Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Flere 3D-printede komponenter blev oprindeligt designet af Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrig). Forfatteren takker John Heath (Caltech) og Margaret Swift (Caltech) for teknisk hjælp med at forberede manuskriptet.

Ingen interessekonflikt.

ATAC kræver en vellykket implementering af flere teknikker til vellykket neuromodulation af specifikke neurale kredsløb, herunder nøjagtig MR-guidet målretning, FUS-BBBO og histologisk evaluering af genekspression. 3D-printbare komponenter blev udviklet for at forenkle målretning af små hjernestrukturer med billeddannelsesstyret FUS-BBBO.
MR-guidet fokuseret ultralyd (MRIgFUS) administration udgør en række udfordringer. For det første har typisk MR-spole begrænset plads, der er designet til kun at rumme en prøve og ikke ultralydhardwaren. De større boringer af MR'er øger omkostningerne ved udstyr og reducerer billedkvaliteten, da signalet er relateret til fyldningsfaktoren for en spole32. Derfor vil enhver FUS-hardware, der placeres oven på et dyrebillede i MR, kompromittere billedkvaliteten. For det andet er det vanskeligt og dyrt at designe MR-kompatible enheder. MR-kompatible materialer skal være diamagnetiske, have lav tilbøjelighed til at skabe hvirvelstrømme under radiofrekvensbestråling og have lav magnetisk modtagelighed i høje magnetfelter. I ethvert ledende materiale vil skabelsen af hvirvelstrømme eller dets magnetiske modtagelighed også påvirke billedkvaliteten negativt. Endelig har de tilgængelige MR-kompatible materialer lavere Youngs moduli og holdbarhed end de metaller, der typisk anvendes til fremstilling af præcise målretningsmaskiner, f.eks. stereotaksiske rammer. Motorerne, der bruges til positionsjusteringer, skal være MR-kompatible og placeres uden for MR-boringen på grund af deres størrelse. Disse motorer skal tilsluttes i en afstand til transduceren inde i en MR-boring ved hjælp af MR-kompatible materialer. Problemer med plastisk vridning, mangel på tilstrækkelig plads inde i boringen til at implementere komponenter i robust størrelse og utilstrækkelig plads til at ændre målretningspositioner på tværs af hele hjernen har påvirket målretningsnøjagtigheden i tidligere arbejde.
For at løse disse problemer blev det besluttet at udføre billeddannelse i MR- og FUS-BBBO-administration uden for scanneren. For at muliggøre MR-vejledning blev mus placeret inde i en 3D-printet fastholdelse, der havde en MR-synlig målretningsguide, der kunne bruges til at lokalisere musehjernestrukturerne både i MR og i stereotax-koordinatrummet. Da både musekraniet og målretningsguiden er fastgjort til ørestangholdere (figur 1a,b), kan en målretningsguide bruges til at korrelere rumlige koordinater inden for MR-billedet og nulstille de stereotaksiske instrumenter. Fastholdelsen har ikke bevægelige dele og indeholder ikke en transducer, hvilket gjorde det muligt for os at gøre den både robust og tilstrækkelig lille til at passe ind i en MR og fjernede signalinterferens fra transducerens elektronik. Pladsen inde i målretningsguiden er blevet udhulet, da den 3D-printede understøttelse af nogle materialer er synlig i MR (figur 1c). Huller i samlingen blev indført for at muliggøre stereotaxkalibrering (figur 3). Ultralydstransduceren blev fastgjort til en elektrodeholder af en stereotax, og målretning blev udført som beskrevet i afsnit 4 (figur 1d). Transduceren skal understøttes langs dens længde af ørestænger, hvilket forhindrer enhver afvigelse fra planplanet. Målretningen i dorso-ventral retning kan opnås ved hjælp af faseforskydninger i et ringformet array.
Den praktiske målretningspræcision bestemmes af ultralydsfokusering og kraniedæmpning. FUS-BBBO-proceduren er detaljeret beskrevet for rotter 11 og er implementeret i en række andre modelorganismer23,33,34 og hos mennesker 16,17. Forholdet mellem ultralydsfokusstørrelse omvendt proportional med frekvens, hvor højere frekvenser kan resultere i mere præcis levering. Imidlertid øges dæmpningen af kraniet med frekvenser35, hvilket kan føre til kranieopvarmning og beskadigelse af de kortikale områder. Den nøjagtige målretningsstrategi afhænger af hjernens websted. De steder, hvor et halvt maksimalt tryk i fuld bredde passer ind i hjernevævet, giver mulighed for forudsigelig og sikker BBB-åbning i mange hjernestrukturer såsom striatum, mellemhjerne og hippocampus. Regioner nær bunden af hjernen udgør en særlig udfordring hos mus. Musens hjerne måler