Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata dalla Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Diversi componenti stampati in 3D sono stati originariamente progettati da Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Francia). L'autore ringrazia John Heath (Caltech) e Margaret Swift (Caltech) per l'assistenza tecnica nella preparazione del manoscritto.

Nessun conflitto di interessi.

L'ATAC richiede l'implementazione di successo di diverse tecniche per la neuromodulazione di circuiti neurali specifici, tra cui un targeting accurato guidato dalla risonanza magnetica, FUS-BBBO e la valutazione istologica dell'espressione genica. I componenti stampabili in 3D sono stati sviluppati per semplificare il targeting di piccole strutture cerebrali con FUS-BBBO guidato dall'imaging.
La somministrazione di ultrasuoni focalizzati guidati dalla risonanza magnetica (MRIgFUS) pone una serie di sfide. Innanzitutto, la tipica bobina per risonanza magnetica ha uno spazio limitato, progettato per ospitare solo un campione e non l'hardware a ultrasuoni. I fori più grandi delle risonanze magnetiche aumentano il costo delle apparecchiature e diminuiscono la qualità dell'immagine, poiché il segnale è correlato al fattore di riempimento di una bobina32. Di conseguenza, qualsiasi hardware FUS posizionato sulla parte superiore di un'immagine animale nella risonanza magnetica comprometterà la qualità dell'imaging. In secondo luogo, la progettazione di dispositivi compatibili con la risonanza magnetica è difficile e costosa. I materiali compatibili con la risonanza magnetica devono essere diamagnetici, avere una bassa propensione a creare correnti parassite durante l'irradiazione a radiofrequenza e avere una bassa suscettibilità magnetica in campi magnetici elevati. In qualsiasi materiale conduttivo, anche la creazione di correnti parassite o la sua suscettibilità magnetica influirà negativamente sulla qualità dell'immagine. Infine, i materiali compatibili con la risonanza magnetica disponibili hanno moduli di Young e durata inferiori rispetto ai metalli tipicamente utilizzati nella produzione di macchine di puntamento precise, ad esempio telai stereotassici. I motori utilizzati per le regolazioni di posizione devono essere compatibili con la risonanza magnetica e posizionati al di fuori del foro della risonanza magnetica a causa delle loro dimensioni. Questi motori devono essere collegati a distanza al trasduttore all'interno di un foro per risonanza magnetica utilizzando materiali compatibili con la risonanza magnetica. I problemi di deformazione della plastica, la mancanza di spazio sufficiente all'interno del foro per implementare componenti di dimensioni robuste e lo spazio insufficiente per cambiare le posizioni di puntamento in tutto il cervello hanno influenzato la precisione del puntamento nei lavori precedenti.
Per risolvere questi problemi, è stata presa la decisione di eseguire l'imaging nella risonanza magnetica e la somministrazione di FUS-BBBO al di fuori dello scanner. Per consentire la guida alla risonanza magnetica, i topi sono stati inseriti all'interno di un sistema di ritenuta stampato in 3D che aveva una guida di puntamento visibile alla risonanza magnetica che poteva essere utilizzata per localizzare le strutture cerebrali del topo sia nella risonanza magnetica che nello spazio delle coordinate stereofiscali. Poiché sia il cranio del topo che la guida di puntamento sono saldamente fissati ai supporti della barra auricolare (Figura 1a,b), è possibile utilizzare una guida di puntamento per correlare le coordinate spaziali all'interno dell'immagine RM e azzerare gli strumenti stereotassici. Il sistema di ritenuta non ha parti mobili e non contiene un trasduttore, il che ci ha permesso di renderlo robusto e sufficientemente piccolo da poter essere inserito all'interno di una risonanza magnetica e di rimuovere l'interferenza del segnale dall'elettronica del trasduttore. Lo spazio all'interno della guida di puntamento è stato svuotato poiché il supporto stampato in 3D per alcuni materiali è visibile nella risonanza magnetica (Figura 1c). Sono stati introdotti dei fori nell'assieme per consentire la calibrazione della stereotax (Figura 3). Il trasduttore a ultrasuoni è stato collegato a un portaelettrodo di una stereotassi e il targeting è stato eseguito come descritto nella sezione 4 (Figura 1d). Il trasduttore deve essere supportato per tutta la sua lunghezza dall'alloggiamento di barre auricolari, evitando qualsiasi deviazione dal piano di livello. Il puntamento in direzione dorso-ventrale può essere ottenuto utilizzando sfasamenti in un array anulare.
