Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי קרן המוח וההתנהגות, פרס החוקר הצעיר של NARSAD. מספר רכיבים מודפסים בתלת-ממד תוכננו במקור על ידי פביאן רבוסו (Image Guided Therapy, צרפת). המחבר מודה לג'ון הית' (קלטק) ולמרגרט סוויפט (קלטק) על העזרה הטכנית בהכנת כתב היד.

אין ניגוד עניינים.

ATAC דורש יישום מוצלח של מספר טכניקות לנוירומודולציה מוצלחת של מעגלים עצביים ספציפיים, כולל מיקוד מונחה MRI מדויק, FUS-BBBO, והערכה היסטולוגית של ביטוי גנים. רכיבים הניתנים להדפסה בתלת-ממד פותחו כדי לפשט את המיקוד של מבני מוח קטנים באמצעות FUS-BBBO מונחה הדמיה.
מתן אולטרסאונד ממוקד מונחה MRI (MRIgFUS) מציב מספר אתגרים. ראשית, לסליל MRI טיפוסי יש שטח מוגבל שנועד להכיל רק דגימה ולא את חומרת האולטרסאונד. המשעממים הגדולים יותר של MRI מגדילים את עלות הציוד ומפחיתים את איכות התמונה, שכן האות קשור לגורם המילוי של סליל32. כתוצאה מכך, כל חומרת FUS המונחת על גבי תמונה של בעל חיים ב-MRI תפגע באיכות ההדמיה. שנית, תכנון מכשירים תואמי MRI הוא קשה ויקר. חומרים תואמי MRI צריכים להיות דיאמגנטיים, בעלי נטייה נמוכה ליצירת זרמי ערבולת במהלך הקרנת גלי רדיו, ובעלי רגישות מגנטית נמוכה בשדות מגנטיים גבוהים. בכל חומר מוליך, יצירת זרמי מערבולת או רגישותו המגנטית ישפיעו לרעה גם על איכות ההדמיה. לבסוף, החומרים הזמינים תואמי MRI הם בעלי מודולי ועמידות נמוכים יותר של יאנג מאשר המתכות המשמשות בדרך כלל לייצור מכונות מיקוד מדויקות, כגון מסגרות סטריאוטקסיות. המנועים המשמשים לכוונון מיקום צריכים להיות תואמי MRI וממוקמים מחוץ למשעמם ה- MRI בשל גודלם. מנועים אלה צריכים להיות מחוברים במרחק למתמר בתוך משעמם MRI באמצעות חומרים תואמי MRI. בעיות של עיוות פלסטיק, היעדר מספיק מקום בתוך הבור כדי ליישם רכיבים בגודל חזק, וחוסר מקום מספיק לשינוי מיקומי מיקוד ברחבי המוח כולו השפיעו על דיוק המיקוד בעבודות קודמות.
כדי לפתור בעיות אלה, הוחלט לבצע הדמיה ב- MRI וניהול FUS-BBBO מחוץ לסורק. כדי לאפשר הנחיית MRI, עכברים הוכנסו לתוך ריסון מודפס בתלת-ממד עם מדריך מיקוד גלוי MRI שניתן להשתמש בו כדי למקם את מבני המוח של העכבר הן ב-MRI והן במרחב הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. מאחר שגם גולגולת העכבר וגם מדריך המיקוד מחוברים היטב למחזיקי מוטות האוזן (איור 1a,b), ניתן להשתמש במדריך מיקוד כדי לתאם קואורדינטות מרחביות בתוך תמונת MRI ולאפס את המכשירים הסטריאוטקסיים. לרסן אין חלקים נעים והוא אינו מכיל מתמר, מה שאפשר לנו להפוך אותו גם חזק וגם קטן מספיק כדי להיכנס