Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Diese Forschung wurde von der Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award, unterstützt. Mehrere 3D-gedruckte Komponenten wurden ursprünglich von Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankreich) entworfen. Der Autor bedankt sich bei John Heath (Caltech) und Margaret Swift (Caltech) für die technische Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts.

Kein Interessenkonflikt.

ATAC erfordert die erfolgreiche Implementierung mehrerer Techniken für die erfolgreiche Neuromodulation spezifischer neuronaler Schaltkreise, einschließlich präziser MRT-gesteuerter Zielgruppenansprache, FUS-BBBO und histologischer Bewertung der Genexpression. 3D-druckbare Komponenten wurden entwickelt, um das Targeting kleiner Gehirnstrukturen mit bildgebendem FUS-BBBO zu vereinfachen.
Die MRT-gesteuerte Verabreichung von fokussiertem Ultraschall (MRIgFUS) bringt eine Reihe von Herausforderungen mit sich. Erstens hat eine typische MRT-Spule nur begrenzten Platz, der nur für die Aufnahme einer Probe und nicht für die Ultraschall-Hardware ausgelegt ist. Die größeren Bohrungen von MRTs erhöhen die Kosten der Ausrüstung und verringern die Bildqualität, da das Signal mit dem Füllfaktor einer Spule32 zusammenhängt. Folglich beeinträchtigt jede FUS-Hardware, die im MRT auf einem Tierbild platziert wird, die Bildqualität. Zweitens ist die Entwicklung von MRT-kompatiblen Geräten schwierig und teuer. MRT-kompatible Materialien müssen diamagnetisch sein, eine geringe Neigung zur Erzeugung von Wirbelströmen während der Hochfrequenzbefeldung aufweisen und eine geringe magnetische Suszeptibilität bei hohen Magnetfeldern aufweisen. In jedem leitfähigen Material wirkt sich die Erzeugung von Wirbelströmen oder seine magnetische Suszeptibilität ebenfalls negativ auf die Bildqualität aus. Schließlich haben die verfügbaren MRT-kompatiblen Materialien einen niedrigeren Elastizitätsmodul und eine geringere Haltbarkeit als die Metalle, die typischerweise bei der Herstellung von präzisen Zielmaschinen verwendet werden, z. B. stereotaktische Rahmen. Die Motoren, die für die Positionsanpassung verwendet werden, müssen aufgrund ihrer Größe MRT-kompatibel sein und außerhalb der MRT-Bohrung platziert werden. Diese Motoren müssen mit MRT-kompatiblen Materialien in einiger Entfernung mit dem Schallkopf in einer MRT-Bohrung verbunden werden. Probleme mit dem Verziehen von Kunststoffen, der Mangel an ausreichendem Platz in der Bohrung, um Komponenten mit robuster Größe zu implementieren, und unzureichender Platz für wechselnde Zielpositionen im gesamten Gehirn haben die Zielgenauigkeit in früheren Arbeiten beeinträchtigt.
Um diese Probleme zu lösen, wurde die Entscheidung getroffen, die Bildgebung in der MRT und die FUS-BBBO-Verabreichung außerhalb des Scanners durchzuführen. Um eine MRT-Kontrolle zu ermöglichen, wurden die Mäuse in eine 3D-gedruckte Fessel gelegt, die über eine MRT-sichtbare Zielführung verfügte, mit der die Gehirnstrukturen der Maus sowohl im MRT als auch im stereotaxen Koordinatenraum lokalisiert werden konnten. Da sowohl der Mäuseschädel als auch die Zielführung fest mit den Ohrstangenhaltern verbunden sind (Abbildung 1a,b), kann eine Zielführung verwendet werden, um räumliche Koordinaten im MRT-Bild zu korrelieren und die stereotaktischen Instrumente auf Null zu stellen. Die Halterung hat keine beweglichen Teile und enthält