Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Flere 3D-printede komponenter ble opprinnelig designet av Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrike). Forfatter takker John Heath (Caltech) og Margaret Swift (Caltech) for teknisk hjelp med å forberede manuskriptet.

Ingen interessekonflikt.

ATAC krever vellykket implementering av flere teknikker for vellykket nevromodulering av spesifikke nevrale kretser, inkludert nøyaktig MR-veiledet målretting, FUS-BBBO og histologisk evaluering av genuttrykk. 3D-printbare komponenter ble utviklet for å forenkle målretting av små hjernestrukturer med bildeveiledet FUS-BBBO.
Administrering av MR-veiledet fokusert ultralyd (MRIgFUS) byr på en rekke utfordringer. For det første har typisk MR-spole begrenset plass som er designet for å bare imøtekomme en prøve og ikke ultralydmaskinvaren. De større boringene av MR øker kostnadene for utstyr og reduserer bildekvaliteten, da signalet er relatert til fyllfaktoren til en spole32. Følgelig vil enhver FUS-maskinvare plassert på toppen av et dyrebilde i MR kompromittere bildekvaliteten. For det andre er det vanskelig og dyrt å designe MR-kompatible enheter. MR-kompatible materialer må være diamagnetiske, ha lav tilbøyelighet til å skape virvelstrømmer under radiofrekvent bestråling, og ha lav magnetisk følsomhet i høye magnetfelt. I et hvilket som helst ledende materiale vil dannelsen av virvelstrømmer eller dens magnetiske følsomhet også påvirke bildekvaliteten negativt. Endelig har de tilgjengelige MR-kompatible materialene lavere Youngs moduli og holdbarhet enn metallene som vanligvis brukes i produksjon av presise målmaskiner, for eksempel stereotaksiske rammer. Motorene som brukes til posisjonsjusteringer må være MR-kompatible og plasseres utenfor MR-boringen på grunn av størrelsen. Disse motorene må kobles på avstand til transduseren inne i en MR-boring ved hjelp av MR-kompatible materialer. Problemer med plastvridning, mangel på tilstrekkelig plass inne i boringen for å implementere robuste komponenter og utilstrekkelig rom for å endre målposisjoner over hele hjernen har påvirket målrettingsnøyaktigheten i tidligere arbeid.
For å løse disse problemene ble det besluttet å utføre bildediagnostikk i MR- og FUS-BBBO-administrasjon utenfor skanneren. For å tillate MR-veiledning ble mus plassert inne i en 3D-printet begrensning som hadde en MR-synlig målrettingsguide som kunne brukes til å lokalisere musehjernestrukturene både i MR og i stereotaks-koordinatrommet. Siden både museskallen og målrettingsveiledningen er godt festet til ørebøyleholdere (figur 1a,b), kan en målrettingsveiledning brukes til å korrelere romlige koordinater i MR-bildet og nullstille de stereotaksiske instrumentene. Fastholdelsen har ikke bevegelige deler og inneholder ikke en svinger, noe som tillot oss å gjøre den både robust og tilstrekkelig liten til å passe inn i en MR og fjernet signalforstyrrelser fra transduserens elektronikk. Plassen inne i målrettingsveiledningen har blitt uthult ettersom den 3D-printede støtten for noen materialer er synlig i MR (figur 1c). Hull i forsamlingen ble introdusert for å muliggjøre stereotakskalibrering (figur 3). Ultralydtransduseren var festet til en elektrodeholder med stereotaks, og målretting ble utført som beskrevet i avsnitt 4 (figur 1d). Transduseren skal støttes langs lengden ved å huse ørestenger, og forhindre avvik fra nivåplanet. Målrettingen i dorso-ventral retning kan oppnås ved hjelp av faseforskyvninger i en ringformet matrise.
Den praktiske målrettingspresisjonen bestemmes av ultralydfokusering og skalledemping. FUS-BBBO-prosedyren er beskrevet i detalj for rotter 11 og er implementert i en rekke andre modellorganismer23,33,34 og hos mennesker 16,17. Forholdet mellom ultralydfokusstørrelsen omvendt proporsjonal med frekvensen, hvor høyere frekvenser kan resultere i mer presis levering. Imidlertid øker dempingen av skallen med frekvensene35, noe som kan føre til kranieoppvarming og skade på kortikale områder. Den nøyaktige målrettingsstrategien vil avhenge av hjernens nettsted. Stedene der et halvt maksimalt trykk i full bredde passer inn i hjernevevet, gir forutsigbar og sikker BBB-åpning i mange hjernestrukturer som striatum, midthjerne og hippocampus. Regioner nær hjernebunnen utgjør en spesifikk utfordring hos mus. Musehjernen måler omtrent 8-10 mm i dorso-ventral