לתוך MRI והסיר הפרעות אות מהאלקטרוניקה של המתמר. החלל בתוך מדריך המיקוד היה חלול כאשר התמיכה המודפסת בתלת-ממד עבור חומרים מסוימים נראית ב-MRI (איור 1c). חורים במכלול הוכנסו כדי לאפשר כיול סטריאוטקסי (איור 3). מתמר האולטרסאונד הוצמד לאלקטרודה בעלת סטריאוטקס, והמיקוד בוצע כמתואר בסעיף 4 (איור 1d). המתמר צריך להיות נתמך לאורכו על ידי בית של מוטות אוזניים, מניעת כל סטייה ממישור הרמה. ניתן להשיג את המיקוד בכיוון הגב-גחוני באמצעות שינויי פאזה במערך טבעתי.
דיוק המיקוד המעשי נקבע על ידי מיקוד אולטרסאונד והנחתת גולגולת. נוהל FUS-BBBO תואר בפירוט עבור חולדות 11 ויושם במספר יצורי מודל אחרים23,33,34 ובבני אדם 16,17. הקשר בין גודל מיקוד האולטרסאונד ביחס הפוך לתדר, כאשר תדרים גבוהים יותר יכולים לגרום למסירה מדויקת יותר. עם זאת, הנחתת הגולגולת עולה עם תדירויות35 מה שעלול להוביל לחימום הגולגולת ולפגיעה באזורים בקליפת המוח. אסטרטגיית המיקוד המדויקת תהיה תלויה באתר המוח. האתרים שבהם לחץ מקסימלי ברוחב מלא של חצי רוחב נכנס לתוך רקמת המוח מאפשרים פתיחה צפויה ובטוחה של BBB במבני מוח רבים כגון הסטריאטום, המוח התיכון וההיפוקמפוס. אזורים הסמוכים לבסיס המוח מהווים אתגר ספציפי בעכברים. מוח העכבר מודד כ-8-10 מ"מ בכיוון הגחון-דורסו, הדומה לחצי הרוחב המלא של הגודל המרבי של מתמרים רבים הזמינים מסחרית. כתוצאה מכך, מיקוד בתחתית הגולגולת יכול להוביל להחזר אולטרסאונד מהעצמות והאוויר הנמצאים בתעלות האוזן, בפה או בקנה הנשימה, אשר יכול להוביל לדפוסים בלתי צפויים של לחצים גבוהים ונמוכים36. חלק מהלחצים הללו יכולים לחצות סף קוויטציה אינרציאלי שהוכח כגורם לדימום ולנזק לרקמות37. כדי להתמקד באזורים הממוקמים בסמוך לבסיס הגולגולת, ייתכן שעדיף להשתמש ב-ATAC7 מצטלב, שבו גנטיקה מצטלבת38 משמשת להגבלת ביטוי גנים לאזור קטן יותר מזה הממוקד בקרן FUS. בדוגמה שפורסמה של ATAC מצטלב, חיה טרנסגנית המבטאת אנזים לעריכת גנים (Cre38) בתאים דופמינרגיים הותקפה באמצעות אולטרסאונד בתת-האזור המכיל תאים דופמינרגיים. לבסוף, אזורי קליפת המוח יכולים להיות ממוקדים עם FUS, אבל עקיפה והשתקפות של אולטרסאונד עלול להתרחש המוביל פרופילי לחץ אחידים. פרוטוקול זה אינו מכסה את המיקוד של אזורים בקליפת המוח מכיוון שהוא יהיה תלוי מאוד במינים המשומשים; אולם נצפתה התמקדות מסוימת בקליפת המוח שמעל היפוקמפוס 7 (למשל, איור 7), מה שמצביע על כך שלפחות בעכברים זה אפשרי.