keinen Wandler, was es uns ermöglichte, sie sowohl robust als auch klein genug zu machen, um in ein MRT zu passen, und Signalstörungen von der Elektronik des Wandlers zu entfernen. Der Raum im Inneren der Zielschablone wurde ausgehöhlt, da die 3D-gedruckte Stütze für einige Materialien im MRT sichtbar ist (Abbildung 1c). Es wurden Löcher in die Baugruppe eingebracht, um eine Stereotax-Kalibrierung zu ermöglichen (Abbildung 3). Der Ultraschallwandler wurde an einem Elektrodenhalter einer Stereotaxe befestigt, und das Targeting wurde wie in Abschnitt 4 beschrieben (Abbildung 1d) durchgeführt. Der Schallkopf sollte über seine gesamte Länge durch ein Gehäuse von Ohrbügeln gestützt werden, um eine Abweichung von der waagerechten Ebene zu vermeiden. Das Targeting in dorso-ventraler Richtung kann durch Phasenverschiebungen in einem ringförmigen Array erreicht werden.
Die praktische Zielgenauigkeit wird durch Ultraschallfokussierung und Schädeldämpfung bestimmt. Das FUS-BBBO-Verfahren wurde für Ratten 11 detailliert beschrieben und in einer Reihe anderer Modellorganismen23,33,34 und beim Menschen 16,17 implementiert. Das Verhältnis zwischen der Größe des Ultraschallfokus ist umgekehrt proportional zur Frequenz, wobei höhere Frequenzen zu einer präziseren Abgabe führen können. Die Dämpfung des Schädels nimmt jedoch mit Frequenzen35 zu, was zu einer Schädelerwärmung und einer Schädigung der kortikalen Bereiche führen kann. Die genaue Targeting-Strategie hängt von der Gehirnstelle ab. Die Stellen, an denen ein halber Maximaldruck in voller Breite in das Hirngewebe passt, ermöglichen eine vorhersagbare und sichere BHS-Öffnung in vielen Gehirnstrukturen wie dem Striatum, dem Mittelhirn und dem Hippocampus. Regionen in der Nähe der Basis des Gehirns stellen bei Mäusen eine besondere Herausforderung dar. Das Mäusegehirn misst ca. 8-10 mm in dorso-ventraler Richtung, was vergleichbar ist mit der halben Maximalgröße vieler kommerziell erhältlicher Schallköpfe in voller Breite. Folglich kann das Zielen auf die Unterseite des Schädels zu einer Ultraschallreflexion von den Knochen und der Luft in den Gehörgängen, dem Mund oder der Luftröhre führen, was zu unvorhersehbaren Mustern von hohem und niedrigem Druck führen kann36. Einige dieser Drücke können eine Trägheitskavitationsschwelle überschreiten, die nachweislich Blutungen und Gewebeschäden verursacht37. Um Regionen anzuvisieren, die sich in der Nähe der Schädelbasis befinden, kann es bevorzugt sein, intersektionale ATAC7 zu verwenden, wobei intersektionale Genetik38 verwendet wird, um die Genexpression auf einen kleineren Bereich zu beschränken als den, der mit dem FUS-Strahl anvisiert wird. In dem veröffentlichten Beispiel eines intersektionalen ATAC wurde ein transgenes Tier, das ein Gen-Editing-Enzym (Cre38) in dopaminergen Zellen exprimiert, mit Ultraschall in der Untersektion der Region mit dopaminergen Zellen anvisiert. Schließlich können die kortikalen Regionen mit FUS angegriffen werden, aber die Beugung und Reflexion von Ultraschall kann zu ungleichmäßigen Druckprofilen führen. Dieses Protokoll deckt nicht die Ausrichtung auf kortikale Regionen ab, da dies stark von der verwendeten Art abhängt. Es wurde jedoch ein gewisses Targeting des Kortex oberhalb des Hippocampus 7 beobachtet (z. B. Abbildung 7), was darauf hindeutet, dass dies zumindest bei Mäusen möglich ist.
