Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Verschillende 3D-geprinte componenten zijn oorspronkelijk ontworpen door Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrijk). Auteur bedankt John Heath (Caltech) en Margaret Swift (Caltech) voor technische hulp bij het voorbereiden van het manuscript.

Geen belangenverstrengeling.

ATAC vereist een succesvolle implementatie van verschillende technieken voor succesvolle neuromodulatie van specifieke neurale circuits, waaronder nauwkeurige MRI-geleide targeting, FUS-BBBO en histologische evaluatie van genexpressie. 3D-printbare componenten zijn ontwikkeld om het richten op kleine hersenstructuren te vereenvoudigen met beeldgestuurde FUS-BBBO.
MRI-geleide gerichte echografie (MRIgFUS) toediening brengt een aantal uitdagingen met zich mee. Ten eerste heeft een typische MRI-spoel een beperkte ruimte die is ontworpen om alleen een monster te huisvesten en niet de echografiehardware. De grotere boringen van MRI's verhogen de kosten van apparatuur en verminderen de beeldkwaliteit, omdat het signaal gerelateerd is aan de vulfactor van een spoel32. Bijgevolg zal elke FUS-hardware die op de bovenkant van een dierbeeld in MRI wordt geplaatst, de beeldkwaliteit in gevaar brengen. Ten tweede is het ontwerpen van MRI-compatibele apparaten moeilijk en duur. MRI-compatibele materialen moeten diamagnetisch zijn, een lage neiging hebben om wervelstromen te creëren tijdens radiofrequente bestraling en een lage magnetische gevoeligheid hebben in hoge magnetische velden. In elk geleidend materiaal zal de creatie van wervelstromen of de magnetische gevoeligheid ervan ook de beeldkwaliteit negatief beïnvloeden. Ten slotte hebben de beschikbare MRI-compatibele materialen een lagere moduli en duurzaamheid van Young dan de metalen die doorgaans worden gebruikt bij de productie van nauwkeurige richtmachines, zoals stereotaxische frames. De motoren die worden gebruikt voor positieaanpassingen moeten MRI-compatibel zijn en vanwege hun grootte buiten de MRI-boring worden geplaatst. Deze motoren moeten op afstand worden aangesloten op de transducer in een MRI-boring met behulp van MRI-compatibele materialen. Problemen met plastic kromtrekken, gebrek aan voldoende ruimte in de boring om componenten van robuuste grootte te implementeren en onvoldoende ruimte voor het veranderen van richtposities in de hele hersenen hebben de targetingnauwkeurigheid in eerder werk beïnvloed.
Om deze problemen op te lossen, werd besloten om beeldvorming uit te voeren in MRI en FUS-BBBO toediening buiten de scanner. Om MRI-begeleiding mogelijk te maken, werden muizen in een 3D-geprinte beperking geplaatst met een MRI-zichtbare richtgids die kon worden gebruikt om de hersenstructuren van de muis te lokaliseren, zowel in de MRI als in de stereotaxcoördinatenruimte. Omdat zowel de muizenschedel als de richtgeleider stevig zijn bevestigd aan oorbalkhouders (figuur 1a,b), kan een richtgids worden gebruikt om ruimtelijke coördinaten binnen het MRI-beeld te correleren en de stereotaxische instrumenten nul te zetten. Het beveiligingssysteem heeft geen bewegende delen en bevat geen transducer, waardoor we het zowel robuust als voldoende klein konden maken om in een MRI te passen en signaalinterferentie van de elektronica van de transducer konden verwijderen. De ruimte in de richtgeleider is uitgehold omdat de 3D-geprinte ondersteuning voor sommige materialen zichtbaar is in MRI (figuur 1c). Er werden gaten in de assemblage aangebracht om stereotaxiskalibratie mogelijk te maken (figuur 3). De ultrasone transducer werd bevestigd aan een elektrodehouder van een stereotaxis en de targeting werd uitgevoerd zoals beschreven in rubriek 4 (figuur 1d). De transducer moet over de lengte worden ondersteund door de behuizing van oorbalken, waardoor elke afwijking van het vlakke vlak wordt voorkomen. De targeting in de dorso-ventrale richting kan worden bereikt met behulp van faseverschuivingen in een ringvormige array.
