Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pela Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Vários componentes impressos em 3D foram originalmente projetados por Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, França). O autor agradece a John Heath (Caltech) e Margaret Swift (Caltech) pela ajuda técnica na preparação do manuscrito.

Inexistência de conflitos de interesse.

A ATAC requer a implementação bem-sucedida de várias técnicas para o sucesso da neuromodulação de circuitos neurais específicos, incluindo direcionamento guiado por RM preciso, FUS-BBBO e avaliação histológica da expressão gênica. Componentes imprimíveis em 3D foram desenvolvidos para simplificar a segmentação de pequenas estruturas cerebrais com FUS-BBBO guiado por imagem.
A administração de ultrassom focalizado guiado por RM (MRIgFUS) apresenta uma série de desafios. Primeiro, a bobina de ressonância magnética típica tem espaço limitado que é projetado para acomodar apenas uma amostra e não o hardware de ultrassom. Os furos maiores das RMs aumentam o custo do equipamento e diminuem a qualidade da imagem, pois o sinal está relacionado ao fator de preenchimento de uma bobina32. Consequentemente, qualquer hardware FUS colocado na parte superior de uma imagem animal na ressonância magnética comprometerá a qualidade da imagem. Em segundo lugar, projetar dispositivos compatíveis com ressonância magnética é difícil e caro. Materiais compatíveis com RM precisam ser diamagnéticos, ter baixa propensão a criar correntes parasitas durante a irradiação por radiofrequência e ter baixa suscetibilidade magnética em campos magnéticos altos. Em qualquer material condutor, a criação de correntes parasitas ou sua suscetibilidade magnética também afetará negativamente a qualidade da imagem. Finalmente, os materiais compatíveis com ressonância magnética disponíveis têm módulos e durabilidade de Young mais baixos do que os metais normalmente usados na produção de máquinas de direcionamento preciso, por exemplo, quadros estereotáxicos. Os motores usados para ajustes posicionais precisam ser compatíveis com RM e colocados fora do furo da RM devido ao seu tamanho. Esses motores devem ser conectados a uma distância do transdutor dentro de um furo de ressonância magnética usando materiais compatíveis com ressonância magnética. Problemas de empenamento de plástico, falta de espaço suficiente dentro do furo para implementar componentes de tamanho robusto e espaço insuficiente para mudar as posições de direcionamento em todo o cérebro afetaram a precisão de direcionamento em trabalhos anteriores.
Para resolver esses problemas, optou-se por realizar exames de imagem na RM e administração de FUS-BBBO fora do scanner. Para permitir a orientação por ressonância magnética, os camundongos foram colocados dentro de uma contenção impressa em 3D que tinha um guia de direcionamento visível por ressonância magnética que poderia ser usado para localizar as estruturas cerebrais de camundongos tanto na ressonância magnética quanto no espaço de coordenadas estereotaxadas. Uma vez que tanto o crânio do rato como o guia de mira estão firmemente presos aos suportes da barra auricular (Figura 1a,b), um guia de mira pode ser usado para correlacionar as coordenadas espaciais dentro da imagem de RM e zerar os instrumentos estereotáxicos. A contenção não tem partes móveis e não contém um transdutor, o que nos permitiu torná-lo robusto e suficientemente pequeno para caber dentro de uma ressonância magnética e removeu a interferência de sinal da eletrônica do transdutor. O espaço dentro do guia de direcionamento foi esvaziado, pois o suporte impresso em 3D para alguns materiais é visível na RM (Figura 1c). Furos no conjunto foram introduzidos para permitir a calibração estereotáxica (Figura 3). O transdutor de ultrassom foi acoplado a um porta-eletrodos de um estereotaxa, e o direcionamento foi realizado conforme descrito na seção 4 (Figura 1d). O transdutor deve ser apoiado ao longo de seu comprimento por alojamento de barras auriculares, evitando qualquer desvio do plano plano. O direcionamento na direção dorso-ventral pode ser obtido usando deslocamentos de fase em uma matriz anular.