retning, noe som kan sammenlignes med den maksimale størrelsen på halv bredde for mange kommersielt tilgjengelige transdusere. Følgelig kan målretting på bunnen av skallen føre til ultralydrefleksjon fra bein og luft som er tilstede i ørekanaler, munn eller luftrør som kan føre til uforutsigbare mønstre av høyt og lavt trykk36. Noen av disse trykkene kan krysse en treghetskavitasjonsterskel som har vist seg å forårsake blødning og vevskader37. For å målrette regioner som ligger nær bunnen av skallen, kan det være å foretrekke å bruke interseksjonell ATAC7, hvor interseksjonell genetikk38 brukes til å begrense genuttrykk til et mindre område enn det som er målrettet med FUS-stråle. I det publiserte eksemplet på interseksjonell ATAC har et transgent dyr som uttrykker et genredigeringsenzym (Cre38) i dopaminerge celler blitt målrettet med ultralyd i den delen av regionen som inneholder dopaminerge celler. Endelig kan de kortikale områdene målrettes med FUS, men diffraksjon og refleksjon av ultralyd kan forekomme som fører til ujevne trykkprofiler. Denne protokollen dekker ikke målretting av kortikale regioner, da den vil være svært avhengig av den brukte arten; Imidlertid er det observert en viss målretting av cortex over hippocampus 7 (f.eks. figur 7) som indikerer at det, i det minste hos mus, er mulig.
Valget av kjemogenetisk aktivator og dosering vil avhenge av de spesifikke eksperimentelle behovene. En rekke studier, inkludert en av forfatternes studier7, viste ingen signifikant uspesifikk respons39,40, mens høyere doser (f.eks. 10 mg/kg) kan gi bivirkninger, i hvert fall i noen tilfeller41. Imidlertid, som med alle atferdseksperimenter, er riktige kontroller31 avgjørende på grunn av potensiell off-målrettet aktivitet av CNO og dets metabolitter42. Slike kontroller kan omfatte administrering av CNO og saltvannskontroller til dyr, uttrykke DREADDs og administrering av CNO til villtype, eller i noen spesifikke tilfeller en sammenligning av ipsi- og kontralaterale steder i hjernen som henholdsvis uttrykker og ikke uttrykker kjemogenetiske reseptorer. I tillegg avslørte nyere forskning en rekke nye DREADD-agonister med forbedret spesifisitet28,29,43. Andre kjemogenetiske reseptorer 5,25,44 kan også brukes i forbindelse med ATAC-prosedyre.
Histologisk evaluering av genuttrykk er nødvendig post mortem for hvert dyr. En liten brøkdel av dyrene viser dårlig genuttrykk etter FUS-BBBO7. I tillegg er det nødvendig å vise den romlige nøyaktigheten og spesifisiteten til genuttrykk siden feilmålretting er mulig. Merk at noen AAV-er kan vise retrograd eller anterograd sporingsevne45 og kan forårsake transfeksjon langt fra stedet som er målrettet med ultralyd til tross for nøyaktig ultralydmålretting. Hvis den uttrykte kjemogenetiske reseptoren er fusjonert til eller co-uttrykker en fluorofor, kan avbildning av fluoroforen i vevsseksjoner være tilstrekkelig til å evaluere lokalisering og intensitet av ekspresjon. Imidlertid er mange fluorescerende proteiner skadet av vevsfikseringsprosessen, og immunfarging for mCherry-protein som ofte brukes med DREADDs ga bedre signal i tidligere studier7. Til slutt, på grunn av tettheten av nevroner i visse deler av hjernen (f.eks. Granulært cellelag i hippocampus), kan bruk av kjernefysisk lokaliserte fluoroforer uttrykt under IRES, i motsetning til fusjoner, for å utføre celletelling, være fordelaktig siden kjerner lett kan segmenteres og motfarges med kjernefysiske flekker, for eksempel DAPI eller TO-PRO-3. For å evaluere nevromodulering ved c-Fos-farging, er det viktig å utføre kjernefysisk motfarging og telle c-Fos-positive kjerner, i stedet for noe fluorescenssignal. I noen tilfeller kan cellulært rusk vise fluorescens og forvirre målingene av positive celler.
Begrensninger av stoffet og genleveransen med FUS-BBBO inkluderer lavere oppløsning enn levering med invasive intrakranielle injeksjoner og behovet for større mengder injiserte legemidler eller virale vektorer. I tillegg, mens en direkte injeksjon i hjernen resulterer i eksklusiv levering til et injisert sted, bruker FUS-BBBO en intravenøs rute som resulterer i mulig levering til perifert vev. Begrensninger ved bruk av kjemogenetikk for nevromodulering inkluderer en langsom tidsskala, noe som kan være utilstrekkelig for noen atferdsprotokoller som krever raske endringer i intensiteten av nevromodulering.