De praktische richtprecisie wordt bepaald door ultrasone scherpstelling en schedelverzwakking. De FUS-BBBO-procedure is in detail beschreven voor ratten 11 en is geïmplementeerd in een aantal andere modelorganismen23,33,34 en bij mensen 16,17. De relatie tussen ultrasone focusgrootte omgekeerd evenredig met frequentie, waarbij hogere frequenties kunnen resulteren in een nauwkeurigere afgifte. De verzwakking van de schedel neemt echter toe met frequenties35, wat kan leiden tot schedelverwarming en schade aan de corticale gebieden. De exacte targetingstrategie hangt af van de hersensite. De plaatsen waar een halve maximale druk over de volledige breedte in het hersenweefsel past, zorgen voor een voorspelbare en veilige BBB-opening in veel hersenstructuren zoals het striatum, de middenhersenen en de hippocampus. Regio's in de buurt van de basis van de hersenen vormen een specifieke uitdaging bij muizen. Muishersenen meten ongeveer 8-10 mm in dorso-ventrale richting, wat vergelijkbaar is met de volledige breedte halve maximale grootte van veel in de handel verkrijgbare transducers. Bijgevolg kan het richten op de bodem van de schedel leiden tot ultrasone reflectie van de botten en lucht die aanwezig zijn in gehoorgangen, mond of luchtpijp, wat kan leiden tot onvoorspelbare patronen van hoge en lage druk36. Sommige van deze drukken kunnen een traagheidscavitatiedrempel overschrijden waarvan is aangetoond dat deze bloedingen en weefselbeschadiging veroorzaakt37. Om gebieden te targeten die zich in de buurt van de schedelbasis bevinden, kan het de voorkeur hebben om intersectionele ATAC7 te gebruiken, waarbij intersectionele genetica38 wordt gebruikt om genexpressie te beperken tot een kleiner gebied dan het gebied dat is gericht met FUS-bundel. In het gepubliceerde voorbeeld van intersectionele ATAC is een transgeen dier dat een genbewerkingsenzym (Cre38) tot expressie brengt in dopaminerge cellen het doelwit geweest van echografie in de subsectie van het gebied dat dopaminerge cellen bevat. Ten slotte kunnen de corticale gebieden worden gericht met FUS, maar de diffractie en reflectie van echografie kan optreden en leiden tot ongelijke drukprofielen. Dit protocol heeft geen betrekking op de targeting van corticale gebieden, omdat dit sterk afhankelijk zal zijn van de gebruikte soorten; er is echter enige gerichtheid van de cortex boven hippocampus 7 (bijv. Figuur 7) waargenomen, wat aangeeft dat dit, althans bij muizen, mogelijk is.
De keuze van een chemogenetische activator en dosering zal afhangen van de specifieke experimentele behoeften. Een aantal studies, waaronder een van de studies van de auteurs7, toonden geen significante niet-specifieke respons39,40, terwijl hogere doses (bijv. 10 mg / kg) bijwerkingen kunnen veroorzaken, althans in sommige gevallen41. Zoals bij alle gedragsexperimenten zijn goede controles31 echter essentieel vanwege mogelijke off-gerichte activiteit van CNO en zijn metabolieten42. Dergelijke controles kunnen bestaan uit toediening van CNO- en zoutoplossingscontroles aan dieren die DREADDs tot expressie brengen en toediening van CNO aan dieren van het wilde type of in sommige specifieke gevallen een vergelijking van ipsi- en contralaterale plaatsen van de hersenen die respectievelijk wel en geen chemogenetische receptoren tot expressie brengen. Bovendien onthulde recent onderzoek een aantal nieuwe DREADD-agonisten met verbeterde specificiteit28,29,43. Andere chemogenetische receptoren 5,25,44 kunnen ook worden gebruikt in combinatie met de ATAC-procedure.