La precisione pratica del puntamento è determinata dalla messa a fuoco degli ultrasuoni e dall'attenuazione del cranio. La procedura FUS-BBBO è stata descritta in dettaglio per i ratti 11 ed è stata implementata in un certo numero di altri organismi modello23,33,34 e nell'uomo 16,17. La relazione tra la dimensione della messa a fuoco degli ultrasuoni è inversamente proporzionale alla frequenza, dove frequenze più elevate possono portare a un'erogazione più precisa. Tuttavia, l'attenuazione del cranio aumenta con frequenze35 che possono portare al riscaldamento del cranio e al danneggiamento delle aree corticali. L'esatta strategia di targeting dipenderà dal sito del cervello. I siti in cui una pressione massima a tutta larghezza si adatta all'interno del tessuto cerebrale consentono un'apertura prevedibile e sicura della BBB in molte strutture cerebrali come lo striato, il mesencefalo e l'ippocampo. Le regioni vicine alla base del cervello rappresentano una sfida specifica nei topi. Il cervello del topo misura circa 8-10 mm in direzione dorso-ventrale, che è paragonabile alla metà della larghezza massima di molti trasduttori disponibili in commercio. Di conseguenza, il targeting nella parte inferiore del cranio può portare alla riflessione degli ultrasuoni dalle ossa e dall'aria presenti nei condotti uditivi, nella bocca o nella trachea, che possono portare a modelli imprevedibili di alte e basse pressioni36. Alcune di queste pressioni possono superare una soglia di cavitazione inerziale che ha dimostrato di causare sanguinamento e danni ai tessuti37. Per colpire le regioni che si trovano vicino alla base del cranio, può essere preferibile utilizzare ATAC7 intersezionale, dove la genetica intersezionale38 viene utilizzata per limitare l'espressione genica a un'area più piccola di quella mirata con il fascio FUS. Nell'esempio pubblicato di ATAC intersezionale, un animale transgenico che esprime un enzima di editing genetico (Cre38) nelle cellule dopaminergiche è stato preso di mira con gli ultrasuoni nella sottosezione della regione contenente le cellule dopaminergiche. Infine, le regioni corticali possono essere prese di mira con la FUS, ma la diffrazione e la riflessione degli ultrasuoni possono verificarsi portando a profili di pressione non uniformi. Questo protocollo non copre il targeting delle regioni corticali in quanto dipenderà fortemente dalle specie utilizzate; tuttavia, è stato osservato un certo targeting della corteccia sopra l'ippocampo 7 (ad esempio, la Figura 7) che indica che, almeno nei topi, è possibile.
La scelta di un attivatore chemiogenetico e il dosaggio dipenderanno dalle specifiche esigenze sperimentali. Un certo numero di studi, tra cui uno degli studi degli autori7, non ha mostrato alcuna risposta non specifica significativa39,40, mentre dosi più elevate (ad esempio, 10 mg/kg) possono produrre effetti collaterali, almeno in alcuni casi41. Tuttavia, come per tutti gli esperimenti comportamentali, controlli adeguati31 sono essenziali a causa della potenziale attività off-target del CNO e dei suoi metaboliti42. Tali controlli potrebbero includere la somministrazione di CNO e controlli salini ad animali che esprimono DREADDs e la somministrazione di CNO ad animali wild-type o, in alcuni casi specifici, un confronto tra siti ipsi- e controlaterali del cervello che esprimono rispettivamente recettori chemiogenetici e non esprimono. Inoltre, una recente ricerca ha rivelato un certo numero di nuovi agonisti DREADD con una migliore specificità28,29,43. Altri recettori chemiogenetici 5,25,44 possono anche essere utilizzati in combinazione con la procedura ATAC.