ca. 8-10 mm i dorso-ventral retning, hvilket kan sammenlignes med den fulde bredde halv maksimale størrelse af mange kommercielt tilgængelige transducere. Derfor kan målretning i bunden af kraniet føre til ultralydsrefleksion fra knogler og luft, der er til stede i øregangene, munden eller luftrøret, hvilket kan føre til uforudsigelige mønstre af høje og lave tryk36. Nogle af disse tryk kan krydse en inertial kavitationstærskel, som har vist sig at forårsage blødning og vævsskade37. For at målrette regioner, der er placeret nær bunden af kraniet, kan det være at foretrække at bruge intersektionel ATAC7, hvor intersektionel genetik38 bruges til at begrænse genekspression til et mindre område end det, der er målrettet med FUS-stråle. I det offentliggjorte eksempel på intersektionel ATAC er et transgent dyr, der udtrykker et genredigeringsenzym (Cre38) i dopaminerge celler, blevet målrettet med ultralyd i underafsnittet af regionen, der indeholder dopaminerge celler. Endelig kan de kortikale regioner målrettes med FUS, men diffraktion og refleksion af ultralyd kan forekomme, hvilket fører til ujævne trykprofiler. Denne protokol dækker ikke målretning mod kortikale regioner, da den vil være stærkt afhængig af de anvendte arter. Imidlertid er der observeret en vis målretning af cortex over hippocampus 7 (f.eks. Figur 7), hvilket indikerer, at det i det mindste hos mus er muligt.
Valget af en kemogenetisk aktivator og dosering afhænger af de specifikke eksperimentelle behov. En række undersøgelser, herunder en af forfatternes undersøgelser7, viste ingen signifikant ikke-specifik respons39,40, mens højere doser (f.eks. 10 mg / kg) kan give bivirkninger, i det mindste i nogle tilfælde41. Men som med alle adfærdseksperimenter er korrekt kontrol31 afgørende på grund af potentiel off-målrettet aktivitet af CNO og dets metabolitter42. Sådanne kontroller kan omfatte administration af CNO og saltvandskontrol til dyr, der udtrykker DREADD'er, og administration af CNO til vildtypedyr eller i nogle specifikke tilfælde en sammenligning af ipsi- og kontralaterale steder i hjernen, der henholdsvis udtrykker kemogenetiske receptorer og ikke udtrykker deme. Derudover afslørede nyere forskning en række nye DREADD-agonister med forbedret specificitet28,29,43. Andre kemogenetiske receptorer 5,25,44 kan også anvendes sammen med ATAC-proceduren.
Histologisk vurdering af genekspression er nødvendig post mortem for hvert dyr. En lille brøkdel af dyrene viser dårlig genekspression efter FUS-BBBO7. Derudover er det nødvendigt at vise den rumlige nøjagtighed og specificitet af genekspression, da fejlmålretning er mulig. Bemærk, at nogle AAV'er kan vise retrograd eller anterograd sporingsevne45 og kan forårsage transfektion langt fra det sted, der er målrettet mod ultralyd på trods af nøjagtig ultralydmålretning. Hvis den udtrykte kemogenetiske receptor er smeltet sammen med eller co-udtrykker en fluorofor, kan billeddannelse af fluoroforen i vævssektioner være tilstrækkelig til at evaluere lokalisering og ekspressionsintensitet. Imidlertid er mange fluorescerende proteiner beskadiget af vævsfikseringsprocessen, og immunfarvning for mCherry-protein, der ofte bruges med DREADD'er, gav bedre signal i tidligere undersøgelser7. Endelig kan det på grund af tætheden af neuroner i visse dele af hjernen (f.eks. granulært cellelag i hippocampus) være gavnligt at anvende nuclear-lokaliserede fluoroforer udtrykt under IRES, i modsætning til fusioner, til at udføre celletællinger, da kerner let kan segmenteres og modfarves med nukleare pletter, såsom DAPI eller TO-PRO-3. At evaluere neuromodulation ved c-Fos-farvning, udføre nuklear modfarvning og tælle c-Fos-positive kerner snarere end noget fluorescenssignal er bydende nødvendigt. I nogle tilfælde kan cellulært affald vise fluorescens og forvirre målingerne af positive celler.
Begrænsninger af lægemiddel- og genafgivelse med FUS-BBBO inkluderer lavere opløsning end levering med invasive intrakranielle injektioner og behovet for større mængder injicerede lægemidler eller virale vektorer. Derudover, mens en direkte injektion i hjernen resulterer i eksklusiv levering til et injiceret sted, bruger FUS-BBBO en intravenøs vej, hvilket resulterer i mulig levering til perifert væv. Begrænsninger ved brug af kemogenetik til neuromodulation omfatter en langsom tidsplan, som kan være utilstrækkelig til nogle adfærdsmæssige protokoller, der kræver hurtige ændringer i intensiteten af neuromodulation.