Die Wahl eines chemogenetischen Aktivators und die Dosierung hängen von den spezifischen experimentellen Anforderungen ab. Eine Reihe von Studien, darunter eine der Studien der Autoren7, zeigten kein signifikantes unspezifisches Ansprechen39,40, während höhere Dosen (z. B. 10 mg/kg) zumindest in einigen Fällen Nebenwirkungen hervorrufen können41. Wie bei allen Verhaltensexperimenten sind jedoch geeignete Kontrollen31 aufgrund einer möglichen Off-Target-Aktivität von CNO und seinen Metaboliten42 unerlässlich. Solche Kontrollen könnten die Verabreichung von CNO und Kochsalzkontrollen an Tiere, die DREADDs exprimieren, und die Verabreichung von CNO an Wildtyp-Tiere oder in einigen spezifischen Fällen einen Vergleich von ipsi- und kontralateralen Stellen des Gehirns umfassen, die chemogenetische Rezeptoren exprimieren bzw. nicht. Darüber hinaus ergaben neuere Forschungen eine Reihe neuer DREADD-Agonisten mit verbesserter Spezifität28,29,43. Andere chemogenetische Rezeptoren 5,25,44 können auch in Verbindung mit dem ATAC-Verfahren verwendet werden.
Die histologische Beurteilung der Genexpression ist für jedes Tier post mortem notwendig. Ein kleiner Teil der Tiere zeigt eine schlechte Genexpression nach FUS-BBBO7. Darüber hinaus ist es notwendig, die räumliche Genauigkeit und Spezifität der Genexpression zu zeigen, da ein falsches Targeting möglich ist. Bemerkenswert ist, dass einige AAVs eine retrograde oder anterograde Tracing-Fähigkeit aufweisen können45 und trotz genauer Ultraschall-Targeting eine Transfektion weit entfernt von der mit Ultraschall anvisierten Stelle verursachen können. Wenn der exprimierte chemogenetische Rezeptor mit einem Fluorophor fusioniert ist oder ein Fluorophor mitexprimiert, kann die Bildgebung des Fluorophors in Gewebeschnitten ausreichen, um die Lokalisation und Intensität der Expression zu beurteilen. Viele fluoreszierende Proteine werden jedoch durch den Gewebefixierungsprozess geschädigt, und die Immunfärbung für das mCherry-Protein, das häufig mit DREADDs verwendet wird, lieferte in früheren Studien ein besseres Signal7. Schließlich kann aufgrund der Dichte von Neuronen in bestimmten Teilen des Gehirns (z. B. körnige Zellschicht im Hippocampus) die Verwendung von nudeutlich lokalisierten Fluorophoren, die unter IRES exprimiert werden, im Gegensatz zu Fusionen zur Durchführung von Zellzählungen von Vorteil sein, da Kerne leicht segmentiert und mit Kernfärbungen wie DAPI oder TO-PRO-3 gegengefärbt werden können. Um die Neuromodulation durch c-Fos-Färbung zu bewerten, ist es unerlässlich, eine nukleäre Gegenfärbung durchzuführen und c-Fos-positive Kerne anstelle eines Fluoreszenzsignals zu zählen. In einigen Fällen können Zelltrümmer Fluoreszenz zeigen und die Messungen positiver Zellen verfälschen.
Zu den Einschränkungen der Arzneimittel- und Genverabreichung mit FUS-BBBO gehören eine geringere Auflösung als bei invasiven intrakraniellen Injektionen und die Notwendigkeit größerer Mengen injizierter Medikamente oder viraler Vektoren. Während eine direkte Injektion in das Gehirn zu einer ausschließlichen Verabreichung an eine injizierte Stelle führt, verwendet FUS-BBBO einen intravenösen Weg, der zu einer möglichen Verabreichung an periphere Gewebe führt. Zu den Einschränkungen der Verwendung der Chemogenetik für die Neuromodulation gehört eine langsame Zeitskala, die für einige Verhaltensprotokolle, die schnelle Änderungen der Intensität der Neuromodulation erfordern, unzureichend sein kann.

