Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Cette recherche a été financée par la Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Plusieurs composants imprimés en 3D ont été conçus à l’origine par Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, France). L’auteur remercie John Heath (Caltech) et Margaret Swift (Caltech) pour leur aide technique dans la préparation du manuscrit.

Pas de conflit d’intérêts.

L’ATAC nécessite la mise en œuvre réussie de plusieurs techniques de neuromodulation réussie de circuits neuronaux spécifiques, y compris le ciblage précis guidé par IRM, le FUS-BBBO et l’évaluation histologique de l’expression des gènes. Des composants imprimables en 3D ont été développés pour simplifier le ciblage de petites structures cérébrales avec le FUS-BBBO guidé par l’imagerie.
L’administration d’ultrasons focalisés guidés par IRM (MRIgFUS) pose un certain nombre de défis. Tout d’abord, la bobine d’IRM typique a un espace limité qui est conçu pour accueillir uniquement un échantillon et non le matériel d’échographie. Les alésages plus importants des IRM augmentent le coût de l’équipement et diminuent la qualité de l’image, car le signal est lié au facteur de remplissage d’une bobine32. Par conséquent, tout matériel FUS placé au-dessus d’une image animale en IRM compromettra la qualité de l’imagerie. Deuxièmement, la conception d’appareils compatibles avec l’IRM est difficile et coûteuse. Les matériaux compatibles avec l’IRM doivent être diamagnétiques, avoir une faible propension à créer des courants de Foucault lors de l’irradiation par radiofréquence et avoir une faible susceptibilité magnétique aux champs magnétiques élevés. Dans tout matériau conducteur, la création de courants de Foucault ou sa susceptibilité magnétique affectera également négativement la qualité de l’image. Enfin, les matériaux disponibles compatibles avec l’IRM ont des modules de Young et une durabilité inférieurs à ceux des métaux généralement utilisés dans la production de machines de ciblage précis, par exemple les cadres stéréotaxiques. Les moteurs utilisés pour les réglages de position doivent être compatibles avec l’IRM et placés à l’extérieur de l’alésage de l’IRM en raison de leur taille. Ces moteurs doivent être connectés à distance au transducteur à l’intérieur d’un alésage IRM à l’aide de matériaux compatibles IRM. Les problèmes de déformation plastique, le manque d’espace suffisant à l’intérieur de l’alésage pour mettre en œuvre des composants de taille robuste et le manque d’espace pour changer les positions de ciblage dans l’ensemble du cerveau ont affecté la précision du ciblage dans les travaux précédents.
Pour résoudre ces problèmes, il a été décidé d’effectuer une imagerie par IRM et une administration de FUS-BBBO en dehors du scanner. Pour permettre le guidage par IRM, les souris ont été placées à l’intérieur d’une contention imprimée en 3D qui avait un guide de ciblage visible par IRM qui pouvait être utilisé pour localiser les structures cérébrales de la souris à la fois dans l’IRM et dans l’espace des coordonnées de la stéréotaxe. Étant donné que le crâne de la souris et le guide de visée sont solidement fixés aux supports de la barre d’oreille (Figure 1a,b), un guide de ciblage peut être utilisé pour corréler les coordonnées spatiales dans l’image IRM et mettre à zéro les instruments stéréotaxiques. Le dispositif de retenue n’a pas de pièces mobiles et ne contient pas de transducteur, ce qui nous a permis de le rendre à la fois robuste et suffisamment petit pour tenir à l’intérieur d’une IRM et d’éliminer les interférences de signal de l’électronique du transducteur. L’espace à l’intérieur du guide de ciblage a été creusé car le support imprimé en 3D de certains matériaux est visible à l’IRM (Figure 1c). Des trous dans l’assemblage ont été introduits pour permettre l’étalonnage de la stéréotaxe (figure 3). Le transducteur à ultrasons a été fixé à un porte-électrode d’une stéréotaxe, et le ciblage a été effectué comme décrit à la section 4 (figure 1d). Le transducteur doit être soutenu sur toute sa longueur par un boîtier de barres auriculaires, empêchant toute déviation par rapport au plan de niveau. Le ciblage dans la direction dorso-ventrale peut être réalisé à l’aide de déphasages dans un réseau annulaire.