הבחירה של מפעיל כימוגנטי ומינון יהיה תלוי בצרכים הניסוייים הספציפיים. מספר מחקרים, כולל אחד המחקרים של המחברים7, לא הראו תגובה לא ספציפית משמעותית39,40, בעוד מינונים גבוהים יותר (למשל, 10 מ"ג / ק"ג) יכולים לגרום לתופעות לוואי, לפחות במקרים מסוימים41. עם זאת, כמו בכל הניסויים ההתנהגותיים, בקרות נאותות31 חיוניות בשל פעילות פוטנציאלית מחוץ למיקוד של CNO והמטבוליטים שלו42. בקרות כאלה יכולות לכלול מתן בקרות CNO ומלוחים לבעלי חיים המבטאים DREADDs ומתן CNO לחיות בר או במקרים מסוימים השוואה בין אתרים איפסי וקונטרלטרליים במוח שעושים ואינם מבטאים קולטנים כימוגנטיים בהתאמה. בנוסף, מחקר שנערך לאחרונה גילה מספר אגוניסטים חדשים של DREADD עם ספציפיות משופרת28,29,43. קולטנים כימוגנטיים אחרים 5,25,44 יכולים לשמש גם בשילוב עם הליך ATAC.
הערכה היסטולוגית של ביטוי גנים היא הכרחית לאחר המוות עבור כל בעל חיים. חלק קטן מבעלי החיים מראים ביטוי גנים גרוע בעקבות FUS-BBBO7. בנוסף, יש צורך להראות את הדיוק המרחבי ואת הספציפיות של ביטוי גנים מאז מיקוד שגוי אפשרי. יש לציין כי חלק מה- AAV עשויים להראות יכולת מעקב מדרדר או אנטרוגרדי45 ויכולים לגרום לטרנספקציה הרחק מהאתר הממוקד באולטרסאונד למרות מיקוד אולטרסאונד מדויק. אם הקולטן הכימוגנטי המובע מאוחה או מבטא יחד פלואורופור, הדמיה של הפלואורופור במקטעי רקמה עשויה להספיק כדי להעריך לוקליזציה ועוצמת ביטוי. עם זאת, חלבונים פלואורסצנטיים רבים ניזוקים מתהליך קיבוע הרקמות, וצביעת מערכת החיסון עבור חלבון mCherry המשמש לעתים קרובות עם DREADDs הניבה אות טוב יותר במחקרים קודמים7. לבסוף, בשל צפיפות תאי העצב באזורים מסוימים במוח (למשל, שכבת תאים גרגירית בהיפוקמפוס), שימוש בפלואורופורים מקומיים גרעיניים המבוטאים תחת IRES, בניגוד לאיחוי, לביצוע ספירת תאים עשוי להועיל, שכן ניתן לפלח גרעינים בקלות ולהכתים אותם בכתמים גרעיניים, כגון DAPI או TO-PRO-3. כדי להעריך נוירומודולציה על ידי צביעת c-Fos, ביצוע צביעת נגד גרעינית וספירת גרעינים חיוביים c-Fos, ולא כל אות פלואורסצנטי, הוא הכרחי. במקרים מסוימים, פסולת תאית יכולה להראות פלואורסצנטיות ולבלבל את המדידות של תאים חיוביים.
מגבלות העברת התרופה והגנים עם FUS-BBBO כוללות רזולוציה נמוכה יותר מאשר העברה בזריקות תוך גולגולתיות פולשניות והצורך בכמויות גדולות יותר של תרופות מוזרקות או וקטורים נגיפיים. בנוסף, בעוד שהזרקה ישירה למוח מביאה לאספקה בלעדית לאתר המוזרק, FUS-BBBO משתמש בנתיב תוך ורידי וכתוצאה מכך העברה אפשרית לרקמות היקפיות. מגבלות השימוש בכימוגנטיקה לנוירומודולציה כוללות ציר זמן איטי, אשר עשוי להיות לא מספיק לפרוטוקולים התנהגותיים מסוימים הדורשים שינויים מהירים בעוצמת הנוירומודולציה.