Der Einsatz von schaltkreisspezifischen Neuromodulationstechnologien wie Optogenetik 1,2 und Chemogenetik 3,4,5 hat unser Verständnis von psychiatrischen Erkrankungen als neuronale Schaltkreisstörungen erweitert. Neuronale Schaltkreise sind bei der Behandlung von Hirnerkrankungen schwer zu untersuchen und noch schwieriger zu kontrollieren, da sie typischerweise durch bestimmte Zelltypen, Hirnregionen, molekulare Signalwege und den Zeitpunkt der Aktivierung definiert werden. Im Idealfall würde eine solche Kontrolle sowohl für die Forschung als auch für klinische Anwendungen nicht-invasiv durchgeführt, aber es ist eine Herausforderung, sowohl eine präzise als auch eine nicht-invasive Neuromodulation zu erreichen. Während beispielsweise neuroaktive Medikamente das Gehirn nicht-invasiv erreichen können, fehlt es ihnen an räumlicher Spezifität, indem sie im gesamten Gehirn wirken. Auf der anderen Seite kann die elektrische Tiefenhirnstimulation bestimmte Hirnregionen kontrollieren, hat jedoch Schwierigkeiten, bestimmte Zelltypen zu kontrollieren und erfordert eine Operation und die Platzierung eines Geräts6.
Acoustically Targeted Chemogenetics7 (ATAC) bietet Neuromodulation mit räumlicher, zelltypischer und zeitlicher Spezifität. Es kombiniert drei Techniken: fokussierte ultraschallinduzierte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (FUS-BBBO) für räumliches Targeting, Verwendung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren (AAVs) zur nicht-invasiven Verabreichung von Genen unter der Kontrolle von zelltypspezifischen Promotoren und modifizierte chemogenetische Rezeptoren, um transfizierte neuronale Schaltkreise selektiv durch Medikamentenverabreichung zu modulieren. FUS ist eine von der FDA zugelassene Technologie, die sich die Fähigkeit von Ultraschall zunutze macht, mit räumlicher Präzision im Millimeterbereich, tief in Gewebe, einschließlich des menschlichen Gehirns, zu fokussieren. Bei hoher Leistung wird FUS für die nicht-invasive gezielte Ablation verwendet, einschließlich einer von der FDA zugelassenen Behandlung des essentiellen Tremors8. FUS-BBBO kombiniert Ultraschall niedriger Intensität mit systemisch verabreichten Mikrobläschen, die in den Blutgefäßen am Ultraschallfokus oszillieren, was zu einer lokalisierten, vorübergehenden (6-24 h) und reversiblen Öffnung der BHS9 führt. Diese Öffnung ermöglicht die Abgabe von Proteinen9,10, kleinen Molekülen 11 und viralen Vektoren7,12,13,14 an das Gehirn ohne signifikante Gewebeschäden bei Nagetieren 10 und nichtmenschlichen Primaten 15. Klinische Studien für FUS-BBBO16,17 sind im Gange, was auf mögliche therapeutische Anwendungen dieser Technik hinweist.
Die Verabreichung viraler Gene mit AAV schreitet auch schnell in die klinische Anwendung bei ZNS-Erkrankungen vor, wobei die jüngsten behördlichen Zulassungen der FDA und der EU wichtige Meilensteine darstellen. Schließlich werden chemogenetische Rezeptoren18, wie z. B. Designerrezeptoren, die ausschließlich durch Designerdrogen aktiviert werden (DREADDs), von Neurowissenschaftlern häufig verwendet, um eine pharmakologische Kontrolle über die neuronale Erregung bei transgenen oder transfizierten Tieren zu gewährleisten19,20. DREADDs sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die genetisch so verändert wurden, dass sie auf synthetische chemogenetische Moleküle und nicht auf endogene Liganden reagieren, so dass die systemische Verabreichung dieser Liganden die Erregbarkeit von DREADD-exprimierenden Neuronen erhöht oder verringert. Wenn diese drei Technologien in ATAC kombiniert werden, können sie für die nicht-invasive Modulation ausgewählter neuronaler Schaltkreise mit räumlicher, zelltypischer und zeitlicher Präzision verwendet werden.
Hier erweitern und aktualisieren wir ein zuvor veröffentlichtes Protokoll für FUS-BBBO11 , indem wir eine Methodik für das genaue Targeting von Gehirnregionen mit FUS-BBBO bei Mäusen unter Verwendung einfacher 3D-gedruckter Zielgeräte aufnehmen. Wir zeigen auch eine Anwendung von FUS-BBBO auf ATAC. Wir zeigen Schritte, die für die Verabreichung von AAVs mit chemogenetischen Rezeptoren und die Bewertung der Genexpression und Neuromodulation durch Histologie erforderlich sind. Diese Technik ist besonders anwendbar, um große oder mehrere Gehirnregionen für die Genexpression oder Neuromodulation anzuvisieren. Zum Beispiel kann ein großer Bereich einer Großhirnrinde leicht mit FUS-BBBO transduziert und mittels Chemogenetik moduliert werden. Die Genübertragung mit einer alternativen Technik, der intrakraniellen Injektion, würde jedoch eine große Anzahl invasiver Injektionen und Kraniotomien erfordern. FUS-BBBO und seine Anwendung, ATAC, können auf Tiere unterschiedlicher Größe skaliert werden, bei denen die Gehirnregionen größer und schwieriger invasiv zu erreichen sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