A precisão prática do direcionamento é determinada pela focalização por ultrassom e atenuação do crânio. O procedimento FUS-BBBO foi descrito em detalhes para ratos 11 e foi implementado em vários outros organismos modelo23,33,34 e em humanos 16,17. A relação entre o tamanho do foco do ultrassom é inversamente proporcional à frequência, onde frequências mais altas podem resultar em entrega mais precisa. No entanto, a atenuação do crânio aumenta com as frequências35, o que pode levar ao aquecimento do crânio e danos às áreas corticais. A estratégia de direcionamento exata dependerá do local do cérebro. Os locais onde uma meia pressão máxima de largura total se encaixa dentro do tecido cerebral permitem a abertura previsível e segura da BBB em muitas estruturas cerebrais, como o estriado, o mesencéfalo e o hipocampo. Regiões próximas à base do cérebro representam um desafio específico em camundongos. O cérebro de camundongos mede aproximadamente 8-10 mm na direção dorso-ventral, o que é comparável ao tamanho máximo da metade da largura total de muitos transdutores disponíveis comercialmente. Consequentemente, o direcionamento para a parte inferior do crânio pode levar à reflexão ultrassonográfica dos ossos e do ar presentes nos canais auditivos, boca ou traqueia, o que pode levar a padrões imprevisíveis de altas e baixas pressões36. Algumas dessas pressões podem ultrapassar um limiar de cavitação inercial que demonstrou causar sangramento e dano tecidual37. Para atingir regiões próximas à base do crânio, pode ser preferível o uso do ATAC7 interseccional, em que a genética interseccional38 é usada para restringir a expressão gênica a uma área menor do que a atingida pelo feixe de USF. No exemplo publicado de ATAC interseccional, um animal transgênico expressando uma enzima de edição gênica (Cre38) em células dopaminérgicas foi alvo de ultrassom na subseção da região que contém células dopaminérgicas. Finalmente, as regiões corticais podem ser alvo de FUS, mas a difração e a reflexão do ultrassom podem ocorrer levando a perfis de pressão desiguais. Este protocolo não abrange o direcionamento de regiões corticais, pois será altamente dependente das espécies utilizadas; no entanto, algum direcionamento do córtex acima do hipocampo 7 (por exemplo, Figura 7) foi observado indicando que, pelo menos em camundongos, isso é possível.
A escolha de um ativador quimiogenético e a dosagem dependerão das necessidades experimentais específicas. Vários estudos, incluindo um dos autores7, não mostraram resposta inespecífica significativa39,40, enquanto doses maiores (por exemplo, 10 mg/kg) podem produzir efeitos colaterais, pelo menos em alguns casos41. No entanto, como em todos os experimentos comportamentais, controles adequados31 são essenciais devido à potencial atividade fora do alvo do CNO e seus metabólitos42. Tais controles poderiam incluir a administração de CNO e controles salinos a animais que expressam DREADDs e a administração de CNO a animais selvagens ou, em alguns casos específicos, uma comparação de sítios ipsi- e contralaterais do cérebro que, respectivamente, expressam e não expressam receptores quimiogenéticos. Além disso, pesquisas recentes revelaram uma série de novos agonistas DREADD com melhora da especificidade28,29,43. Outros receptores quimiogenéticos 5,25,44 também podem ser utilizados em conjunto com o procedimento ATAC.
A avaliação histológica da expressão gênica é necessária post-mortem para todos os animais. Uma pequena fração de animais apresenta expressão gênica pobre após FUS-BBBO7. Além disso, é necessário mostrar a acurácia espacial e a especificidade da expressão gênica, uma vez que o erro de direcionamento é possível. É importante ressaltar que alguns AAVs podem mostrar capacidade de rastreamento retrógrado ou anterógrado45 e podem causar transfecção longe do local alvo da ultrassonografia, apesar do direcionamento preciso por ultrassom. Se o receptor quimiogenético expresso for fundido ou co-expressar um fluoróforo, imagens do fluoróforo em cortes de tecido podem ser suficientes para avaliar a localização e a intensidade da expressão. No entanto, muitas proteínas fluorescentes são danificadas pelo processo de fixação tecidual, e a imunomarcação para a proteína mCherry, que é frequentemente usada com DREADDs, produziu melhor sinal em estudos anteriores7. Finalmente, devido à densidade de neurônios em certas partes do cérebro (por exemplo, camada de células granulares no hipocampo), o uso de fluoróforos localizados nuclearmente expressos sob IRES, em oposição a fusões, para realizar contagens de células pode ser benéfico, uma vez que os núcleos podem ser facilmente segmentados e contracorados com colorações nucleares, como DAPI ou TO-PRO-3. Avaliar a neuromodulação pela coloração c-Fos, realizando contracoloração nuclear e contagem de núcleos c-Fos positivos, ao invés de qualquer sinal de fluorescência, é imperativo. Em alguns casos, os detritos celulares podem mostrar fluorescência e confundir as medidas de células positivas.