La précision pratique du ciblage est déterminée par la focalisation des ultrasons et l’atténuation du crâne. La procédure FUS-BBBO a été décrite en détail pour les rats 11 et a été mise en œuvre chez un certain nombre d’autres organismes modèles23,33,34 et chez l’homme 16,17. La relation entre la taille de la mise au point des ultrasons est inversement proportionnelle à la fréquence, où des fréquences plus élevées peuvent entraîner une diffusion plus précise. Cependant, l’atténuation du crâne augmente avec les fréquences35, ce qui peut entraîner un échauffement du crâne et des lésions des zones corticales. La stratégie de ciblage exacte dépendra du site du cerveau. Les sites où une demi-pression maximale sur toute la largeur s’insère dans le tissu cérébral permettent une ouverture prévisible et sûre de la BHE dans de nombreuses structures cérébrales telles que le striatum, le mésencéphale et l’hippocampe. Les régions proches de la base du cerveau posent un défi spécifique chez la souris. Le cerveau de la souris mesure environ 8 à 10 mm dans la direction dorso-ventrale, ce qui est comparable à la taille maximale de la moitié de la largeur de nombreux transducteurs disponibles dans le commerce. Par conséquent, le ciblage au bas du crâne peut entraîner la réflexion des ultrasons par les os et l’air présent dans les conduits auditifs, la bouche ou la trachée, ce qui peut entraîner des modèles imprévisibles de hautes et de basses pressions36. Certaines de ces pressions peuvent franchir un seuil de cavitation inertielle dont il a été démontré qu’il provoque des saignements et des lésions tissulaires37. Pour cibler les régions situées près de la base du crâne, il peut être préférable d’utiliser l’ATAC7 intersectionnel, où la génétique intersectionnelle38 est utilisée pour restreindre l’expression des gènes à une zone plus petite que celle ciblée par le faisceau FUS. Dans l’exemple publié de l’ATAC intersectionnel, un animal transgénique exprimant une enzyme d’édition de gènes (Cre38) dans des cellules dopaminergiques a été ciblé par ultrasons dans la sous-section de la région contenant des cellules dopaminergiques. Enfin, les régions corticales peuvent être ciblées par FUS, mais la diffraction et la réflexion des ultrasons peuvent se produire, ce qui entraîne des profils de pression inégaux. Ce protocole ne couvre pas le ciblage des régions corticales car il sera fortement dépendant de l’espèce utilisée ; cependant, un certain ciblage du cortex au-dessus de l’hippocampe 7 (p. ex., Figure 7) a été observé, ce qui indique qu’au moins chez la souris, c’est possible.
Le choix d’un activateur chimiogénétique et le dosage dépendront des besoins expérimentaux spécifiques. Un certain nombre d’études, y compris l’une des études des auteurs7, n’ont montré aucune réponse non spécifique significative39,40, tandis que des doses plus élevées (par exemple, 10 mg / kg) peuvent produire des effets secondaires, au moins dans certains cas41. Cependant, comme pour toutes les expériences comportementales, des contrôles appropriés31 sont essentiels en raison de l’activité non ciblée potentielle du CNO et de ses métabolites42. Ces contrôles pourraient inclure l’administration de CNO et de contrôles salins à des animaux exprimant des DREADDs et l’administration de CNO à des animaux de type sauvage ou, dans certains cas spécifiques, une comparaison des sites ipsi et controlatéraux du cerveau qui expriment respectivement et n’expriment pas les récepteurs chimiogénétiques. De plus, des recherches récentes ont révélé un certain nombre de nouveaux agonistes de DREADD avec une spécificité améliorée28,29,43. D’autres récepteurs chimiogénétiques 5,25,44 peuvent également être utilisés en conjonction avec la procédure ATAC.