La valutazione istologica dell'espressione genica è necessaria post-mortem per ogni animale. Una piccola frazione di animali mostra una scarsa espressione genica dopo FUS-BBBO7. Inoltre, è necessario mostrare l'accuratezza spaziale e la specificità dell'espressione genica poiché è possibile un mis-targeting. Da notare che alcuni AAV possono mostrare capacità di tracciamento retrogrado o anterogrado45 e possono causare trasfezione lontano dal sito bersaglio con gli ultrasuoni, nonostante l'accurato targeting ecografico. Se il recettore chemiogenetico espresso è fuso o co-esprime un fluoroforo, l'imaging del fluoroforo in sezioni di tessuto può essere sufficiente per valutare la localizzazione e l'intensità dell'espressione. Tuttavia, molte proteine fluorescenti sono danneggiate dal processo di fissazione tissutale e l'immunocolorazione per la proteina mCherry, che viene spesso utilizzata con i DREADD, ha prodotto un segnale migliore negli studi precedenti7. Infine, a causa della densità dei neuroni in alcune parti del cervello (ad esempio, lo strato cellulare granulare nell'ippocampo), l'uso di fluorofori localizzati in modo nucleare espressi sotto IRES, al contrario delle fusioni, per eseguire conteggi cellulari può essere utile poiché i nuclei possono essere facilmente segmentati e controcolorati con coloranti nucleari, come DAPI o TO-PRO-3. Per valutare la neuromodulazione mediante colorazione c-Fos, è fondamentale eseguire la controcolorazione nucleare e contare i nuclei c-Fos positivi, piuttosto che qualsiasi segnale di fluorescenza. In alcuni casi, i detriti cellulari possono mostrare fluorescenza e confondere le misurazioni delle cellule positive.
I limiti del farmaco e della somministrazione genica con FUS-BBBO includono una risoluzione inferiore rispetto alla somministrazione con iniezioni intracraniche invasive e la necessità di maggiori quantità di farmaci iniettati o vettori virali. Inoltre, mentre un'iniezione diretta nel cervello si traduce in una consegna esclusiva in un sito iniettato, FUS-BBBO utilizza una via endovenosa con conseguente possibile consegna ai tessuti periferici. I limiti dell'uso della chemiogenetica per la neuromodulazione includono una scala temporale lenta, che può essere inadeguata ad alcuni protocolli comportamentali che richiedono rapidi cambiamenti nell'intensità della neuromodulazione.

L'uso di tecnologie di neuromodulazione circuito-specifiche, come l'optogenetica1,2 e la chemiogenetica 3,4,5, ha fatto progredire la nostra comprensione delle condizioni psichiatriche come disturbi del circuito neuronale. I circuiti neuronali sono difficili da studiare e ancora più difficili da controllare nel trattamento dei disturbi cerebrali perché sono tipicamente definiti da specifici tipi di cellule, regioni cerebrali, vie di segnalazione molecolare e tempi di attivazione. Idealmente, sia per la ricerca che per le applicazioni cliniche, tale controllo dovrebbe essere esercitato in modo non invasivo, ma è difficile ottenere una neuromodulazione precisa e non invasiva. Ad esempio, mentre i farmaci neuroattivi possono raggiungere il cervello in modo non invasivo, mancano di specificità spaziale agendo in tutto il cervello. D'altra parte, la stimolazione elettrica del cervello profondo può controllare specifiche regioni cerebrali, ma ha difficoltà a controllare specifici tipi di cellule e richiede un intervento chirurgico e il posizionamento di dispositivi6.
La chemiogenetica acusticamente mirata7 (ATAC) fornisce neuromodulazione con specificità spaziale, di tipo cellulare e temporale. Combina tre tecniche: l'apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati (FUS-BBBO) per il targeting spaziale, l'uso di vettori virali adeno-associati (AAV) per fornire in modo non invasivo geni sotto il controllo di promotori specifici del tipo di cellula e recettori chemiogenetici ingegnerizzati per modulare selettivamente i circuiti neurali trasfettati tramite la somministrazione di farmaci. FUS è una tecnologia approvata dalla FDA che sfrutta la capacità degli ultrasuoni di mettere a fuoco in profondità all'interno dei tessuti, compreso il cervello umano, con precisione spaziale millimetrica. Ad alta potenza, la FUS viene utilizzata per l'ablazione mirata non invasiva, incluso un trattamento approvato dalla FDA per il tremore essenziale8. FUS-BBBO combina gli ultrasuoni a bassa intensità con microbolle somministrate per via sistemica, che oscillano nei vasi sanguigni al fuoco dell'ultrasuono, provocando un'apertura localizzata, temporanea (6-24 h) e reversibile della BBB9. Questa apertura consente la consegna delle proteine9,10, delle piccole molecole 11 e dei vettori virali7,12,13,14 al cervello senza danni tissutali significativi nei roditori 10 e nei primati non umani 15. Sono in corso studi clinici per FUS-BBBO16,17, che indicano possibili applicazioni terapeutiche di questa tecnica.