השימוש בטכנולוגיות נוירומודולציה ספציפיות למעגלים, כגון אופטוגנטיקה1,2 וכימוגנטיקה 3,4,5, קידם את הבנתנו את המצבים הפסיכיאטריים כהפרעות במעגלים עצביים. מעגלים עצביים קשים למחקר וקשים עוד יותר לשליטה בטיפול בהפרעות מוחיות מכיוון שהם מוגדרים בדרך כלל על ידי סוגי תאים ספציפיים, אזורי מוח, מסלולי איתות מולקולריים ותזמון ההפעלה. באופן אידיאלי הן ליישומים מחקריים והן ליישומים קליניים, שליטה כזו תופעל באופן לא פולשני, אך השגת נוירומודולציה מדויקת ולא פולשנית היא מאתגרת. לדוגמה, בעוד תרופות נוירואקטיביות יכולות להגיע למוח באופן לא פולשני, הן חסרות ספציפיות מרחבית על ידי פעולה ברחבי המוח. מצד שני, גירוי חשמלי עמוק במוח יכול לשלוט באזורים מסוימים במוח, אך מתקשה לשלוט בסוגי תאים ספציפיים ודורש ניתוח ומיקום מכשיר6.
Acoustically Targeted Chemogenetics7 (ATAC) מספק נוירומודולציה עם ספציפיות מרחבית, סוג התא וטמפורלי. הוא משלב שלוש טכניקות: אולטרסאונד ממוקד המושרה על ידי פתיחת מחסום דם-מוח (FUS-BBBO) למיקוד מרחבי, שימוש בווקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAVs) כדי להעביר גנים באופן לא פולשני תחת שליטה של מקדמים ספציפיים לסוג התא, וקולטנים כימוגנטיים מהונדסים כדי לווסת מעגלים עצביים נגועים באופן סלקטיבי באמצעות מתן תרופות. FUS היא טכנולוגיה שאושרה על ידי ה- FDA המנצלת את יכולתו של האולטרסאונד להתמקד עמוק בתוך רקמות, כולל המוח האנושי, בדיוק מרחבי מילימטרי. בעוצמה גבוהה, FUS משמש לאבלציה ממוקדת לא פולשנית, כולל טיפול שאושר על ידי ה- FDA לרעד חיוני8. FUS-BBBO משלב אולטרסאונד בעוצמה נמוכה עם מיקרו-בועות מערכתיות, המתנדנדות בכלי הדם במוקד האולטרסאונד, וכתוצאה מכך פתיחה מקומית, זמנית (6-24 שעות) והפיכה של BBB9. פתח זה מאפשר העברה של חלבונים9,10, מולקולות קטנות 11 ווקטורים נגיפיים7,12,13,14 למוח ללא נזק משמעותי לרקמות במכרסמים 10 ובפרימטים לא אנושיים 15. ניסויים קליניים נמשכים עבור FUS-BBBO16,17, המצביעים על יישומים טיפוליים אפשריים של טכניקה זו.
העברת גנים נגיפיים באמצעות AAV מתקדמת במהירות גם לשימוש קליני עבור הפרעות במערכת העצבים המרכזית, עם אישורים רגולטוריים אחרונים של ה- FDA והאיחוד האירופי כאבני דרך עיקריות. לבסוף, קולטנים כימוגנטיים18, כגון קולטני מעצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים (DREADDs), נמצאים בשימוש נרחב על ידי מדעני מוח כדי לספק שליטה פרמקולוגית על עירור עצבי בבעלי חיים טרנסגניים או נגועים 19,20. DREADDs הם קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) שהונדסו גנטית להגיב למולקולות כימוגנטיות סינתטיות ולא לליגנדות אנדוגניות, כך שמתן מערכתי של ליגנדות אלה מגביר או מפחית את ההתרגשות של נוירונים המבטאים DREADD. כאשר שלוש טכנולוגיות אלה משולבות לתוך ATAC, הן יכולות לשמש לאפנון לא פולשני של מעגלים עצביים נבחרים עם דיוק מרחבי, סוג תא וטמפורלי.
כאן, אנו מרחיבים ומעדכנים פרוטוקול שפורסם בעבר עבור FUS-BBBO11 על ידי הכללת מתודולוגיה למיקוד מדויק של אזורי מוח עם FUS-BBBO בעכברים באמצעות ציוד מיקוד פשוט המודפס בתלת-ממד. אנו מציגים גם יישום של FUS-BBBO ל- ATAC. אנו מראים את הצעדים הדרושים לאספקת AAVs הנושאים קולטנים כימוגנטיים, והערכה של ביטוי גנים ונוירומודולציה על ידי היסטולוגיה. שיטה זו ישימה במיוחד עבור מיקוד אזורי מוח גדולים או מרובים עבור ביטוי גנים או נוירומודולציה. לדוגמה, אזור רחב של קליפת המוח יכול להיות מומר בקלות עם FUS-BBBO ומווסת באמצעות כימוגנטיקה. עם זאת, העברת גנים בטכניקה חלופית, זריקות תוך גולגולתיות, תדרוש מספר רב של זריקות פולשניות וקרניוטומיות. FUS-BBBO והיישום שלו, ATAC, ניתנים להרחבה לבעלי חיים בגדלים שונים, שבהם אזורי המוח גדולים יותר וקשה יותר לתקוף אותם באופן פולשני.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