L’évaluation histologique de l’expression des gènes est nécessaire post-mortem pour chaque animal. Une petite fraction d’animaux présentent une faible expression génique à la suite de FUS-BBBO7. De plus, il est nécessaire de montrer la précision spatiale et la spécificité de l’expression des gènes, car un mauvais ciblage est possible. Il convient de noter que certains AAV peuvent présenter une capacité de traçage rétrograde ou antérograde45 et peuvent provoquer une transfection loin du site ciblé par l’échographie malgré un ciblage précis par ultrasons. Si le récepteur chimiogénétique exprimé est fusionné ou co-exprime un fluorophore, l’imagerie du fluorophore dans des coupes de tissu peut être suffisante pour évaluer la localisation et l’intensité de l’expression. Cependant, de nombreuses protéines fluorescentes sont endommagées par le processus de fixation tissulaire, et l’immunomarquage de la protéine mCherry qui est fréquemment utilisée avec les DREADDs a donné un meilleur signal dans des études antérieures7. Enfin, en raison de la densité de neurones dans certaines parties du cerveau (par exemple, la couche cellulaire granulaire de l’hippocampe), l’utilisation de fluorophores localisés dans le sens nucléaire exprimés sous IRES, par opposition aux fusions, pour effectuer des comptages cellulaires peut être bénéfique puisque les noyaux peuvent être facilement segmentés et contre-colorés avec des colorants nucléaires, tels que DAPI ou TO-PRO-3. Pour évaluer la neuromodulation par coloration c-Fos, il est impératif d’effectuer une contre-coloration nucléaire et de compter les noyaux positifs c-Fos, plutôt que tout signal de fluorescence. Dans certains cas, les débris cellulaires peuvent présenter une fluorescence et fausser les mesures des cellules positives.
Les limites de l’administration de médicaments et de gènes avec FUS-BBBO comprennent une résolution inférieure à celle de l’administration avec des injections intracrâniennes invasives et la nécessité de plus grandes quantités de médicaments injectés ou de vecteurs viraux. De plus, alors qu’une injection directe dans le cerveau entraîne une administration exclusive à un site d’injection, FUS-BBBO utilise une voie intraveineuse permettant une administration possible aux tissus périphériques. Les limites de l’utilisation de la chimiogénétique pour la neuromodulation comprennent une échelle de temps lente, qui peut être inadéquate pour certains protocoles comportementaux qui nécessitent des changements rapides dans l’intensité de la neuromodulation.

L’utilisation de technologies de neuromodulation spécifiques aux circuits, telles que l’optogénétique1,2 et la chimiogénétique 3,4,5, a fait progresser notre compréhension des troubles psychiatriques en tant que troubles des circuits neuronaux. Les circuits neuronaux sont difficiles à étudier et encore plus difficiles à contrôler dans le traitement des troubles cérébraux, car ils sont généralement définis par des types de cellules, des régions cérébrales, des voies de signalisation moléculaire et le moment de l’activation. Idéalement, tant pour la recherche que pour les applications cliniques, un tel contrôle devrait être exercé de manière non invasive, mais il est difficile d’obtenir une neuromodulation à la fois précise et non invasive. Par exemple, bien que les médicaments neuroactifs puissent atteindre le cerveau de manière non invasive, ils manquent de spécificité spatiale en agissant dans tout le cerveau. D’autre part, la stimulation électrique cérébrale profonde peut contrôler des régions cérébrales spécifiques, mais a du mal à contrôler des types de cellules spécifiques et nécessite une intervention chirurgicale et la mise en place d’un dispositif6.
La chimiogénétique ciblée acoustiquement7 (ATAC) fournit une neuromodulation avec une spécificité spatiale, de type cellulaire et temporelle. Il combine trois techniques : l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique induite par ultrasons focalisés (FUS-BBBO) pour le ciblage spatial, l’utilisation de vecteurs viraux adéno-associés (AAV) pour délivrer de manière non invasive des gènes sous le contrôle de promoteurs spécifiques à un type de cellule, et l’ingénierie de récepteurs chimiogénétiques pour moduler sélectivement les circuits neuronaux transfectés via l’administration de médicaments. FUS est une technologie approuvée par la FDA qui tire parti de la capacité des ultrasons à se concentrer profondément dans les tissus, y compris le cerveau humain, avec une précision spatiale millimétrique. À haute puissance, le FUS est utilisé pour l’ablation ciblée non invasive, y compris un traitement approuvé par la FDA pour le tremblement essentiel8. FUS-BBBO combine des ultrasons de faible intensité avec des microbulles administrées par voie systémique, qui oscillent dans les vaisseaux sanguins au foyer de l’échographie, ce qui entraîne une ouverture localisée, temporaire (6-24 h) et réversible de la BHE9. Cette ouverture permet l’acheminement des protéines9,10, des petites molécules11 et des vecteurs viraux 7,12,13,14 au cerveau sans dommage tissulaire significatif chez les rongeurs 10 et les primates non humains 15. Des essais cliniques sont en cours pour FUS-BBBO16,17, indiquant des applications thérapeutiques possibles de cette technique.