Bruk av kretsspesifikke nevromodulasjonsteknologier, som optogenetikk1,2 og kjemogenetikk 3,4,5, har avansert vår forståelse av psykiatriske tilstander som nevronkretsforstyrrelser. Nevrale kretser er vanskelige å studere og enda vanskeligere å kontrollere ved behandling av hjernesykdommer fordi de vanligvis er definert av spesifikke celletyper, hjernegrupper, molekylære signalveier og tidspunkt for aktivering. Ideelt for både forskning og kliniske anvendelser vil slik kontroll utøves ikke-invasivt, men å oppnå både presis og ikke-invasiv nevromodulering er utfordrende. For eksempel, mens nevroaktive stoffer kan nå hjernen ikke-invasivt, mangler de romlig spesifisitet ved å virke gjennom hele hjernen. På den annen side kan elektrisk dyphjernestimulering kontrollere bestemte hjernegrupper, men har problemer med å kontrollere spesifikke celletyper og krever kirurgi og enhetsplassering6.
Acoustically Targeted Chemogenetics7 (ATAC) gir nevromodulering med romlig, celletype og tidsmessig spesifisitet. Den kombinerer tre teknikker: fokusert ultralydindusert blod-hjernebarriereåpning (FUS-BBBO) for romlig målretting, bruk av adenoassosierte virale vektorer (AAV) for ikke-invasivt å levere gener under kontroll av celletypespesifikke promotorer, og konstruerte kjemogenetiske reseptorer for å modulere transfekterte nevrale kretser selektivt via legemiddeladministrasjon. FUS er en FDA-godkjent teknologi som utnytter ultralydets evne til å fokusere dypt inne i vev, inkludert den menneskelige hjerne, med millimeter romlig presisjon. Ved høy effekt brukes FUS til ikke-invasiv målrettet ablasjon, inkludert en FDA-godkjent behandling for essensiell tremor8. FUS-BBBO kombinerer ultralyd med lav intensitet med systemisk administrerte mikrobobler, som svinger i blodkar ved ultralydfokus, noe som resulterer i lokalisert, midlertidig (6-24 timer) og reversibel åpning av BBB9. Denne åpningen tillater levering av proteiner9,10, små molekyler 11 og virale vektorer7,12,13,14 til hjernen uten signifikant vevsskade hos gnagere 10 og ikke-menneskelige primater 15. Kliniske studier pågår for FUS-BBBO16,17, noe som indikerer mulige terapeutiske anvendelser av denne teknikken.
Viral genlevering ved hjelp av AAV utvikler seg også raskt til klinisk bruk for CNS-lidelser, med nylige FDA og EU-regulatoriske godkjenninger som viktige milepæler. Endelig er kjemogenetiske reseptorer18, som Designer Receptors Activated Exclusive by Designer Drugs (DREADDs), mye brukt av nevrologer for å gi farmakologisk kontroll over nevronal eksitasjon i transgene eller transfekterte dyr19,20. DREADDs er G-proteinkoblede reseptorer (GPCRs) som har blitt genetisk konstruert for å reagere på syntetiske kjemogenetiske molekyler i stedet for endogene ligander, slik at systemisk administrasjon av disse ligandene øker eller reduserer eksitabiliteten til DREADD-uttrykkende nevroner. Når disse tre teknologiene kombineres til ATAC, kan de brukes til ikke-invasiv modulering av utvalgte nevrale kretser med romlig, celletype og tidsmessig presisjon.
Her utvider og oppdaterer vi en tidligere publisert protokoll for FUS-BBBO11 ved å inkludere metodikk for nøyaktig målretting av hjernegrupper med FUS-BBBO hos mus ved hjelp av enkelt 3D-trykt målrettingsutstyr. Vi viser også en anvendelse av FUS-BBBO til ATAC. Vi viser nødvendige skritt for levering av AAV-er som bærer kjemogenetiske reseptorer, og evaluering av genuttrykk og nevromodulering ved histologi. Denne teknikken er spesielt anvendelig for å målrette store eller flere hjernegrupper for genuttrykk eller nevromodulering. For eksempel kan et bredt område av en cortex lett transduseres med FUS-BBBO og moduleres ved hjelp av kjemogenetikk. Imidlertid vil genlevering med en alternativ teknikk, intrakranielle injeksjoner, kreve et stort antall invasive injeksjoner og kraniotomier. FUS-BBBO og dens applikasjon, ATAC, kan skaleres til dyr av forskjellige størrelser, hvor hjernegrupper er større og vanskeligere å målrette invasivt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