כימוגנטיקה ממוקדת אקוסטית (ATAC) מאפשרת בקרה לא פולשנית של מעגלים עצביים ספציפיים. ATAC משיג שליטה כזו באמצעות שילוב של אולטרסאונד ממוקד (FUS) המושרה על ידי פתיחת מחסום דם-מוח (FUS-BBBO), העברת גנים עם וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAV), והפעלה של איתות תאי עם קולטני חלבונים מהונדסים וכימוגנטיים והליגנדים הקוגנטיים שלהם. עם ATAC, ניתן להמיר אזורי מוח גדולים וקטנים בדיוק מילימטרי באמצעות יישום אולטרסאונד יחיד לא פולשני. התמרה זו יכולה מאוחר יותר לאפשר נוירומודולציה ארוכת טווח, לא פולשנית ונטולת מכשירים בבעלי חיים הנעים בחופשיות באמצעות תרופה. מאחר ש-FUS-BBBO, AAVs וכימוגנטיקה שימשו בבעלי חיים רבים, ATAC צריך להיות ניתן להרחבה גם לשימוש במינים אחרים של בעלי חיים. מאמר זה מרחיב פרוטוקול שפורסם בעבר ומתאר כיצד למטב את העברת הגנים עם FUS-BBBO לאזורי מוח קטנים עם הנחיית MRI, אך ללא צורך במכשיר FUS מסובך תואם MRI. הפרוטוקול, גם, מתאר את העיצוב של מיקוד עכבר ורכיבי ריסון שניתן להדפיס בתלת-ממד על ידי כל מעבדה וניתן לשנות אותם בקלות עבור מינים שונים או ציוד מותאם אישית. כדי לסייע ביכולת השחזור, הפרוטוקול מתאר בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרו-בועות, AAV וניפונקטורה בפיתוח ATAC. לבסוף, נתונים לדוגמה מוצגים כדי להנחות את החקירות הראשוניות של מחקרים באמצעות ATAC.