L’administration de gènes viraux à l’aide de l’AAV progresse également rapidement vers une utilisation clinique pour les troubles du SNC, avec les récentes approbations réglementaires de la FDA et de l’UE comme étapes majeures. Enfin, les récepteurs chimiogénétiques18, tels que les récepteurs de conception activés exclusivement par des drogues de synthèse (DREADDs), sont largement utilisés par les neuroscientifiques pour fournir un contrôle pharmacologique de l’excitation neuronale chez les animaux transgéniques ou transfectés 19,20. Les DREADD sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) qui ont été génétiquement modifiés pour répondre à des molécules chimiogénétiques synthétiques plutôt qu’à des ligands endogènes, de sorte que l’administration systémique de ces ligands augmente ou réduit l’excitabilité des neurones exprimant DREADD. Lorsque ces trois technologies sont combinées dans l’ATAC, elles peuvent être utilisées pour la modulation non invasive de circuits neuronaux sélectionnés avec une précision spatiale, de type cellulaire et temporelle.
Ici, nous développons et mettons à jour un protocole précédemment publié pour FUS-BBBO11 en incluant une méthodologie de ciblage précis des régions du cerveau avec FUS-BBBO chez la souris à l’aide d’un simple équipement de ciblage imprimé en 3D. Nous montrons également une application de FUS-BBBO à l’ATAC. Nous montrons les étapes nécessaires à l’administration d’AAV porteurs de récepteurs chimiogénétiques, et l’évaluation de l’expression génique et de la neuromodulation par histologie. Cette technique est particulièrement applicable pour cibler de grandes ou plusieurs régions du cerveau pour l’expression génique ou la neuromodulation. Par exemple, une large zone d’un cortex peut être facilement transduite avec FUS-BBBO et modulée à l’aide de la chimiogénétique. Cependant, l’administration de gènes avec une technique alternative, les injections intracrâniennes, nécessiterait un grand nombre d’injections invasives et de craniotomies. FUS-BBBO et son application, ATAC, peuvent être mis à l’échelle d’animaux de différentes tailles, où les régions du cerveau sont plus grandes et plus difficiles à cibler de manière invasive.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

La chimiogénétique ciblée acoustiquement (ATAC) permet le contrôle non invasif de circuits neuronaux spécifiques. L’ATAC permet d’obtenir un tel contrôle grâce à une combinaison d’ouverture de la barrière hémato-encéphalique induite par les ultrasons focalisés (FUS-BBBO), d’administration de gènes avec des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) et d’activation de la signalisation cellulaire avec des récepteurs protéiques modifiés et chimiogénétiques et leurs ligands apparentés. Avec l’ATAC, il est possible de transduire à la fois de grandes et de petites régions du cerveau avec une précision millimétrique à l’aide d’une seule application d’ultrasons non invasive. Cette transduction peut permettre plus tard une neuromodulation à long terme, non invasive et sans dispositif chez les animaux se déplaçant librement à l’aide d’un médicament. Étant donné que le FUS-BBBO, les AAV et la chimiogénétique ont été utilisés chez de nombreux animaux, l’ATAC devrait également être évolutif pour une utilisation chez d’autres espèces animales. Cet article développe un protocole publié précédemment et décrit comment optimiser l’administration de gènes avec FUS-BBBO dans de petites régions du cerveau avec un guidage IRM, mais sans avoir besoin d’un dispositif FUS compliqué compatible avec l’IRM. Le protocole décrit également la conception de composants de ciblage et de contention de souris qui peuvent être imprimés en 3D par n’importe quel laboratoire et peuvent être facilement modifiés pour différentes espèces ou équipements personnalisés. Pour faciliter la reproductibilité, le protocole décrit en détail comment les microbulles, les AAV et la ponction veineuse ont été utilisés dans le développement de l’ATAC. Enfin, un exemple de données est présenté pour guider les investigations préliminaires des études utilisant l’ATAC.

