التباين و AAV9 الذي يحمل DREADDs في الفئران ، متبوعا بتسلسل التصوير بالرنين المغناطيسي FLASH 3D الذي يكتسب صورا لدماغ الفأر. تم تحقيق تعزيز إشارة T1 في منطقة الحصين (الشكل 6) وفي أجزاء أخرى من الدماغ (الشكل 7). بعد عدة أسابيع ، تم التعبير عن DREADDs داخل منطقة الدماغ المستهدفة. في حين يتم دمج العديد من DREADDs مع مراسل الفلورسنت (مثل mCherry) ، تم العثور على عملية التروية والتثبيت مع الفورمالديهايد لتقليل تألق هذه البروتينات بشكل كبير. أدى التلوين المناعي ضد mCherry أو DREADD إلى اكتشاف أكثر موثوقية للتعبير (الشكل 8) بناء على الخبرة السابقة. في التجارب السابقة ، أظهر ~ 85٪ من الفئران تعبيرا بعد FUS-BBBO7. اختبار بسيط لمستويات كافية من التعبير عن DREADDs هو اختبار وظائفها على المستوى الخلوي. يمكن القيام بذلك ، على سبيل المثال ، عن طريق توفير ليجند كيميائي أو تحكم ملحي ، مثل CNO19 أو deschloroclozapine28 أو غيرها29 ، والانتظار لمدة ساعتين قبل التروية القلبية والتثبيت. ثم تم تلطيخ أقسام الدماغ بشكل مشترك لبروتين c-Fos30 ، مما يشير إلى زيادة نشاط الخلايا العصبية ، و DREADD. اعتبرت التجربة ناجحة ، إذا أظهر موقع الدماغ المستهدف ب DREADDs عددا أكبر بكثير من النوى العصبية الإيجابية c-Fos في المجموعة التي تلقت رباطا كيميائيا عند مقارنتها بالمجموعة التي تلقت محلول ملحي7 أو مقارنة بموقع مقابل لم يخضع ل FUS-BBBO. وتجدر الإشارة إلى أن هناك إمكانية لبعض هذه الروابط لتنشيط الخلايا العصبية بشكل غير محدد دون التعبير عن DREADDs. على سبيل المثال ، ثبت أن CNO يتم استقلابه إلى مستويات منخفضة من كلوزابين في الفئران ، والذي يعبر BBB وينشط DREADDs بقوةعالية 27. ومع ذلك ، فقد ثبت أيضا أنه يرتبط بمواقع غير محددة. كما هو الحال في كل تجربة ، من الأهمية بمكان تضمين جميع الضوابط المناسبة في الدراسات الكيميائيةالوراثية 31. أحد عناصر التحكم الممكنة هو إعطاء الرباط الكيميائي الوراثي للفئران البرية ، دون إجراءات ، لاستبعاد آثار الدواء وحده على الفحص السلوكي أو النسيجي المطلوب. يمكن أن يكون عنصر التحكم الآخر هو تضمين أربع مجموعات: DREADD + ligand ، DREADD + مركبة ، EGFP + ligand ، EGFP + مركبة ، والتي ستفسر أي آثار محتملة لكل من توصيل الجينات باستخدام FUS-BBBO ، والرباط الكيميائي الوراثي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> الشكل 1: عملية الاستهداف الموجه بالرنين المغناطيسي ل FUS في ATAC. (أ) وضع الفأرة مع قضبان الأذن ومخروط الأنف ومنصة يمكن وضعها داخل ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي. (ب) تم إرفاق دليل مطبوع 3D (أزرق) مرئي في التصوير بالرنين المغناطيسي بنهايات إطار قضيب الأذن ثم تم تثبيته في مكانه بحامل لفائف التصوير بالرنين المغناطيسي السطحية التي تحتوي على أربعة مسامير إضافية (أزرق شبه شفاف). (ج) ظهور الدليل المطبوع 3D في التصوير بالرنين المغناطيسي السهمي (اللوحة اليسرى) ، مع الجزء السفلي من التمثيل الافتراضي لمحول الطاقة المحاذي (نصف الدائرة الصفراء) مع الجزء السفلي من الدليل. تظهر اللوحة اليمنى مظهر الدليل المطبوع 3D على التصوير بالرنين المغناطيسي من العرض الإكليلي. كانت الدائرة الساطعة مصنوعة من مادة دعم متعددة النفاثات لها تباين قوي في التصوير بالرنين المغناطيسي. تم تشكيل الصليب بالبلاستيك. تمثل الدائرة الصفراء موقع محول الطاقة الذي تمت محاذاته بشكل مركز مع الدليل داخل إطار مجسم. (د) لاستهداف هياكل الدماغ ، تم تحريك محول طاقة افتراضي في الاتجاه z فوق الفئران لمطابقة سمك مخروط / غلاف الموجات فوق الصوتية. في هذه الحالة ، بسبب سمك الحمام المائي ، تم تحريك محول الطاقة 8.2 مم فوق الدليل لاستهداف دقيق. تم اختيار هياكل الدماغ باستخدام بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي ، ثم تم تدوين إحداثيات التصوير بالرنين المغناطيسي الخاصة بهم وإدخالها في جهاز التجسيم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> الشكل 2: واجهة البرنامج المستخدم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> الشكل 3: عملية مطابقة مساحة إحداثيات التصوير بالرنين المغناطيسي مع أداة التجسيم. (أ) تمت محاذاة ثلاثة ثقوب داخل حامل محول الطاقة مع ثلاثة ثقوب داخل دليل التصوير بالرنين المغناطيسي ، وتم إدخال ثلاثة مسامير استهداف مخروطية دون التسبب في ثني المجموعة بأكملها. (ب) من الناحية المثالية ، ستوضع البراغي الثلاثة في وسط الثقوب. (ج) إذا كان هناك أي عدم دقة في المحاذاة ، فلن تتناسب جميع البراغي الثلاثة ، على سبيل المثال ، في حالة الانحراف الصغير غير المحسوس المحتمل بمقدار 1 درجة ، فإن مسمارا واحدا فقط سيكون مناسبا بينما يتم