As limitações da liberação da droga e do gene com FUS-BBBO incluem resolução mais baixa do que a administração com injeções intracranianas invasivas e a necessidade de maiores quantidades de drogas injetadas ou vetores virais. Além disso, enquanto uma injeção direta no cérebro resulta em entrega exclusiva em um local injetado, o FUS-BBBO usa uma via intravenosa resultando em possível entrega aos tecidos periféricos. As limitações do uso da quimiogenética para neuromodulação incluem uma escala de tempo lenta, que pode ser inadequada para alguns protocolos comportamentais que requerem mudanças rápidas na intensidade da neuromodulação.

O uso de tecnologias de neuromodulação circuito-específicas, como a optogenética1,2 e a quimiogenética 3,4,5, tem avançado nossa compreensão das condições psiquiátricas como transtornos do circuito neuronal. Os circuitos neuronais são difíceis de estudar e ainda mais difíceis de controlar no tratamento de distúrbios cerebrais porque são tipicamente definidos por tipos celulares específicos, regiões cerebrais, vias de sinalização molecular e tempo de ativação. Idealmente, tanto para aplicações clínicas quanto de pesquisa, esse controle seria exercido de forma não invasiva, mas alcançar uma neuromodulação precisa e não invasiva é um desafio. Por exemplo, embora as drogas neuroativas possam atingir o cérebro de forma não invasiva, elas carecem de especificidade espacial, agindo em todo o cérebro. Por outro lado, a estimulação elétrica profunda do cérebro pode controlar regiões cerebrais específicas, mas tem dificuldade em controlar tipos celulares específicos e requer cirurgia e colocação de dispositivos6.
A quimiogenética acusticamente direcionada7 (ATAC) fornece neuromodulação com especificidade espacial, celular e temporal. Ele combina três técnicas: abertura da barreira hematoencefálica induzida por ultrassom focalizado (FUS-BBBO) para direcionamento espacial, uso de vetores virais adenoassociados (AAVs) para entregar genes de forma não invasiva sob o controle de promotores específicos do tipo celular e receptores quimiogenéticos projetados para modular circuitos neurais transfectados seletivamente via administração de drogas. O FUS é uma tecnologia aprovada pela FDA que aproveita a capacidade do ultrassom de se concentrar profundamente nos tecidos, incluindo o cérebro humano, com precisão espacial milimétrica. Em alta potência, o USF é usado para ablação direcionada não invasiva, incluindo um tratamento aprovado pela FDA para tremor essencial8. O FUS-BBBO combina ultrassom de baixa intensidade com microbolhas administradas sistemicamente, que oscilam nos vasos sanguíneos no foco do ultrassom, resultando em abertura localizada, temporária (6-24 h) e reversível da BHE9. Essa abertura permite a entrega de proteínas 9,10, pequenas moléculas 11 e vetores virais7,12,13,14 ao cérebro sem danos teciduais significativos em roedores10 e primatas não humanos 15. Ensaios clínicos estão em andamento para o FUS-BBBO16,17, indicando possíveis aplicações terapêuticas dessa técnica.
A entrega de genes virais usando AAV também está avançando rapidamente para o uso clínico para distúrbios do SNC, com as recentes aprovações regulatórias da FDA e da UE como marcos importantes. Finalmente, receptores quimiogenéticos18, como os receptores Designer Activated Exclusive by Designer Drugs (DREADDs), são amplamente utilizados pelos neurocientistas para fornecer controle farmacológico sobre a excitação neuronal em animais transgênicos ou transfectados 19,20. DREADDs são receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que foram geneticamente modificados para responder a moléculas quimiogenéticas sintéticas em vez de ligantes endógenos, de modo que a administração sistêmica desses ligantes aumenta ou reduz a excitabilidade dos neurônios que expressam DREADD. Quando essas três tecnologias são combinadas em ATAC, elas podem ser usadas para a modulação não invasiva de circuitos neurais selecionados com precisão espacial, celular e temporal.