Brug af kredsløbsspecifikke neuromodulationsteknologier, såsom optogenetik1,2 og kemogenetik 3,4,5, har fremmet vores forståelse af psykiatriske tilstande som neuronale kredsløbsforstyrrelser. Neuronale kredsløb er vanskelige at studere og endnu vanskeligere at kontrollere ved behandling af hjernesygdomme, fordi de typisk defineres af specifikke celletyper, hjerneområder, molekylære signalveje og timing af aktivering. Ideelt til både forskning og kliniske anvendelser ville en sådan kontrol udøves ikke-invasivt, men det er udfordrende at opnå både præcis og ikke-invasiv neuromodulation. For eksempel, mens neuroaktive lægemidler kan nå hjernen ikke-invasivt, mangler de rumlig specificitet ved at virke i hele hjernen. På den anden side kan elektrisk dyb hjernestimulering kontrollere specifikke hjerneområder, men har svært ved at kontrollere specifikke celletyper og kræver kirurgi og enhedsplacering6.
Akustisk målrettet kemogenetik7 (ATAC) giver neuromodulation med rumlig, celletype og tidsmæssig specificitet. Det kombinerer tre teknikker: fokuseret ultralydinduceret blod-hjerne-barriereåbning (FUS-BBBO) til rumlig målretning, anvendelse af adeno-associerede virale vektorer (AAV'er) til ikke-invasivt at levere gener under kontrol af celletypespecifikke promotorer og konstruerede kemogenetiske receptorer til selektivt at modulere transfekterede neurale kredsløb via lægemiddeladministration. FUS er en FDA-godkendt teknologi, der udnytter ultralydets evne til at fokusere dybt inde i væv, herunder den menneskelige hjerne, med millimeter rumlig præcision. Ved høj effekt anvendes FUS til ikke-invasiv målrettet ablation, herunder en FDA-godkendt behandling for essentiel tremor8. FUS-BBBO kombinerer ultralyd med lav intensitet med systemisk administrerede mikrobobler, som svinger i blodkar ved ultralydfokus, hvilket resulterer i lokaliseret, midlertidig (6-24 timer) og reversibel åbning af BBB9. Denne åbning muliggør levering af proteiner 9,10, små molekyler 11 og virale vektorer7,12,13,14 til hjernen uden væsentlig vævsskade hos gnavere 10 og ikke-menneskelige primater 15. Kliniske forsøg er i gang for FUS-BBBO16,17, hvilket indikerer mulige terapeutiske anvendelser af denne teknik.
Viral genlevering ved hjælp af AAV udvikler sig også hurtigt til klinisk brug for CNS-lidelser, med nylige FDA- og EU-regulatoriske godkendelser som vigtige milepæle. Endelig anvendes kemogenetiske receptorer18, såsom designerreceptorer, der udelukkende aktiveres af designerlægemidler (DREADD'er), i vid udstrækning af neuroforskere til at tilvejebringe farmakologisk kontrol over neuronal excitation hos transgene eller transfekterede dyr19,20. DREADD'er er G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er), der er genetisk manipuleret til at reagere på syntetiske kemogenetiske molekyler snarere end endogene ligander, således at systemisk administration af disse ligander øger eller reducerer excitabiliteten af DREADD-ekspressive neuroner. Når disse tre teknologier kombineres i ATAC, kan de bruges til ikke-invasiv modulering af udvalgte neurale kredsløb med rumlig, celletype og tidsmæssig præcision.
Her udvider og opdaterer vi en tidligere offentliggjort protokol for FUS-BBBO11 ved at inkludere metoder til nøjagtig målretning af hjerneområder med FUS-BBBO i mus ved hjælp af simpelt 3D-printet målretningsudstyr. Vi viser også en anvendelse af FUS-BBBO til ATAC. Vi viser trin, der er nødvendige for levering af AAV'er, der bærer kemogenetiske receptorer, og evaluering af genekspression og neuromodulation ved histologi. Denne teknik er især anvendelig til at målrette mod store eller flere hjerneområder til genekspression eller neuromodulation. For eksempel kan et bredt område af en cortex let transduceres med FUS-BBBO og moduleres ved hjælp af kemogenetik. Genlevering med en alternativ teknik, intrakranielle injektioner, ville imidlertid kræve et stort antal invasive injektioner og kraniotomier. FUS-BBBO og dens anvendelse, ATAC, kan skaleres til dyr af forskellig størrelse, hvor hjerneområder er større og sværere at målrette invasivt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