Histologische evaluatie van genexpressie is post-mortem noodzakelijk voor elk dier. Een klein deel van de dieren vertoont een slechte genexpressie na FUS-BBBO7. Bovendien is het noodzakelijk om de ruimtelijke nauwkeurigheid en specificiteit van genexpressie aan te tonen, omdat mis-targeting mogelijk is. Van belang is dat sommige AAV's retrograde of anterograde traceringsvermogen45 kunnen vertonen en transfectie kunnen veroorzaken ver van de site die met echografie is gericht, ondanks nauwkeurige ultrasone targeting. Als de tot expressie gebrachte chemogenetische receptor is gefuseerd met of co-expressie brengt met een fluorofoor, kan beeldvorming van de fluorofoor in weefselsecties voldoende zijn om de lokalisatie en intensiteit van expressie te evalueren. Veel fluorescerende eiwitten worden echter beschadigd door het weefselfixatieproces en immunostaining voor mCherry-eiwit dat vaak wordt gebruikt met DREADDs leverde een beter signaal op in eerdere studies7. Ten slotte, vanwege de dichtheid van neuronen in bepaalde delen van de hersenen (bijv. Granulaire cellaag in hippocampus), kan het gebruik van nucleair gelokaliseerde fluoroforen uitgedrukt onder IRES, in tegenstelling tot fusies, om celtellingen uit te voeren, gunstig zijn, omdat kernen gemakkelijk kunnen worden gesegmenteerd en tegengekleurd met nucleaire vlekken, zoals DAPI of TO-PRO-3. Om neuromodulatie door c-Fos-kleuring te evalueren, is het uitvoeren van nucleaire tegenkleuring en het tellen van c-Fos-positieve kernen, in plaats van een fluorescentiesignaal, noodzakelijk. In sommige gevallen kan cellulair puin fluorescentie vertonen en de metingen van positieve cellen verstoren.
Beperkingen van het geneesmiddel en de genafgifte met FUS-BBBO omvatten een lagere resolutie dan toediening met invasieve intracraniële injecties en de behoefte aan grotere hoeveelheden geïnjecteerde geneesmiddelen of virale vectoren. Bovendien, terwijl een directe injectie in de hersenen resulteert in exclusieve toediening aan een geïnjecteerde plaats, gebruikt FUS-BBBO een intraveneuze route die resulteert in mogelijke levering aan perifere weefsels. Beperkingen van het gebruik van chemogenetica voor neuromodulatie omvatten een langzame tijdschaal, die ontoereikend kan zijn voor sommige gedragsprotocollen die snelle veranderingen in de intensiteit van neuromodulatie vereisen.

Het gebruik van circuitspecifieke neuromodulatietechnologieën, zoals optogenetica1,2 en chemogenetica 3,4,5, heeft ons begrip van psychiatrische aandoeningen als neuronale circuitstoornissen verbeterd. Neuronale circuits zijn moeilijk te bestuderen en nog moeilijker te beheersen bij de behandeling van hersenaandoeningen omdat ze meestal worden gedefinieerd door specifieke celtypen, hersengebieden, moleculaire signaalroutes en timing van activering. Idealiter voor zowel onderzoek als klinische toepassingen zou een dergelijke controle niet-invasief worden uitgeoefend, maar het bereiken van zowel nauwkeurige als niet-invasieve neuromodulatie is een uitdaging. Bijvoorbeeld, terwijl neuroactieve geneesmiddelen de hersenen niet-invasief kunnen bereiken, missen ze ruimtelijke specificiteit door in de hersenen te werken. Aan de andere kant kan elektrische diepe hersenstimulatie specifieke hersengebieden beheersen, maar heeft het moeite met het beheersen van specifieke celtypen en vereist het een operatie en plaatsing van het apparaat6.
Acoustically Targeted Chemogenetics7 (ATAC) biedt neuromodulatie met ruimtelijke, celtype en temporele specificiteit. Het combineert drie technieken: gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening (FUS-BBBO) voor ruimtelijke targeting, gebruik van adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV's) om niet-invasieve genen af te leveren onder controle van celtypespecifieke promotors, en gemanipuleerde chemogenetische receptoren om getransfecteerde neurale circuits selectief te moduleren via toediening van geneesmiddelen. FUS is een door de FDA goedgekeurde technologie die gebruik maakt van het vermogen van echografie om diep in weefsels, inclusief het menselijk brein, met millimeter ruimtelijke precisie te focussen. Bij hoog vermogen wordt FUS gebruikt voor niet-invasieve gerichte ablatie, inclusief een door de FDA goedgekeurde behandeling voor essentiële tremor8. FUS-BBBO combineert echografie met lage intensiteit met systemisch toegediende microbubbels, die oscilleren in bloedvaten bij de ultrasone focus, wat resulteert in gelokaliseerde, tijdelijke (6-24 uur) en omkeerbare opening van de BBB9. Deze opening zorgt voor de afgifte van eiwitten 9,10, kleine moleculen11 en virale vectoren7,12,13,14 aan de hersenen zonder significante weefselschade bij knaagdieren 10 en niet-menselijke primaten 15. Klinische studies zijn aan de gang voor FUS-BBBO16,17, wat wijst op mogelijke therapeutische toepassingen van deze techniek.