Akustisk målrettet kjemogenetikk (ATAC) muliggjør ikke-invasiv kontroll av spesifikke nevrale kretser. ATAC oppnår slik kontroll gjennom en kombinasjon av fokusert ultralyd (FUS) indusert blod-hjernebarriereåpning (FUS-BBBO), genlevering med adeno-assosierte virale (AAV) vektorer, og aktivering av cellulær signalering med konstruerte, kjemogenetisk, proteinreseptorer og deres kognitive ligander. Med ATAC er det mulig å transdusere både store og små hjernegrupper med millimeterpresisjon ved hjelp av en enkelt ikke-invasiv ultralydapplikasjon. Denne transduksjonen kan senere tillate en langsiktig, ikke-invasiv, enhetsfri nevromodulering i fritt bevegelige dyr ved hjelp av et stoff. Siden FUS-BBBO, AAV og kjemogenetikk har blitt brukt på flere dyr, bør ATAC også kunne skaleres for bruk i andre dyrearter. Denne artikkelen utvider en tidligere publisert protokoll og skisserer hvordan man optimaliserer genleveransen med FUS-BBBO til små hjerneområder med MR-veiledning, men uten behov for en komplisert MR-kompatibel FUS-enhet. Protokollen beskriver også utformingen av musemålretting og fastholdelseskomponenter som kan 3D-printes av et hvilket som helst laboratorium og enkelt kan modifiseres for forskjellige arter eller tilpasset utstyr. For å bidra til reproduserbarhet beskriver protokollen i detalj hvordan mikrobobler, AAV-er og venepunktur ble brukt i ATAC-utvikling. Til slutt vises et eksempeldata for å veilede de foreløpige undersøkelsene av studier som bruker ATAC.