Akustisk målrettet kemogenetik (ATAC) giver mulighed for ikke-invasiv kontrol af specifikke neurale kredsløb. ATAC opnår en sådan kontrol gennem en kombination af fokuseret ultralyd (FUS) induceret blod-hjerne barriereåbning (FUS-BBBO), genlevering med adeno-associerede virale (AAV) vektorer og aktivering af cellulær signalering med konstruerede, kemogene, proteinreceptorer og deres beslægtede ligander. Med ATAC er det muligt at transducere både store og små hjerneområder med millimeterpræcision ved hjælp af en enkelt ikke-invasiv ultralydsapplikation. Denne transduktion kan senere muliggøre en langsigtet, ikke-invasiv, enhedsfri neuromodulation i frit bevægelige dyr ved hjælp af et lægemiddel. Da FUS-BBBO, AAV'er og kemogenetik er blevet anvendt i flere dyr, bør ATAC også være skalerbar til brug i andre dyrearter. Dette papir udvider en tidligere offentliggjort protokol og skitserer, hvordan man optimerer genleveringen med FUS-BBBO til små hjerneområder med MR-vejledning, men uden behov for en kompliceret MR-kompatibel FUS-enhed. Protokollen beskriver også designet af musemålretnings- og fastholdelseskomponenter, der kan 3D-printes af ethvert laboratorium og let kan ændres til forskellige arter eller brugerdefineret udstyr. For at hjælpe reproducerbarheden beskriver protokollen detaljeret, hvordan mikrobobler, AAV'er og venipunktur blev brugt i ATAC-udvikling. Endelig vises et eksempel på data til vejledning i de indledende undersøgelser af undersøgelser ved hjælp af ATAC.