Virale genafgifte met behulp van AAV vordert ook snel in klinisch gebruik voor CZS-aandoeningen, met recente FDA- en EU-wettelijke goedkeuringen als belangrijke mijlpalen. Ten slotte worden chemogenetische receptoren18, zoals Designer Receptors Activated Exclusively by Designer Drugs (DREADDs), veel gebruikt door neurowetenschappers om farmacologische controle te bieden over neuronale excitatie bij transgene of getransfecteerde dieren19,20. DREADDs zijn G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) die genetisch zijn gemanipuleerd om te reageren op synthetische chemogenetische moleculen in plaats van endogene liganden, zodat systemische toediening van deze liganden de prikkelbaarheid van DREADD-tot expressie brengende neuronen verhoogt of vermindert. Wanneer deze drie technologieën worden gecombineerd in ATAC, kunnen ze worden gebruikt voor de niet-invasieve modulatie van geselecteerde neurale circuits met ruimtelijke, celtype en temporele precisie.
Hier breiden we een eerder gepubliceerd protocol voor FUS-BBBO11 uit en werken we dit bij door een methodologie op te nemen voor het nauwkeurig richten van hersengebieden met FUS-BBBO in muizen met behulp van eenvoudige 3D-geprinte targetingapparatuur. We tonen ook een toepassing van FUS-BBBO op ATAC. We tonen stappen die nodig zijn voor de levering van AAV's met chemogenetische receptoren en evaluatie van genexpressie en neuromodulatie door histologie. Deze techniek is met name toepasbaar voor het richten op grote of meerdere hersengebieden voor genexpressie of neuromodulatie. Een groot gebied van een cortex kan bijvoorbeeld gemakkelijk worden getransduceerd met FUS-BBBO en gemoduleerd met behulp van chemogenetica. Genafgifte met een alternatieve techniek, intracraniële injecties, zou echter een groot aantal invasieve injecties en craniotomieën vereisen. FUS-BBBO en de toepassing ervan, ATAC, kunnen worden geschaald naar dieren van verschillende groottes, waar hersengebieden groter zijn en moeilijker invasief te richten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) maakt de niet-invasieve controle van specifieke neurale circuits mogelijk. ATAC bereikt een dergelijke controle door een combinatie van gerichte echografie (FUS) geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening (FUS-BBBO), genafgifte met adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren en activering van cellulaire signalering met gemanipuleerde, chemogenetische, eiwitreceptoren en hun verwante liganden. Met ATAC is het mogelijk om zowel grote als kleine hersengebieden met millimeterprecisie te transduceren met behulp van een enkele niet-invasieve ultrasone toepassing. Deze transductie kan later een langdurige, niet-invasieve, apparaatvrije neuromodulatie mogelijk maken bij vrij bewegende dieren die een medicijn gebruiken. Aangezien FUS-BBBO, AAV's en chemogenetica bij meerdere dieren zijn gebruikt, moet ATAC ook schaalbaar zijn voor gebruik bij andere diersoorten. Dit artikel borduurt voort op een eerder gepubliceerd protocol en schetst hoe de genafgifte met FUS-BBBO naar kleine hersengebieden kan worden geoptimaliseerd met MRI-begeleiding, maar zonder dat een gecompliceerd MRI-compatibel FUS-apparaat nodig is. Het protocol beschrijft ook het ontwerp van muisgerichte en fixatiecomponenten die door elk laboratorium kunnen worden 3D-geprint en gemakkelijk kunnen worden aangepast voor verschillende soorten of aangepaste apparatuur. Om de reproduceerbaarheid te bevorderen, beschrijft het protocol in detail hoe de microbubbels, AAV's en venapunctie werden gebruikt bij de ontwikkeling van ATAC. Ten slotte worden voorbeeldgegevens getoond die de vooronderzoeken van studies met ATAC begeleiden.