La première étape de l’exécution du protocole ATAC est le ciblage du FUS-BBBO sur les régions cérébrales souhaitées. Par exemple, en suivant le protocole décrit, l’hippocampe a été ciblé avec du FUS-BBBO, et un agent de contraste et de l’AAV9 porteurs de DREADD ont été injectés aux souris, suivis d’une séquence d’IRM FLASH 3D qui acquiert des images du cerveau de la souris. Une augmentation du signal T1 a été obtenue dans la région de l’hippocampe (Figure 6) et dans d’autres parties du cerveau (Figure 7). Après plusieurs semaines, les DREADDs ont été exprimés à l’intérieur de la région cérébrale cible. Alors que de nombreux DREADD sont fusionnés à un rapporteur fluorescent (par exemple mCherry), le processus de perfusion et de fixation avec le formaldéhyde s’est avéré réduire considérablement la fluorescence de ces protéines. L’immunomarquage contre mCherry ou le DREADD a conduit à une détection plus fiable de l’expression (Figure 8) sur la base de l’expérience antérieure. Dans des expériences précédentes, ~85% des souris ont montré une expression après FUS-BBBO7. Un test simple pour des niveaux d’expression suffisants des DREADDs consiste à tester leur fonctionnalité au niveau cellulaire. Cela peut se faire, par exemple, en fournissant un ligand chimiogénétique ou un contrôle salin, tel que le CNO19, la deschloroclozapine 28, ou d’autres29, et en attendant 2 heures avant une perfusion et une fixation cardiaques. Les coupes cérébrales ont ensuite été co-immunocolorées pour la protéine c-Fos30, qui indique une activité accrue des neurones, et pour DREADD. L’expérience a été considérée comme réussie si le site du cerveau ciblé par les DREADDs présentait un nombre significativement plus élevé de noyaux neuronaux c-Fos positifs dans le groupe qui a reçu un ligand chimiogénétique par rapport au groupe qui a reçu une solution saline7 ou par rapport à un site controlatéral qui n’a pas été soumis à FUS-BBBO. Il convient de noter qu’il existe un potentiel pour certains de ces ligands d’activer les neurones de manière non spécifique sans expression de DREADDs. Par exemple, il a été démontré que le CNO est métabolisé en faibles niveaux de clozapine chez la souris, qui traverse la BHE et active les DREADDs avec une puissance élevée27. Cependant, il a également été démontré qu’il se lie à des emplacements non spécifiques. Comme dans toute expérience, il est essentiel d’inclure tous les contrôles appropriés dans les études chimiogénétiques31. Un contrôle possible est l’administration du ligand chimiogénétique à des souris de type sauvage, sans procédures, afin d’exclure les effets du médicament seul sur le test comportemental ou histologique souhaité. Un autre contrôle pourrait être l’inclusion de quatre groupes : DREADD + ligand, DREADD + véhicule, EGFP + ligand, EGFP + véhicule, ce qui expliquera les effets potentiels de l’administration du gène avec FUS-BBBO et du ligand chimiogénétique.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figure 1 : Processus de ciblage de FUS guidé par IRM dans l’ATAC. a) Placement de la souris avec des barres auriculaires, un cône nasal et une plate-forme pouvant être insérée à l’intérieur d’un scanner IRM. b) Un guide imprimé en 3D (bleu) visible à l’IRM a été fixé aux extrémités du cadre de la barre auriculaire, puis fixé en place à l’aide d’un support d’une bobine d’IRM de surface contenant quatre boulons encliquetables (bleu semi-transparent). (c) Apparition du guide imprimé en 3D en IRM sagittale (panneau de gauche), avec un bas de la représentation virtuelle d’un transducteur aligné (demi-cercle jaune) avec le bas du guide. Le panneau de droite montre l’apparence du guide imprimé en 3D sur l’IRM à partir d’une vue coronale. Le cercle lumineux a été constitué d’un matériau de support polyjet qui présente un fort contraste IRM. La croix a été formée avec du plastique. Un cercle jaune représente l’emplacement du transducteur qui a été aligné concentriquement avec le guide à l’intérieur d’un cadre stéréotaxique. (d) Pour cibler les structures cérébrales, un transducteur virtuel a été déplacé dans la direction z au-dessus des souris pour correspondre à l’épaisseur d’un cône / boîtier d’ultrasons. Dans ce cas, en raison de l’épaisseur du bain-marie, le transducteur a été déplacé de 8,2 mm au-dessus du guide pour un ciblage précis. Les structures cérébrales ont été sélectionnées à l’aide de données d’imagerie IRM, puis leurs coordonnées