השלב הראשון בביצוע פרוטוקול ATAC הוא מיקוד של FUS-BBBO לאזורי המוח הרצויים. לדוגמה, בעקבות הפרוטוקול המתואר, ההיפוקמפוס הותקף באמצעות FUS-BBBO, וחומר ניגוד ו-AAV9 הנושאים DREADD הוזרקו לעכברים, ולאחר מכן רצף MRI תלת-ממדי FLASH הרוכש תמונות של מוח העכבר. שיפור אות T1 הושג באזור ההיפוקמפוס (איור 6) ובחלקים אחרים של המוח (איור 7). לאחר מספר שבועות, DREADDs באו לידי ביטוי בתוך אזור מוח המטרה. בעוד DREADDs רבים מאוחים לכתב פלואורסצנטי (למשל mCherry), תהליך הזילוח והקיבוע עם פורמלדהיד נמצא כמפחית באופן דרסטי את הפלואורסצנטיות של חלבונים אלה. צביעה חיסונית נגד mCherry או DREADD הובילה לזיהוי אמין יותר של הביטוי (איור 8) בהתבסס על ניסיון קודם. בניסויים קודמים, ~85% מהעכברים הראו ביטוי לאחר FUS-BBBO7. בדיקה פשוטה לרמות ביטוי מספיקות של DREADDs היא בדיקת הפונקציונליות שלהם ברמה התאית. זה יכול להיעשות, למשל, על ידי מתן ליגנד כימוגנטי או בקרת מלוחים, כגון CNO19, deschloroclozapine 28, או אחרים29, ומחכה 2 שעות לפני זילוח לב וקיבוע. לאחר מכן חלקי המוח עברו חיסון, עבור חלבון c-Fos30, המצביע על פעילות מוגברת של נוירונים, ועבור DREADD. הניסוי נחשב למוצלח, אם האתר במוח שהותקף ב-DREADDs הראה מספר גבוה משמעותית של גרעינים עצביים שהם חיוביים ל-c-Fos בקבוצה שקיבלה ליגנד כימוגנטי בהשוואה לקבוצה שקיבלה מלוחים7 או בהשוואה לאתר נגדי שלא היה נתון ל-FUS-BBBO. יש לציין כי קיים פוטנציאל עבור חלק מהליגנדות הללו להפעיל תאי עצב באופן לא ספציפי ללא ביטוי של DREADDs. לדוגמה, CNO הוכח כמטבוליזם לרמות נמוכות של קלוזאפין בעכברים, אשר חוצה את מחסום הדם-מוח ומפעיל DREADDs בעוצמה גבוהה27. עם זאת, הוכח גם שהוא נקשר למיקומים לא ספציפיים. כמו בכל ניסוי, חיוני לכלול את כל הבקרות המתאימות במחקרים כימוגנטיים31. בקרה אפשרית אחת היא מתן הליגנד הכימוגנטי לעכברי בר, ללא פרוצדורות, כדי לשלול את השפעות התרופה בלבד על הבדיקה ההתנהגותית או ההיסטולוגית הרצויה. בקרה נוספת יכולה להיות הכללה של ארבע קבוצות: DREADD + ליגנד, DREADD + רכב, EGFP + ליגנד, EGFP + רכב, אשר יסביר את כל ההשפעות האפשריות של העברת גנים עם FUS-BBBO, ואת ליגנד כימוגנטי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> איור 1: התהליך של מיקוד מונחה MRI של FUS ב-ATAC. (א) מיקום עכבר עם מוטות אוזניים, חרוט אף ופלטפורמה שניתן להכניס בתוך סורק MRI. (ב) מדריך מודפס בתלת-ממד (כחול) הנראה ב-MRI חובר לקצוות מסגרת מוט האוזן ולאחר מכן אובטח במקומו באמצעות מחזיק סליל MRI משטח המכיל ארבעה ברגי הצמדה (כחול שקוף למחצה). (ג) הופעת המדריך המודפס בתלת-ממד ב-MRI קשת (פאנל שמאלי), כאשר תחתית הייצוג הווירטואלי של מתמר מיושרת (חצי עיגול צהוב) עם תחתית המדריך. הפאנל הימני מציג את המראה של המדריך המודפס בתלת-ממד על MRI ממבט קורונלי. העיגול הבהיר היה עשוי מחומר תמיכה פוליג'ט בעל ניגודיות MRI חזקה. הצלב נוצר מפלסטיק. עיגול צהוב מייצג את מיקום המתמר שהיה מיושר באופן קונצנטרי עם המדריך בתוך מסגרת סטריאוטקסית. (d) כדי להתמקד במבני מוח, מתמר וירטואלי הוזז בכיוון z מעל העכברים כדי להתאים לעובי של חרוט / בית אולטרסאונד. במקרה זה, בגלל עובי אמבט המים, המתמר הועבר 8.2 מ"מ מעל המדריך למיקוד מדויק. מבני המוח נבחרו באמצעות נתוני דימות MRI, וקואורדינטות ה-MRI שלהם נכתבו והוזנו למכונה הסטריאוטקסית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> איור 2: ממשק התוכנה שבה נעשה שימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> איור 3: תהליך התאמת מרחב קואורדינטות MRI למכשיר סטריאוטקסי. (א) שלושה חורים בתוך מחזיק מתמר יושרו עם שלושה חורים בתוך מדריך ה-MRI, ושלושה ברגי