Die akustisch zielgerichtete Chemogenetik (ATAC) ermöglicht die nicht-invasive Kontrolle spezifischer neuronaler Schaltkreise. ATAC erreicht eine solche Kontrolle durch eine Kombination aus fokussiertem Ultraschall (FUS) induzierter Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (FUS-BBBO), Genabgabe mit Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren und Aktivierung der zellulären Signalübertragung mit künstlich hergestellten, chemogenetischen Proteinrezeptoren und ihren verwandten Liganden. Mit ATAC ist es möglich, sowohl große als auch kleine Hirnregionen mit einer einzigen nicht-invasiven Ultraschallanwendung millimetergenau zu transduzieren. Diese Transduktion kann später eine langfristige, nicht-invasive, gerätefreie Neuromodulation bei sich frei bewegenden Tieren mit einem Medikament ermöglichen. Da FUS-BBBO, AAVs und Chemogenetik bei mehreren Tieren eingesetzt wurden, sollte ATAC auch für den Einsatz bei anderen Tierarten skalierbar sein. Diese Arbeit erweitert ein zuvor veröffentlichtes Protokoll und skizziert, wie die Genübertragung mit FUS-BBBO in kleine Hirnregionen mit MRT-Kontrolle optimiert werden kann, ohne dass ein kompliziertes MRT-kompatibles FUS-Gerät erforderlich ist. Das Protokoll beschreibt auch das Design von Maus-Targeting- und -Fixierungskomponenten, die von jedem Labor 3D-gedruckt und leicht für verschiedene Spezies oder kundenspezifische Ausrüstung modifiziert werden können. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, beschreibt das Protokoll im Detail, wie die Mikrobläschen, AAVs und Venenpunktion bei der ATAC-Entwicklung verwendet wurden. Abschließend werden Beispieldaten gezeigt, die als Richtschnur für die Voruntersuchungen von Studien mit ATAC dienen sollen.