Det første trin i udførelsen af ATAC-protokollen er målretning af FUS-BBBO til de ønskede hjerneområder. For eksempel blev hippocampus målrettet med FUS-BBBO efter den beskrevne protokol, og kontrastmiddel og AAV9-bærende DREADD'er blev injiceret i musene efterfulgt af en FLASH 3D MR-sekvens, der erhverver billeder af musehjernen. En T1-signalforbedring blev opnået i hippocampusområdet (figur 6) og i andre dele af hjernen (figur 7). Efter flere uger blev DREADD'er udtrykt inde i målhjerneområdet. Mens mange DREADD'er er smeltet sammen med en fluorescerende reporter (f.eks. mCherry), viste processen med perfusion og fiksering med formaldehyd sig drastisk at reducere fluorescensen af disse proteiner. Immunfarvning mod mCherry eller DREADD førte til mere pålidelig påvisning af ekspressionen (figur 8) baseret på tidligere erfaringer. I tidligere eksperimenter viste ~ 85% af musene udtryk efter FUS-BBBO7. En simpel test for tilstrækkelige niveauer af udtryk for DREADD'er tester deres funktionalitet på celleniveau. Gøres ved at tilvejebringe en kemogenetisk ligand eller en saltvandskontrol, såsom CNO 19, deschlorclozapin28 eller andre29, og vente 2 timer før en hjerteperfusion og fiksering. Hjernesektionerne blev derefter co-immunfarvet for c-Fos-protein30, hvilket indikerer øget aktivitet af neuroner, og for DREADD. Eksperimentet blev betragtet som vellykket, hvis hjernens sted målrettet mod DREADD'er viste signifikant højere antal neuronale kerner, der er c-Fos-positive i gruppen, der modtog en kemogenetisk ligand sammenlignet med gruppen, der modtog saltvand7 eller sammenlignet med et kontralateralt sted, der ikke blev udsat for FUS-BBBO. Bemærk, at der er et potentiale for nogle af disse ligander til at aktivere neuroner ikke-specifikt uden udtryk for DREADD'er. For eksempel har CNO vist sig at blive metaboliseret til lave niveauer af clozapin hos mus, som krydser BBB og aktiverer DREADD'er med høj styrke27. Det viste sig dog også at binde sig til ikke-specifikke steder. Som i ethvert eksperiment er det afgørende at inkludere alle ordentlige kontroller i kemogenetiske undersøgelser31. En mulig kontrol er administration af den kemogenetiske ligand til vildtypemus uden procedurer for at udelukke virkningerne af lægemidlet alene på det ønskede adfærdsmæssige eller histologiske assay. En anden kontrol kunne være inklusion af fire grupper: DREADD + ligand, DREADD + køretøj, EGFP + ligand, EGFP + køretøj, som vil redegøre for eventuelle potentielle virkninger af både genlevering med FUS-BBBO og den kemogenetiske ligand.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figur 1: Processen med MR-vejledt målretning af FUS i ATAC. a) Placering af mus med ørestænger, næsekegle og platform, der kan være inde i en MR-scanner. (b) En 3D-printet vejledning (blå), der er synlig i MR, blev fastgjort til enderne af ørestangsrammen og derefter fastgjort på plads med en holder af en overflade MR-spole, der indeholder fire snap-on bolte (halvgennemsigtig blå). (c) Udseende af den 3D-printede guide i sagittal MR (venstre panel) med en bund af den virtuelle repræsentation af en transducer justeret (gul halvcirkel) med bunden af guiden. Højre panel viser udseendet af den 3D-printede vejledning om MR fra koronal visning. Den lyse cirkel var lavet af et polyjetstøttemateriale, der har en stærk MR-kontrast. Korset blev dannet med plastik. En gul cirkel repræsenterer transducerens placering, som var justeret koncentrisk med styret inde i en stereotaksisk ramme. (d) For at målrette hjernestrukturer blev en virtuel transducer flyttet i z-retning over musene for at matche tykkelsen af en ultralydskegle / hus. I dette tilfælde blev transduceren flyttet 8,2 mm over styret for nøjagtig målretning på grund af vandbadets tykkelse. Hjernestrukturer blev valgt ved hjælp af MR-billeddata, og deres MR-koordinater blev derefter skrevet ned og indtastet i stereotaxic-maskinen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figur 2: Grænseflade af den anvendte software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figur 3: Proces til matchning af MR-koordinatrum til stereotaksisk instrument. (a) Tre huller i en transducerholder blev justeret med tre huller i MR-styret, og tre koniske målretningsbolte blev indsat uden at forårsage flex til hele samlingen. (b) Ideelt set ville alle tre bolte sidde midt i hullerne. (c) Hvis der er nogen unøjagtighed i justeringen, ville ikke alle tre bolte passe ind, f.eks. i tilfælde af små, sandsynligvis umærkelige krøjer på 1°, ville kun en