لصق البراغي المقابلة في دليل التصوير بالرنين المغناطيسي. بدلا من ذلك ، يمكن أن يكون هناك ثني مرئي للتجميع بأكمله حيث تم دفع البراغي من خلاله. (د) رؤية موسعة لتركيب المسامير. يجب وضع البراغي بشكل مركز للحصول على أفضل دقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> الشكل 4: إعادة التوزيع السريع للفقاعات الدقيقة داخل المحقنة. (أ) تم تصوير حقنة بعد 5 ثوان من الخلط. (ب) وبعد دقيقة واحدة، كانت هناك طبقة واضحة للعيان تظهر بعض الفقاعات مركزة بالقرب من الجزء العلوي من حقنة السل سعة 1 مل. هذا المثال ، على وجه الخصوص ، استخدم محلول الفقاعات الدقيقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> الشكل 5: عملية وضع مركز الترجام فوق مركز موجه التصوير بالرنين المغناطيسي. (أ) في النماذج المبينة في هذه الورقة، صمم الحامل الأحمر بحيث يتحرك بمقدار 10.56 ملم للأمام من الموضع الموضح في الشكل 3 ب إلى الموضع الموضح هنا. (ب) تمت إزالة دليل التصوير بالرنين المغناطيسي الأزرق قبل الصوتنة ، وتم تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية بين الماوس ومحول الطاقة (البرتقالي) لضمان مرور الموجات فوق الصوتية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> الشكل 6: تصور التصوير بالرنين المغناطيسي لفتحة BBB. (أ) منظر محوري لفتحة BBB. تظهر المنطقة الأكثر إشراقا المخصصة برأس سهم تسرب عامل تباين MRI T1 . (ب) منظر إكليلي للحصين الظهري والقشرة فوق الحصين المستهدفين برؤوس السهام. (ج) منظر إكليلي للحصين المركزي المستهدف برؤوس السهام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> الشكل 7: مثال على استهداف 4 مواقع دماغية باستخدام نظام الاستهداف ثلاثي البراغي الموصوف في هذه الورقة. أظهرت المناطق ذات رؤوس الأسهم BBB مواقع مفتوحة مع انتشار عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي. تم استهداف المواقع الأربعة على التوالي ، مع ~ 150 ثانية بين كل فتحة BBB ، من الأسفل إلى الأعلى. تم التقاط الصورة في غضون 2 دقيقة بعد افتتاح BBB الأخير. شريط المقياس 2 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> الشكل 8: الكشف عن تعبير DREADD.  (أ) التلوين المناعي للفلوروفور المرتبط ب DREADDs ، في هذه الحالة كان mCherry طريقة موثوقة للكشف في بعض الدراسات. (ب) في قسم تمثيلي آخر مع DREADDs التي تستهدف الحصين باستخدام نفس الظروف كما في (أ) ، أنتج مضان mCherry في حد ذاته خلفية قوية وإشارة ضعيفة نسبيا. (ج) كعنصر تحكم سلبي ، تم استخدام فأر تلقى حقنة جهازية من AAV ، لكنه لم يخضع ل FUS-BBBO. لا يمكن العثور على تعبير مهم من خلال mCherry immunostaining. أشرطة المقياس 500 مم. (البيانات في a ، c مقتبسة من7 مع أذونات ، حقوق الطبع والنشر 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لتوصيل الجينات من خلال فتح حاجز الدم الدماغي بالموجات فوق الصوتية المركزة (BBB) ، وتقييم التعبير الجيني الناتج ، وقياس نشاط التعديل العصبي للمستقبلات الكيميائية الجينية من خلال الاختبارات النسيجية.

الموجات فوق الصوتية المركزة التي تحفز فتح الحاجز الدموي الدماغي لاستهداف هياكل الدماغ وتقييم التعديل العصبي الكيميائي الوراثي

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

تصوير [كنفوكل] عالية الدقة لحاجز الدم في الدماغ: التصوير، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والتقدير الكمي ترانسسيتوسيس

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

في فيفو حاجز الدم في الدماغ نفاذية مقايسة في الفئران باستخدام المسمى فلوريسسينتلي تتبع

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

تقييم في فيفو لتعطيل حاجز الدم في الدماغ في نموذج الفئران من السكتة الدماغية

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

نهج Benchtop لموقع محدد فتح حاجز الدم الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة في نموذج الفئران

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

A عالية الإنتاجية صورة موجهة الخلايا العصبية المجسمة ونظام الموجات فوق الصوتية مركزة لفتح حاجز الدم في الدماغ القوارض

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

إصابة عصبية مستهدفة لقطع غير الغازية من دوائر الدماغ

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

توصيل الأجسام المضادة إلى الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية عبر اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

إعادة بناء الحاجز الدموي الدماغي في المختبر لنمذجة الأمراض العصبية واستهدافها علاجيا

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...