De eerste stap van het uitvoeren van het ATAC-protocol is het richten van de FUS-BBBO op de gewenste hersengebieden. Volgens het beschreven protocol werd de hippocampus bijvoorbeeld aangevallen met FUS-BBBO en werden contrastmiddel en AAV9 met DREADDs in de muizen geïnjecteerd, gevolgd door een FLASH 3D MRI-sequentie die beelden van het muizenbrein verwerft. Een T1-signaalversterking werd bereikt in het hippocampusgebied (figuur 6) en in andere delen van de hersenen (figuur 7). Na enkele weken werden DREADDs uitgedrukt in het doelhersengebied. Hoewel veel DREADD's zijn gefuseerd met een fluorescerende reporter (bijv. mCherry), bleek het proces van perfusie en fixatie met formaldehyde de fluorescentie van deze eiwitten drastisch te verminderen. Immunostaining tegen mCherry of de DREADD leidde tot een betrouwbaardere detectie van de expressie (figuur 8) op basis van eerdere ervaringen. In eerdere experimenten vertoonde ~ 85% van de muizen expressie na FUS-BBBO7. Een eenvoudige test voor voldoende expressieniveaus van DREADDs is het testen van hun functionaliteit op cellulair niveau. Het kan bijvoorbeeld worden gedaan door een chemogenetische ligand of een zoutoplossingcontrole te geven, zoals CNO 19, deschloroclozapine28 of anderen29, en 2 uur te wachten voor een hartperfusie en fixatie. De hersensecties werden vervolgens co-immunogekleurd voor c-Fos-eiwit30, wat wijst op verhoogde activiteit van neuronen, en voor DREADD. Het experiment werd als succesvol beschouwd, als de plaats van de hersenen gericht op DREADDs een significant hoger aantal neuronale kernen vertoonde die c-Fos-positief zijn in de groep die een chemogenetisch ligand ontving in vergelijking met de groep die zoutoplossing7 ontving of vergeleken met een contralaterale site die niet werd onderworpen aan FUS-BBBO. Van belang is dat er een potentieel is voor sommige van deze liganden om neuronen niet-specifiek te activeren zonder expressie van DREADDs. Van CNO is bijvoorbeeld aangetoond dat het wordt gemetaboliseerd tot lage niveaus van clozapine bij muizen, die de BBB kruist en DREADDs met een hoge potentie activeert27. Er werd echter ook aangetoond dat het zich bindt aan niet-specifieke locaties. Zoals in elk experiment is het van cruciaal belang om alle juiste controles op te nemen in chemogenetische studies31. Een mogelijke controle is toediening van het chemogenetische ligand aan wildtype muizen, zonder procedures, om effecten van het medicijn alleen op de gewenste gedrags- of histologische test uit te sluiten. Een andere controle zou de opname van vier groepen kunnen zijn: DREADD + ligand, DREADD + voertuig, EGFP + ligand, EGFP + voertuig, die rekening houden met mogelijke effecten van zowel genafgifte met FUS-BBBO als de chemogenetische ligand.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figuur 1: Het proces van MRI-geleide targeting van FUS in ATAC. (a) Muisplaatsing met oorbalken, een neuskegel en een platform dat in een MRI-scanner kan worden geplaatst. (b) Een 3D-geprinte gids (blauw) die zichtbaar is in MRI werd bevestigd aan de uiteinden van het oorbalkframe en vervolgens op zijn plaats bevestigd met een houder van een oppervlakte-MRI-spoel die vier klikbouten bevat (semi-transparant blauw). c) Weergave van de 3D-geprinte gids in sagittale MRI (linkerpaneel), met een onderkant van de virtuele weergave van een transducer uitgelijnd (gele halve cirkel) met de onderkant van de geleider. Het rechterpaneel toont het uiterlijk van de 3D-geprinte gids op MRI vanuit coronale weergave. De heldere cirkel is gemaakt van een polyjet ondersteuningsmateriaal dat een sterk MRI-contrast heeft. Het kruis was gevormd met plastic. Een gele cirkel vertegenwoordigt de locatie van de transducer die concentrisch was uitgelijnd met de geleider in een stereotaxisch frame. (d) Om hersenstructuren te targeten, werd een virtuele transducer in z-richting boven de muizen verplaatst om overeen te komen met de dikte van een ultrasone kegel / behuizing. In dit geval werd de transducer vanwege de dikte van het waterbad 8,2 mm boven de geleider verplaatst voor nauwkeurige targeting. Hersenstructuren werden geselecteerd met behulp van MRI-beeldvormingsgegevens en hun MRI-coördinaten werden vervolgens opgeschreven en ingevoerd in de stereotaxische machine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figuur 2: Interface van de gebruikte software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figuur 