Anche la somministrazione genica virale con AAV sta rapidamente avanzando nell'uso clinico per i disturbi del sistema nervoso centrale, con le recenti approvazioni normative della FDA e dell'UE come pietre miliari importanti. Infine, i recettori chemiogenetici18, come i Designer Receptors Activated Exclusively by Designer Drugs (DREADDs), sono ampiamente utilizzati dai neuroscienziati per fornire il controllo farmacologico sull'eccitazione neuronale in animali transgenici o trasfettati 19,20. I DREADD sono recettori accoppiati a proteine G (GPCR) che sono stati geneticamente modificati per rispondere a molecole chemiogenetiche sintetiche piuttosto che a ligandi endogeni, in modo tale che la somministrazione sistemica di questi ligandi aumenti o riduca l'eccitabilità dei neuroni che esprimono DREADD. Quando queste tre tecnologie vengono combinate in ATAC, possono essere utilizzate per la modulazione non invasiva di circuiti neurali selezionati con precisione spaziale, di tipo cellulare e temporale.
Qui, espandiamo e aggiorniamo un protocollo precedentemente pubblicato per FUS-BBBO11 includendo una metodologia per il targeting accurato delle regioni cerebrali con FUS-BBBO nei topi utilizzando semplici apparecchiature di targeting stampate in 3D. Mostriamo anche un'applicazione di FUS-BBBO ad ATAC. Mostriamo i passaggi necessari per la somministrazione di AAV che trasportano recettori chemiogenetici e la valutazione dell'espressione genica e della neuromodulazione mediante istologia. Questa tecnica è particolarmente applicabile per il targeting di regioni cerebrali grandi o multiple per l'espressione genica o la neuromodulazione. Ad esempio, un'ampia area di una corteccia può essere facilmente trasdotta con FUS-BBBO e modulata utilizzando la chemiogenetica. Tuttavia, la somministrazione genica con una tecnica alternativa, le iniezioni intracraniche, richiederebbe un gran numero di iniezioni invasive e craniotomie. FUS-BBBO e la sua applicazione, ATAC, possono essere adattati ad animali di diverse dimensioni, dove le regioni cerebrali sono più grandi e più difficili da colpire in modo invasivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

La chemiogenetica a bersaglio acustico (ATAC) consente il controllo non invasivo di specifici circuiti neurali. L'ATAC raggiunge tale controllo attraverso una combinazione di apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati (FUS-BBBO), somministrazione genica con vettori virali adeno-associati (AAV) e attivazione della segnalazione cellulare con recettori proteici ingegnerizzati, chemiogenetici e i loro ligandi affini. Con l'ATAC è possibile trasdurre regioni cerebrali grandi e piccole con precisione millimetrica utilizzando un'unica applicazione ecografica non invasiva. Questa trasduzione può successivamente consentire una neuromodulazione a lungo termine, non invasiva e priva di dispositivi in animali che si muovono liberamente utilizzando un farmaco. Poiché FUS-BBBO, AAV e chemiogenetica sono stati utilizzati in più animali, l'ATAC dovrebbe essere scalabile anche per l'uso in altre specie animali. Questo documento espande un protocollo precedentemente pubblicato e delinea come ottimizzare la consegna genica con FUS-BBBO a piccole regioni cerebrali con guida per la risonanza magnetica, ma senza la necessità di un complicato dispositivo FUS compatibile con la risonanza magnetica. Il protocollo, inoltre, descrive la progettazione di componenti di puntamento e contenimento del mouse che possono essere stampati in 3D da qualsiasi laboratorio e possono essere facilmente modificati per diverse specie o attrezzature personalizzate. Per favorire la riproducibilità, il protocollo descrive in dettaglio come le microbolle, gli AAV e la venipuntura sono stati utilizzati nello sviluppo dell'ATAC. Infine, vengono mostrati alcuni dati esemplificativi per guidare le indagini preliminari degli studi che utilizzano l'ATAC.