IRM ont été écrites et entrées dans l’appareil stéréotaxique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figure 2 : Interface du logiciel utilisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figure 3 : Processus d’appariement de l’espace de coordonnées de l’IRM à l’instrument stéréotaxique. a) Trois trous à l’intérieur d’un support de transducteur ont été alignés avec trois trous à l’intérieur du guide d’IRM, et trois boulons de ciblage coniques ont été insérés sans provoquer de flexion de l’ensemble de l’ensemble. (b) Idéalement, les trois boulons devraient se trouver au centre des trous. c) S’il y a une imprécision dans l’alignement, les trois boulons ne s’insèrent pas, par exemple, dans le cas d’un petit lacet probablement imperceptible de 1°, un seul boulon s’insère alors que les boulons opposés sont coincés au niveau du guide IRM. Alternativement, il pourrait y avoir une flexion visible de l’ensemble de l’assemblage lorsque les boulons ont été forcés. d) Vue agrandie de l’assemblage des boulons. Les boulons doivent être placés de manière concentrique pour une meilleure précision. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figure 4 : Redistribution rapide des microbulles à l’intérieur de la seringue. a) La seringue a été photographiée 5 s après le mélange. b) Une minute plus tard, une couche clairement visible montrait une partie du concentré de bulles près du sommet d’une seringue à tuberculine de 1 mL. Cet exemple, en particulier, utilisait une solution de microbulles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figure 5 : Processus de placement du centre d’un transducteur sur le centre d’un guide IRM. (a) Dans les modèles présentés dans le présent document, le support rouge a été conçu pour se déplacer de 10,56 mm vers l’avant de la position indiquée à la figure 3b à celle illustrée ici. b) Le guide bleu d’IRM a été retiré avant la sonication et un gel à ultrasons a été appliqué entre la souris et le transducteur (orange) pour assurer le passage des ultrasons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figure 6 : Visualisation par IRM de l’ouverture de la BHE. a) Vue axiale de l’ouverture de la BHE. La zone plus claire désignée par une pointe de flèche montre l’extravasation d’un agent de contraste IRM T1 . (b) Vue coronale de l’hippocampe dorsal et du cortex au-dessus de l’hippocampe ciblés par FUS-BBBO (pointes de flèche). (c) Vue coronale de l’hippocampe central ciblé par FUS-BBBO (pointes de flèches). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figure 7 : Exemple de ciblage de 4 sites cérébraux à l’aide du système de ciblage à trois boulons décrit dans cet article. Les zones avec des pointes de flèches ont montré des sites ouverts de la BHE avec diffusion d’un agent de contraste IRM. Les quatre sites ont été ciblés successivement, avec ~150 s entre chaque ouverture de la BBB, de bas en haut. L’image a été prise dans les 2 minutes qui ont suivi la dernière ouverture de la BBB. La barre d’échelle est de 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Figure 8 : Détection de l’expression DREADD.  (a) L’immunomarquage du fluorophore attaché aux DREADDs, dans ce cas, mCherry était une méthode de détection fiable dans certaines études. (b) Dans une autre section représentative avec des DREADDs ciblant l’hippocampe en utilisant les mêmes conditions que dans (a), la fluorescence de mCherry en elle-même a produit un fort bruit de fond et un signal relativement faible. (c) Comme témoin négatif, une souris qui a reçu une injection systémique d’AAV, mais qui n’a pas subi de FUS-BBBO, a été utilisée. Aucune expression significative n’a pu être trouvée par l’immunomarquage mCherry. Les barres d’échelle sont de 500 mm. (Données en a, c adaptées de7 avec autorisations, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à l’administration du gène par l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par ultrasons focalisés, l’évaluation de l’expression génique résultante et la mesure de l’activité de neuromodulation des récepteurs chimiogénétiques par des tests histologiques.

Ouverture de la barrière hémato-encéphalique induite par ultrasons focalisés pour cibler les structures cérébrales et évaluer la neuromodulation chimiogénétique

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

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JoVE Journal

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