3: Proces van het matchen van MRI-coördinaatruimte met stereotaxisch instrument. (a) Drie gaten in een transducerhouder werden uitgelijnd met drie gaten in de MRI-geleider en drie conische richtbouten werden ingebracht zonder buiging aan de hele assemblage te veroorzaken. (b) Idealiter zouden alle drie de bouten in het midden van de gaten zitten. c) Als er een onnauwkeurigheid is in de uitlijning, zouden niet alle drie de bouten erin passen, bijvoorbeeld in het geval van een kleine, waarschijnlijk onmerkbare geeuw van 1°, zou er slechts één bout in passen, terwijl de tegenovergestelde bouten aan de MRI-geleider zouden vastzitten. Als alternatief kon er zichtbare flex van de hele assemblage zijn als bouten werden doorgedrukt. d) Verruimde weergave van de boutfitting. De bouten moeten concentrisch worden geplaatst voor de beste nauwkeurigheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figuur 4: Snelle herverdeling van microbubbels in de spuit. (a) De spuit werd 5 s na het mengen gefotografeerd. b) Een minuut later was er een duidelijk zichtbare laag met een deel van het bellenconcentraat aan de bovenkant van 1 ml tuberculinespuit. Met name in dit voorbeeld werd een oplossing van microbubbels gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figuur 5: Proces van het plaatsen van het midden van een transducer over een midden van een MRI-gids. a) In de in dit document getoonde modellen is de rode drager ontworpen om 10,56 mm naar voren te bewegen van de positie in figuur 3b naar de hier afgebeelde positie. (b) De blauwe MRI-gids werd vóór de ultrasoonapparaat verwijderd en een ultrasone gel werd aangebracht tussen de muis en de transducer (oranje) om ultrasone passage te garanderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figuur 6: MRI-visualisatie van de BBB-opening. a) Axiale weergave van de BBB-opening. Helderder gebied aangeduid met een pijlpunt toont extravasatie van een MRI T1-contrastmiddel . (b) Coronale weergave van de dorsale hippocampus en de cortex boven de hippocampus gericht met FUS-BBBO (pijlpunten). c) Coronale weergave van de centrale hippocampus gericht met FUS-BBBO (pijlpunten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figuur 7: Voorbeeld van targeting van 4 hersensites met behulp van het driebouts targetingsysteem dat in dit artikel wordt beschreven. Gebieden met pijlpunten toonden BBB geopende plaatsen met diffusie van een MRI-contrastmiddel. De vier sites werden achtereenvolgens getarget, met ~ 150 s tussen elke BBB-opening, van onder naar boven. De foto is genomen binnen 2 minuten na de laatste BBB opening. Schaalbalk is 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Figuur 8: Detectie van DREADD-expressie.  a) Immunokleuring voor de fluorofoor die aan DREADD's is bevestigd, in dit geval was mCherry in sommige onderzoeken een betrouwbare detectiemethode. b) In een ander representatief gedeelte met DREADD's gericht op de hippocampus onder dezelfde omstandigheden als onder a), produceerde de fluorescentie van mCherry op zichzelf een sterke achtergrond en een relatief zwak signaal. c) Als negatieve controle werd een muis gebruikt die een systemische injectie met AAV kreeg, maar geen FUS-BBBO onderging. Er kan geen significante expressie worden gevonden door mCherry immunostaining. Schaalstaven zijn 500 mm. (Gegevens in a, c aangepast van7 met machtigingen, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Dit protocol beschrijft stappen die nodig zijn voor de genafgifte door middel van gerichte ultrasone bloed-hersenbarrière (BBB) opening, evaluatie van de resulterende genexpressie en meting van neuromodulatie-activiteit van chemogenetische receptoren door middel van histologische tests.

Gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening voor het richten op hersenstructuren en het evalueren van chemogenetische neuromodulatie

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Een benchtop benadering van de locatie specifieke bloed hersenbarrière opening met behulp van gerichte echografie in een rat model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Gerichte neuronale letsel voor de niet-invasieve ontkoppeling van brain circuit

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Levering van antilichamen in de hersenen met behulp van gerichte scanning echografie

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...