Il primo passo per eseguire il protocollo ATAC è il targeting del FUS-BBBO verso le regioni cerebrali desiderate. Ad esempio, seguendo il protocollo descritto, l'ippocampo è stato preso di mira con FUS-BBBO e l'agente di contrasto e i DREADD portatori di AAV9 sono stati iniettati nei topi, seguiti da una sequenza di risonanza magnetica FLASH 3D che acquisisce immagini del cervello del topo. Un miglioramento del segnale T1 è stato ottenuto nella regione dell'ippocampo (Figura 6) e in altre parti del cervello (Figura 7). Dopo diverse settimane, i DREADD sono stati espressi all'interno della regione cerebrale bersaglio. Mentre molti DREADD sono fusi con un reporter fluorescente (ad esempio mCherry), è stato scoperto che il processo di perfusione e fissazione con la formaldeide riduce drasticamente la fluorescenza di queste proteine. L'immunocolorazione contro mCherry o DREADD ha portato a un rilevamento più affidabile dell'espressione (Figura 8) sulla base dell'esperienza precedente. In esperimenti precedenti, ~85% dei topi ha mostrato espressione dopo FUS-BBBO7. Un semplice test per livelli sufficienti di espressione dei DREADD è testare la loro funzionalità a livello cellulare. Può essere fatto, ad esempio, fornendo un ligando chemiogenetico o un controllo salino, come CNO 19, descloroclozapina28 o altri29, e attendere 2 ore prima di una perfusione cardiaca e fissazione. Le sezioni cerebrali sono state poi co-immunocolorate per la proteina c-Fos30, che indica una maggiore attività dei neuroni, e per DREADD. L'esperimento è stato considerato un successo se il sito del cervello bersaglio con DREADD ha mostrato un numero significativamente più elevato di nuclei neuronali positivi a c-Fos nel gruppo che ha ricevuto un ligando chemiogenetico rispetto al gruppo che ha ricevuto soluzione fisiologica7 o rispetto a un sito controlaterale che non è stato sottoposto a FUS-BBBO. Da notare che c'è la possibilità per alcuni di questi ligandi di attivare i neuroni in modo non specifico senza l'espressione di DREADD. Ad esempio, è stato dimostrato che il CNO viene metabolizzato in bassi livelli di clozapina nei topi, che attraversa la BBB e attiva i DREADD ad alta potenza27. Tuttavia, è stato anche dimostrato che si lega a posizioni non specifiche. Come in ogni esperimento, è fondamentale includere tutti i controlli appropriati negli studi chemiogenetici31. Un possibile controllo è la somministrazione del ligando chemiogenetico a topi wild-type, senza procedure, per escludere gli effetti del farmaco da solo sul test comportamentale o istologico desiderato. Un altro controllo potrebbe essere l'inclusione di quattro gruppi: DREADD + ligando, DREADD + veicolo, EGFP + ligando, EGFP + veicolo, che terrà conto di eventuali effetti potenziali sia del rilascio genico con FUS-BBBO che del ligando chemiogenetico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figura 1: Il processo di targeting guidato dalla risonanza magnetica di FUS in ATAC. (a) Posizionamento del mouse con barre auricolari, un cono nasale e una piattaforma che può essere inserita all'interno di uno scanner MRI. (b) Una guida stampata in 3D (blu) visibile nella risonanza magnetica è stata attaccata alle estremità del telaio della barra auricolare e quindi fissata in posizione con un supporto di una bobina per risonanza magnetica superficiale che contiene quattro bulloni a scatto (blu semitrasparente). (c) Aspetto della guida stampata in 3D nella risonanza magnetica sagittale (pannello di sinistra), con una parte inferiore della rappresentazione virtuale di un trasduttore allineata (semicerchio giallo) con la parte inferiore della guida. Il pannello di destra mostra l'aspetto della guida stampata in 3D sulla risonanza magnetica dalla vista coronale. Il cerchio luminoso è stato realizzato con un materiale di supporto polyjet che ha un forte contrasto MRI. La croce è stata formata con la plastica. Un cerchio giallo rappresenta la posizione del trasduttore che è stato allineato concentricamente con la guida all'interno di un telaio stereotassico. (d) Per colpire le strutture cerebrali, un trasduttore virtuale è stato spostato in direzione z sopra i topi per abbinare lo spessore di un cono / alloggiamento a ultrasuoni. In questo caso, a causa dello spessore del bagno d'acqua, il trasduttore è stato spostato di 8,2 mm sopra la guida per un puntamento accurato. Le strutture cerebrali sono state selezionate utilizzando i dati di imaging della risonanza