Der erste Schritt bei der Durchführung des ATAC-Protokolls ist die Ausrichtung des FUS-BBBO auf die gewünschten Gehirnregionen. Zum Beispiel wurde der Hippocampus nach dem beschriebenen Protokoll mit FUS-BBBO angegriffen und Kontrastmittel und AAV9-tragende DREADDs in die Mäuse injiziert, gefolgt von einer FLASH-3D-MRT-Sequenz, die Bilder des Mäusegehirns aufnimmt. Eine T1-Signalverstärkung wurde in der Hippocampusregion (Abbildung 6) und in anderen Teilen des Gehirns (Abbildung 7) erreicht. Nach mehreren Wochen wurden DREADDs in der Zielhirnregion exprimiert. Während viele DREADDs mit einem fluoreszierenden Reporter (z.B. mCherry) fusioniert sind, wurde festgestellt, dass der Prozess der Perfusion und Fixierung mit Formaldehyd die Fluoreszenz dieser Proteine drastisch reduziert. Die Immunfärbung gegen mCherry oder den DREADD führte zu einem zuverlässigeren Nachweis der Expression (Abbildung 8) auf der Grundlage früherer Erfahrungen. In früheren Experimenten zeigten ~85% der Mäuse eine Expression nach FUS-BBBO7. Ein einfacher Test für eine ausreichende Expression von DREADDs ist die Prüfung ihrer Funktionalität auf zellulärer Ebene. Dies kann beispielsweise durch die Bereitstellung eines chemogenetischen Liganden oder einer Kochsalzkontrolle, wie CNO 19, Deschloroclozapin28 oder andere29, und das Warten von 2 Stunden vor einer kardialen Perfusion und Fixierung erfolgen. Die Hirnschnitte wurden dann für c-Fos-Protein30, das auf eine erhöhte Aktivität von Neuronen hinweist, und für DREADD co-immungefärbt. Das Experiment wurde als erfolgreich angesehen, wenn die Stelle des Gehirns, die mit DREADDs angegriffen wurde, in der Gruppe, die einen chemogenetischen Liganden erhielt, im Vergleich zu der Gruppe, die Kochsalzlösung7 erhielt, oder im Vergleich zu einer kontralateralen Stelle, die nicht FUS-BBBO ausgesetzt war, eine signifikant höhere Anzahl von neuronalen Kernen aufwies, die c-Fos-positiv waren. Bemerkenswert ist, dass einige dieser Liganden das Potenzial haben, Neuronen unspezifisch zu aktivieren, ohne DREADDs zu exprimieren. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass CNO bei Mäusen in niedrige Mengen an Clozapin metabolisiert wird, das die BHS überquert und DREADDs mit hoher Potenz aktiviert27. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass es an unspezifischen Stellen bindet. Wie bei jedem Experiment ist es wichtig, alle geeigneten Kontrollen in chemogenetische Studien einzubeziehen31. Eine mögliche Kontrolle ist die Verabreichung des chemogenetischen Liganden an Wildtyp-Mäuse ohne Verfahren, um Effekte des Medikaments allein auf den gewünschten Verhaltens- oder histologischen Assay auszuschließen. Eine weitere Kontrolle könnte der Einschluss von vier Gruppen sein: DREADD + Ligand, DREADD + Vehikel, EGFP + Ligand, EGFP + Vehikel, was mögliche Auswirkungen sowohl der Genübertragung mit FUS-BBBO als auch des chemogenetischen Liganden berücksichtigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Abbildung 1: Der Prozess des MRT-gesteuerten Targetings von FUS in ATAC. (a) Platzierung der Maus mit Ohrbügeln, einem Nasenkonus und einer Plattform, die in einen MRT-Scanner eingebaut werden kann. (b) Eine 3D-gedruckte Führung (blau), die im MRT sichtbar ist, wurde an den Enden des Ohrbügelrahmens befestigt und dann mit einer Halterung einer Oberflächen-MRT-Spule mit vier Schnappbolzen (halbtransparent blau) befestigt. (c) Erscheinungsbild der 3D-gedruckten Schablone in der sagittalen MRT (linkes Bild), wobei die Unterseite der virtuellen Darstellung eines Schallkopfes (gelber Halbkreis) mit der Unterseite der Schablone ausgerichtet ist. Das rechte Bild zeigt das Erscheinungsbild der 3D-gedruckten Führung im MRT aus der koronalen Ansicht. Der helle Kreis wurde aus einem Polyjet-Trägermaterial hergestellt, das einen starken MRT-Kontrast aufweist. Das Kreuz wurde aus Kunststoff geformt. Ein gelber Kreis stellt die Position des Wandlers dar, die konzentrisch mit der Führung innerhalb eines stereotaktischen Rahmens ausgerichtet wurde. (d) Um Gehirnstrukturen anzuvisieren, wurde ein virtueller Schallkopf in z-Richtung über die Mäuse bewegt, um der Dicke eines Ultraschallkegels / -gehäuses zu entsprechen. In diesem Fall wurde der Wandler aufgrund der Dicke des Wasserbades 8,2 mm über die Führung verschoben, um eine genaue Zielerfassung zu ermöglichen. Die Hirnstrukturen wurden anhand von MRT-Bildgebungsdaten ausgewählt, ihre MRT-Koordinaten wurden dann aufgeschrieben und in die stereotaktische Maschine eingegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Abbildung 2: Schnittstelle der verwendeten Software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Abbildung 3: Prozess der Anpassung des MRT-Koordinatenraums an das stereotaktische Instrument. (a) Drei Löcher innerhalb eines Schallkopfhalters wurden mit drei Löchern innerhalb der MRT-Führung ausgerichtet, und drei