Det første trinnet i å utføre ATAC-protokollen er målrettingen av FUS-BBBO til de ønskede hjernegruppene. For eksempel, etter den beskrevne protokollen, ble hippocampus målrettet med FUS-BBBO, og kontrastmiddel og AAV9 som bærer DREADDs ble injisert i musene, etterfulgt av en FLASH 3D MR-sekvens som skaffer bilder av musehjernen. En T1-signalforsterkning ble oppnådd i hippocampusregionen (figur 6) og i andre deler av hjernen (figur 7). Etter flere uker ble DREADDs uttrykt inne i målhjerneregionen. Mens mange DREADDs er smeltet til en fluorescerende reporter (f.eks. mCherry), ble prosessen med perfusjon og fiksering med formaldehyd funnet å drastisk redusere fluorescensen av disse proteinene. Immunfarging mot mCherry eller DREADD førte til sikrere påvisning av uttrykket (figur 8) basert på tidligere erfaringer. I tidligere eksperimenter viste ~ 85% av musene uttrykk etter FUS-BBBO7. En enkel test for tilstrekkelige uttrykksnivåer av DREADDs tester funksjonaliteten på mobilnivå. Det kan for eksempel gjøres ved å gi en kjemogenetisk ligand eller en saltvannskontroll, som CNO 19, desklorklozapin28 eller andre29, og vente 2 timer før en hjerteperfusjon og fiksering. Hjerneseksjonene ble deretter co-immunfarget for c-Fos protein30, noe som indikerer økt aktivitet av nevroner, og for DREADD. Forsøket ble ansett som vellykket, hvis hjernestedet målrettet med DREADDs viste signifikant høyere antall nevronkjerner som er c-Fos-positive i gruppen som fikk en kjemogenetisk ligand sammenlignet med gruppen som fikk saltvann7 eller sammenlignet med et kontralateralt sted som ikke ble utsatt for FUS-BBBO. Merk at det er et potensial for noen av disse ligandene å aktivere nevroner ikke-spesifikt uten uttrykk for DREADDs. For eksempel har CNO vist seg å metaboliseres til lave nivåer av klozapin hos mus, som krysser BBB og aktiverer DREADDs med høy styrke27. Det ble imidlertid også vist å binde seg til ikke-spesifikke steder. Som i alle eksperimenter er det viktig å inkludere alle riktige kontroller i kjemogenetiske studier31. En mulig kontroll er administrering av den kjemogenetiske liganden til villtypemus, uten prosedyrer, for å utelukke effekter av stoffet alene på ønsket atferdsmessig eller histologisk analyse. En annen kontroll kan være inklusjon av fire grupper: DREADD + ligand, DREADD + kjøretøy, EGFP + ligand, EGFP + kjøretøy, som vil redegjøre for potensielle effekter av både genlevering med FUS-BBBO og den kjemogenetiske liganden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figur 1: Prosessen med MR-veiledet målretting av FUS i ATAC. (a) Museplassering med ørestenger, en nesekjegle og en plattform som kan passe inn i en MR-skanner. (b) En 3D-trykt guide (blå) som er synlig i MR ble festet til endene av ørestangrammen og deretter festet på plass med en holder av en overflate MR-spole som inneholder fire snap-on bolter (semi-gjennomsiktig blå). (c) Utseende av den 3D-printede veiledningen i sagittal MR (venstre panel), med en bunn av den virtuelle representasjonen av en svinger justert (gul halvcirkel) med bunnen av guiden. Høyre panel viser utseendet til den 3D-printede veiledningen på MR fra koronalvisning. Den lyse sirkelen ble laget av et polyjetstøttemateriale som har en sterk MR-kontrast. Korset ble dannet med plast. En gul sirkel representerer svingerens plassering som ble justert konsentrisk med guiden inne i en stereotaksisk ramme. (d) For å målrette hjernestrukturer ble en virtuell svinger flyttet i z-retning over musene for å matche tykkelsen på en ultralydkegle / hus. I dette tilfellet, på grunn av tykkelsen på vannbadet, ble transduseren flyttet 8,2 mm over guiden for nøyaktig målretting. Hjernestrukturer ble valgt ved hjelp av MR-bildedata, og deres MR-koordinater ble deretter skrevet ned og lagt inn i den stereotaktiske maskinen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figur 2: Grensesnittet til programvaren som brukes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figur 3: Prosess for å matche MR-koordinatrom til stereotaktisk instrument. (a) Tre hull i en svingerholder ble justert med tre hull i MR-styret, og tre koniske målbolter ble satt inn uten å forårsake flex til hele forsamlingen. (b) Ideelt sett ville alle tre boltene sitte i midten av hullene. (c) Hvis det er upresisjon i justeringen, vil ikke alle tre boltene passe inn, for eksempel i tilfelle av liten, sannsynlig umerkelig yaw på 1 °, vil bare en bolt passe inn mens de motsatte