magnetica e le loro coordinate della risonanza magnetica sono state quindi annotate e inserite nella macchina stereotassica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figura 2: Interfaccia del software utilizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figura 3: Processo di corrispondenza dello spazio delle coordinate della risonanza magnetica allo strumento stereotassico. (a) Tre fori all'interno di un supporto del trasduttore sono stati allineati con tre fori all'interno della guida MRI e tre bulloni di puntamento conici sono stati inseriti senza causare la flessione dell'intero gruppo. (b) Idealmente, tutti e tre i bulloni dovrebbero trovarsi al centro dei fori. (c) Se c'è qualche imprecisione nell'allineamento, non tutti e tre i bulloni si adatterebbero, ad esempio, in caso di piccola imbardata probabilmente impercettibile di 1°, solo un bullone si adatterebbe mentre i bulloni opposti sarebbero bloccati alla guida MRI. In alternativa, potrebbe esserci una flessione visibile dell'intero gruppo quando i bulloni sono stati forzati. (d) Vista ingrandita del bullone. I bulloni devono essere posizionati concentricamente per la massima precisione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figura 4: Rapida ridistribuzione delle microbolle all'interno della siringa. (a) La siringa è stata fotografata 5 secondi dopo la miscelazione. (b) Un minuto dopo, c'era uno strato chiaramente visibile che mostrava alcune delle bolle concentrate vicino alla parte superiore della siringa di tubercolina da 1 ml. Questo esempio, in particolare, ha utilizzato una soluzione di microbolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figura 5: Processo di posizionamento del centro di un trasduttore su un centro di una guida MRI. (a) Nei modelli illustrati in questo documento, il supporto rosso è stato progettato per spostarsi di 10,56 mm in avanti dalla posizione mostrata nella Figura 3b a quella mostrata qui. (b) La guida blu per la risonanza magnetica è stata rimossa prima della sonicazione ed è stato applicato un gel ad ultrasuoni tra il topo e il trasduttore (arancione) per garantire il passaggio degli ultrasuoni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figura 6: Visualizzazione RM dell'apertura della BBB. (a) Vista assiale dell'apertura BBB. L'area più luminosa designata con una punta di freccia mostra lo stravaso di un mezzo di contrasto MRI T1 . (b) Vista coronale dell'ippocampo dorsale e della corteccia sopra l'ippocampo bersaglio con FUS-BBBO (punte di freccia). (c) Vista coronale dell'ippocampo centrale bersaglio con FUS-BBBO (punte di freccia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figura 7: Esempio di targeting di 4 siti cerebrali utilizzando il sistema di targeting a tre bulloni descritto in questo articolo. Le aree con punte di freccia mostravano siti aperti di BBB con diffusione di un mezzo di contrasto per risonanza magnetica. I quattro siti sono stati presi di mira in successione, con ~150 s tra ogni apertura BBB, dal basso verso l'alto. L'immagine è stata scattata entro 2 minuti dall'ultima apertura BBB. La barra della scala è di 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Figura 8: Rilevamento dell'espressione DREADD.  (a) L'immunocolorazione per il fluoroforo attaccato ai DREADD, in questo caso mCherry è stato un metodo affidabile di rilevamento in alcuni studi. (b) In un'altra sezione rappresentativa con DREADDs mirati all'ippocampo utilizzando le stesse condizioni di (a), la fluorescenza di mCherry da sola ha prodotto un forte fondo e un segnale relativamente debole. (c) Come controllo negativo, è stato utilizzato un topo che ha ricevuto un'iniezione sistemica di AAV, ma non è stato sottoposto a FUS-BBBO. Nessuna espressione significativa può essere trovata dall'immunocolorazione mCherry. Le barre della scala sono di 500 mm. (Dati in a, c adattati da7 con autorizzazioni, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Questo protocollo delinea le fasi necessarie per la veicolazione genica attraverso l'apertura della barriera ematoencefalica (BBB) ad ultrasuoni focalizzati, la valutazione dell'espressione genica risultante e la misurazione dell'attività di neuromodulazione dei recettori chemiogenetici attraverso test istologici.

Apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati per il targeting delle strutture cerebrali e la valutazione della neuromodulazione chemiogenetica

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