konische Zielschrauben wurden eingesetzt, ohne dass die gesamte Baugruppe durchbiegt wurde. (b) Im Idealfall befinden sich alle drei Schrauben in der Mitte der Löcher. (c) Bei Ungenauigkeiten in der Ausrichtung würden nicht alle drei Schrauben hineinpassen, z. B. bei einer kleinen, wahrscheinlich nicht wahrnehmbaren Gierbewegung von 1° würde nur eine Schraube hineinpassen, während die gegenüberliegenden Schrauben an der MRT-Führung stecken blieben. Alternativ könnte es zu einer sichtbaren Biegung der gesamten Baugruppe kommen, da Schrauben durchgedrückt wurden. (d) Vergrößerte Ansicht der Verschraubung. Die Schrauben sollten konzentrisch platziert werden, um die beste Genauigkeit zu erzielen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Abbildung 4: Schnelle Umverteilung von Mikrobläschen innerhalb der Spritze. (a) Die Spritze wurde 5 s nach dem Mischen fotografiert. (b) Eine Minute später war eine deutlich sichtbare Schicht zu sehen, die einige der Blasen in der Nähe der Oberseite der 1-ml-Tuberkulinspritze zeigte. In diesem Beispiel wurde insbesondere eine Lösung von Mikrobläschen verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Abbildung 5: Prozess des Platzierens der Mitte eines Schallkopfs über einer Mitte einer MRT-Schablone. (a) Bei den in diesem Artikel gezeigten Modellen ist der rote Träger so konstruiert, dass er sich von der in Abbildung 3b gezeigten Position um 10,56 mm vorwärts zu einer hier gezeigten Position bewegt. (b) Die blaue MRT-Schablone wurde vor der Beschallung entfernt und ein Ultraschallgel wurde zwischen der Maus und dem Schallkopf (orange) aufgetragen, um den Ultraschalldurchgang zu gewährleisten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Abbildung 6: MRT-Visualisierung der BHS-Öffnung. a) Axiale Ansicht der BHS-Öffnung. Ein hellerer Bereich, der mit einer Pfeilspitze gekennzeichnet ist, zeigt eine Extravasation eines MRT-T1-Kontrastmittels. (b) Koronale Ansicht des dorsalen Hippocampus und des Kortex oberhalb des Hippocampus mit FUS-BBBO (Pfeilspitzen). (c) Koronale Ansicht des zentralen Hippocampus mit FUS-BBBO (Pfeilspitzen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Abbildung 7: Beispiel für das Targeting von 4 Gehirnstellen mit dem in diesem Artikel beschriebenen Drei-Schrauben-Zielsystem. Areale mit Pfeilspitzen zeigten BHS-offene Stellen mit Diffusion eines MRT-Kontrastmittels. Die vier Standorte wurden nacheinander anvisiert, mit ~150 s zwischen jeder BBB-Öffnung, von unten nach oben. Das Bild wurde innerhalb von 2 Minuten nach der letzten BBB-Öffnung aufgenommen. Der Maßstab beträgt 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Abbildung 8: Nachweis der DREADD-Expression.  (a) Die Immunfärbung für das an DREADDs gebundene Fluorophor, in diesem Fall mCherry, war in einigen Studien eine zuverlässige Nachweismethode. (b) In einem weiteren repräsentativen Abschnitt mit DREADDs, die unter den gleichen Bedingungen wie in (a) auf den Hippocampus gerichtet waren, erzeugte die Fluoreszenz von mCherry allein einen starken Hintergrund und ein relativ schwaches Signal. (c) Als Negativkontrolle wurde eine Maus verwendet, die eine systemische Injektion von AAV erhielt, aber keine FUS-BBBO erhielt. Durch die mCherry-Immunfärbung kann keine signifikante Expression gefunden werden. Maßstabsbalken sind 500 mm. (Daten in a, c adaptiert von7 mit Genehmigungen, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für die Genabgabe durch fokussierte Ultraschallöffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Bewertung der resultierenden Genexpression und die Messung der Neuromodulationsaktivität chemogenetischer Rezeptoren durch histologische Tests erforderlich sind.

Fokussierte ultraschallinduzierte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke zur gezielten Behandlung von Hirnstrukturen und zur Beurteilung der chemogenetischen Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Forschung

Neurowissenschaften

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

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Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

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Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Ein Benchtop-Ansatz zur standortspezifischen Blut-Hirn-Barriere-Öffnung mit fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Ein hochdurchsatzgesteuertes, stereotaktisches Neuronavigations- und fokussiertes Ultraschallsystem für die Öffnung der Blut-Hirn-Barriere bei Nagetieren

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Gezielte neuronale Verletzung für die nicht-invasive Trennung von Gehirn-Schaltung

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Abgabe von Antikörpern in das Gehirn mittels fokussiertem Scanning-Ultraschall

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Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...