boltene vil sitte fast ved MR-guiden. Alternativt kunne det være synlig fleksing av hele forsamlingen når bolter ble presset gjennom. (d) Forstørret visning av boltmontering. Boltene bør plasseres konsentrert for best nøyaktighet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figur 4: Rask omfordeling av mikrobobler i sprøyten. (a) Sprøyten ble fotografert 5 s etter blanding. (b) Ett minutt senere var det et godt synlig lag som viste noen av boblene konsentrat nær toppen av 1 ml tuberkulinsprøyte. Dette eksemplet brukte spesielt en løsning av mikrobobler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figur 5: Prosess for å plassere sentrum av en transduser over et senter av en MR-guide. (a) I modellene vist i denne artikkelen er den røde bæreren konstruert for å bevege seg 10,56 mm fremover fra posisjonen vist i figur 3b, til en som vises her. (b) Den blå MR-guiden ble fjernet før sonikering, og en ultralydgel ble påført mellom musen og transduseren (oransje) for å sikre ultralydpassasje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figur 6: MR-visualisering av BBB-åpningen. (a) Aksialt bilde av BBB-åpningen. Lysere område utpekt med pilspiss viser ekstravasasjon av et MRT1-kontrastmiddel . (b) Koronal utsikt over dorsal hippocampus og cortex over hippocampus målrettet med FUS-BBBO (pilspisser). (c) Koronal utsikt over den sentrale hippocampus målrettet med FUS-BBBO (pilspisser). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figur 7: Eksempel på målretting av 4 hjernesider ved hjelp av treboltsmålrettingssystemet beskrevet i denne artikkelen. Områder med pilspisser viste BBB åpne steder med diffusjon av et MR-kontrastmiddel. De fire stedene ble målrettet etter hverandre, med ~ 150 s mellom hver BBB-åpning, fra bunn til topp. Bildet ble tatt innen 2 min etter siste BBB-åpning. Skalastangen er 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Figur 8: Påvisning av DREADD-uttrykk.  (a) Immunfarging for fluoroforen festet til DREADDs, i dette tilfellet mCherry var en pålitelig metode for påvisning i noen studier. (b) I en annen representativ seksjon med DREADDs rettet mot hippocampus med de samme forholdene som i (a), ga fluorescensen av mCherry i seg selv sterk bakgrunn og relativt svakt signal. (c) Som negativ kontroll ble det brukt en mus som fikk systemisk injeksjon av AAV, men som ikke gjennomgikk FUS-BBBO. Ingen signifikant uttrykk kan bli funnet ved mCherry immunostaining. Skalastenger er 500 mm. (Data i a, c tilpasset fra7 med tillatelser, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Denne protokollen avgrenser trinn som er nødvendige for genleveransen gjennom fokusert ultralyd blodhjernebarriere (BBB) åpning, evaluering av det resulterende genuttrykket og måling av nevromodulasjonsaktivitet av kjemogenetiske reseptorer gjennom histologiske tester.

Fokusert ultralydindusert blod-hjernebarriereåpning for å målrette hjernestrukturer og evaluere kjemogenetisk nevromodulering

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Høyoppløselig AC Confocal avbildning av blod - hjerne barrieren: bildebehandling, 3D rekonstruksjon og kvantifisering av Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

I Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet analysen mus med Fluorescently merket Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Bedømme i Vivo blod - hjerne barrieren avbrudd i en rotte modell av iskemiske hjerneslag

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

En benchtop tilnærming til plasseringen spesifikke blod hjernebarriere åpning ved hjelp av fokusert ultralyd i en rotte modell

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Et høygjennomstrømningsbildestyrt stereotaktisk nevronavigering og fokusert ultralydsystem for blod-hjernebarriereåpning hos gnagere

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Målrettet nevronal skade for ikke-invasiv frakobling av hjernekretser

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Levering av antistoffer i hjernen ved hjelp av fokusert skanning ultralyd

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registrering av barrierefunksjonell integritet på bEnd.3 Vaskulære endotelceller via deteksjon av transendotelial elektrisk motstand

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Rekonstruksjon av blod-hjernebarrieren in vitro for å modellere og terapeutisk målrette nevrologisk sykdom

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...