bolt passe ind, mens de modsatte bolte ville sidde fast ved MR-styret. Alternativt kunne der være synlig flex af hele samlingen, da bolte blev tvunget igennem. d) Forstørret billede af boltmontering. Boltene skal placeres koncentrisk for den bedste nøjagtighed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figur 4: Hurtig omfordeling af mikrobobler inde i sprøjten. (a) Sprøjten blev fotograferet 5 s efter blanding. (b) Et minut senere var der et tydeligt synligt lag, der viste noget af boblekoncentratet nær toppen af 1 ml tuberkulinsprøjte. Dette eksempel anvendte især en opløsning af mikrobobler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figur 5: Proces med at placere midten af en transducer over et center af en MR-guide. (a) I de modeller, der er vist i dette papir, er den røde bærer konstrueret til at bevæge sig 10,56 mm fremad fra den position, der er vist i figur 3b, til den position, der er vist her. (b) Den blå MR-guide blev fjernet før sonikering, og en ultralydgel blev påført mellem musen og transduceren (orange) for at sikre ultralydpassage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figur 6: MR-visualisering af BBB-åbningen. a) Aksial visning af BBB-åbningen. Lysere område udpeget med en pilespids viser ekstravasation af et MR T1 kontrastmiddel. b) Koronalt billede af dorsal hippocampus og cortex over hippocampus målrettet med FUS-BBBO (pilespidser). c) Koronalt billede af den centrale hippocampus målrettet med FUS-BBBO (pilespidser). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figur 7: Eksempel på målretning af 4 hjernesteder ved hjælp af tre-bolt målretningssystemet beskrevet i denne artikel. Områder med pilespidser viste, at BBB åbnede steder med diffusion af et MR-kontrastmiddel. De fire steder blev målrettet efter hinanden med ~ 150 s mellem hver BBB-åbning, fra bunden til toppen. Billedet blev taget inden for 2 minutter efter den sidste BBB-åbning. Vægtbjælken er 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Figur 8: Registrering af DREADD-udtryk.  (a) Immunfarvning for fluoroforen fastgjort til DREADD'er, i dette tilfælde var mCherry en pålidelig metode til påvisning i nogle undersøgelser. b) I et andet repræsentativt afsnit med DREADD'er rettet mod hippocampus under de samme betingelser som i (a) producerede fluorescensen af mCherry i sig selv stærk baggrund og relativt svagt signal. c) Som negativ kontrol blev der anvendt en mus, der fik systemisk injektion af AAV, men ikke fik FUS-BBBO. Intet signifikant udtryk kan findes ved mCherry immunfarvning. Skalabjælker er 500 mm. (Data i a, c tilpasset fra7 med tilladelser, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Denne protokol afgrænser trin, der er nødvendige for genlevering gennem fokuseret ultralyd blodhjernebarriere (BBB) åbning, evaluering af den resulterende genekspression og måling af neuromodulationsaktivitet af kemogenetiske receptorer gennem histologiske tests.

Fokuseret ultralydinduceret blod-hjerne-barriereåbning til målretning af hjernestrukturer og evaluering af kemogenetisk neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Høj opløsning Konfokal billeddannelse af blod - hjerne barrieren: Imaging, 3D rekonstruktion og kvantificering af Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet Assay i mus ved hjælp af Fluorescently mærket røbestoffer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

En In Vivo evaluering af blod - hjerne barrieren forstyrrelser i en rotte Model af iskæmisk slagtilfælde

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

En benchtop tilgang til placeringsspecifik blodhjernebarriereåbning ved hjælp af fokuseret ultralyd i en rottemodel

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

En high-throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation og fokuseret ultralyd system til blod-hjerne barrieren Åbning i gnavere

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Målrettet neuronal skade for ikke-invasiv afbrydelse af hjernen kredsløb

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Levering af antistoffer i hjernen ved hjælp af fokuseret scanning ultralyd

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registrering af barrierefunktionel integritet på bEnd.3 Vaskulære endotelceller via transendotelial elektrisk modstandsdetektion

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Rekonstruktion af blod-hjerne-barrieren in vitro til modellering og terapeutisk målretning af neurologisk sygdom

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...