מיקוד חרוטיים הוכנסו מבלי לגרום לכיפוף המכלול כולו. (ב) באופן אידיאלי, כל שלושת הברגים ישבו במרכז החורים. (ג) אם יש אי דיוק כלשהו ביישור, לא כל שלושת הברגים ייכנסו פנימה, למשל, במקרה של פיהוק קטן, ככל הנראה בלתי מורגש, של 1°, רק בורג אחד יתאים בעוד שהברגים הנגדיים יהיו תקועים במדריך MRI. לחלופין, יכולה להיות גמישות נראית לעין של המכלול כולו כאשר ברגים נדחקו פנימה. (ד) תצוגה מוגדלת של התאמת ברגים. יש למקם את הברגים באופן מרוכז לקבלת הדיוק הטוב ביותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> איור 4: חלוקה מחדש מהירה של מיקרו-בועות בתוך המזרק. (א) מזרק צולם 5 שניות לאחר הערבוב. (ב) דקה לאחר מכן, הייתה שכבה גלויה בבירור שהראתה חלק מהבועות מתרכזות ליד החלק העליון של מזרק שחפת 1 מ"ל. דוגמה זו, בפרט, השתמשה פתרון של microbubbles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> איור 5: תהליך של מיקום מרכז מתמר מעל מרכז של מדריך MRI. (א) במודלים המוצגים במאמר זה, המוביל האדום תוכנן לנוע 10.56 מ"מ קדימה מהמיקום המוצג באיור 3b, למצב המוצג כאן. (ב) מדריך ה-MRI הכחול הוסר לפני הסוניקציה, וג'ל אולטרסאונד הוחל בין העכבר למתמר (כתום) כדי להבטיח מעבר אולטרסאונד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> איור 6: הדמיית MRI של פתח BBB. (א) מבט צירי על פתח BBB. אזור בהיר יותר המסומן עם ראש חץ מראה אקסטרווזיה של חומר ניגוד MRI T1 . (b) מבט קורונלי על ההיפוקמפוס הגבי וקליפת המוח שמעל ההיפוקמפוס הממוקדת באמצעות FUS-BBBO (ראשי חץ). (c) מבט קורונלי על ההיפוקמפוס המרכזי הממוקד באמצעות FUS-BBBO (ראשי חץ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> איור 7: דוגמה למיקוד של 4 אתרי מוח באמצעות מערכת מיקוד תלת-ברגית המתוארת במאמר זה. אזורים עם ראשי חץ הראו BBB נפתח אתרים עם דיפוזיה של חומר ניגוד MRI. ארבעת האתרים היו ממוקדים ברצף, עם ~ 150 שניות בין כל פתח BBB, מלמטה למעלה. התמונה צולמה תוך 2 דקות לאחר הפתיחה האחרונה של BBB. סרגל קנה המידה הוא 2 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> איור 8: זיהוי ביטוי DREADD.  (א) Immunostaining עבור fluorophore מחובר DREADDs, במקרה זה mCherry היה שיטה אמינה של גילוי בכמה מחקרים. (b) בחלק מייצג אחר עם DREADDs המכוונים להיפוקמפוס תוך שימוש באותם תנאים כמו ב-(a), הפלואורסצנטיות של mCherry לבדה יצרה רקע חזק ואות חלש יחסית. (ג) כבקרה שלילית, נעשה שימוש בעכבר שקיבל הזרקה מערכתית של AAV, אך לא עבר FUS-BBBO. לא ניתן למצוא ביטוי משמעותי על ידי mCherry immunostaining. פסי קנה מידה הם 500 מ"מ. (נתונים ב-a, c הותאמומ-7 עם הרשאות, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים להעברת הגן באמצעות פתיחה ממוקדת של מחסום דם במוח (BBB), הערכה של ביטוי הגנים המתקבל ומדידת פעילות נוירומודולציה של קולטנים כימוגנטיים באמצעות בדיקות היסטולוגיות.

אולטרסאונד ממוקד המושרה פתיחת מחסום דם-מוח למיקוד מבנים במוח והערכת נוירומודולציה כימוגנטית

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

גישה ספסל למיקום ספציפי מחסום הדם מוח פתיחת באמצעות אולטרסאונד ממוקד במודל עכברוש

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

נוירון סטראוטקטי מונחה תפוקה גבוהה ומערכת אולטרסאונד ממוקדת לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

פגיעה עצבית ממוקדת לניתוק לא פולשני של מעגלי מוח

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

העברת נוגדנים למוח באמצעות אולטרסאונד סריקה ממוקדת

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים באמצעות זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...