Aqui, expandimos e atualizamos um protocolo publicado anteriormente para o FUS-BBBO11 , incluindo metodologia para direcionamento preciso de regiões cerebrais com FUS-BBBO em camundongos usando equipamentos de segmentação impressos em 3D simples. Mostramos, também, uma aplicação do FUS-BBBO à ATAC. Mostramos as etapas necessárias para a liberação de AAVs portadores de receptores quimiogenéticos e a avaliação da expressão gênica e neuromodulação por histologia. Esta técnica é particularmente aplicável para atingir grandes ou múltiplas regiões cerebrais para expressão gênica ou neuromodulação. Por exemplo, uma ampla área de um córtex pode ser facilmente transduzida com FUS-BBBO e modulada usando quimiogenética. No entanto, a liberação gênica com uma técnica alternativa, as injeções intracranianas, exigiria um grande número de injeções invasivas e craniotomias. O FUS-BBBO e sua aplicação, ATAC, podem ser dimensionados para animais de diferentes tamanhos, onde as regiões cerebrais são maiores e mais difíceis de atingir invasivamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

A quimiogenética acusticamente direcionada (ATAC) permite o controle não invasivo de circuitos neurais específicos. A ATAC alcança esse controle por meio de uma combinação de abertura da barreira hematoencefálica induzida por ultrassom focalizado (FUS), entrega gênica com vetores virais adenoassociados (AAV) e ativação da sinalização celular com receptores proteicos quimiogenéticos e seus ligantes cognatos. Com o ATAC, é possível transduzir regiões cerebrais grandes e pequenas com precisão milimétrica usando uma única aplicação de ultrassom não invasiva. Essa transdução pode permitir mais tarde uma neuromodulação a longo prazo, não invasiva e livre de dispositivos em animais que se movem livremente usando uma droga. Uma vez que FUS-BBBO, AAVs e quimiogenética têm sido usados em vários animais, o ATAC também deve ser escalável para uso em outras espécies animais. Este artigo expande um protocolo publicado anteriormente e descreve como otimizar a entrega de genes com FUS-BBBO para pequenas regiões cerebrais com orientação por RM, mas sem a necessidade de um dispositivo FUS complicado compatível com RM. O protocolo também descreve o design de componentes de direcionamento e contenção de mouse que podem ser impressos em 3D por qualquer laboratório e podem ser facilmente modificados para diferentes espécies ou equipamentos personalizados. Para auxiliar na reprodutibilidade, o protocolo descreve detalhadamente como as microbolhas, os AAVs e a punção venosa foram utilizados no desenvolvimento da ATAC. Finalmente, um exemplo de dados é mostrado para orientar as investigações preliminares de estudos utilizando ATAC.

O primeiro passo da realização do protocolo ATAC é o direcionamento do FUS-BBBO para as regiões cerebrais desejadas. Por exemplo, seguindo o protocolo descrito, o hipocampo foi alvo com FUS-BBBO, e o agente de contraste e AAV9 carregando DREADDs foram injetados nos camundongos, seguido por uma sequência de RM FLASH 3D que adquire imagens do cérebro de camundongos. Um realce do sinal em T1 foi obtido na região hipocampal (Figura 6) e em outras partes do cérebro (Figura 7). Após várias semanas, DREADDs foram expressos dentro da região do cérebro alvo. Enquanto muitos DREADDs são fundidos a um repórter fluorescente (por exemplo, mCherry), o processo de perfusão e fixação com formaldeído foi encontrado para reduzir drasticamente a fluorescência dessas proteínas. A imunomarcação contra mCherry ou DREADD levou a uma detecção mais confiável da expressão (Figura 8) com base na experiência anterior. Em experimentos anteriores, ~85% dos camundongos mostraram expressão após FUS-BBBO7. Um teste simples para níveis suficientes de expressão de DREADDs é testar sua funcionalidade em um nível celular. Isso pode ser feito, por exemplo, fornecendo um ligante quimiogenético ou um controle salino, como CNO 19, descloroclozapina28 ou outros29, e aguardando 2 horas antes de uma perfusão e fixação cardíaca. As seções cerebrais foram então co-imunomarcadas para a proteína c-Fos30, que indica atividade aumentada dos neurônios, e para DREADD. O experimento foi considerado bem-sucedido se o local do cérebro alvo com DREADDs mostrasse um número significativamente maior de núcleos neuronais positivos para c-Fos no grupo que recebeu um ligante quimiogenético quando comparado ao grupo que recebeu solução salina7 ou comparado a um local contralateral que não foi submetido ao FUS-BBBO. É importante ressaltar que há um potencial para que alguns desses ligantes ativem neurônios não especificamente sem expressão de DREADDs. Por exemplo, foi demonstrado que o CNO é metabolizado em baixos níveis de clozapina em camundongos, que atravessa a BHE e ativa DREADDs com alta potência27. No entanto, também foi mostrado para se ligar a locais não específicos. Como em todo experimento, é fundamental incluir todos os controles adequados em estudos quimiogenéticos31. Um possível controle é a administração do ligante quimiogenético em camundongos selvagens, sem procedimentos, para excluir efeitos da droga isoladamente no ensaio comportamental ou histológico desejado. Outro controle poderia ser a inclusão de quatro grupos: DREADD + ligante, DREADD + veículo, EGFP + ligante, EGFP + veículo, o que explicará quaisquer efeitos potenciais tanto da liberação gênica com FUS-BBBO, quanto do ligante quimiogenético.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figura 1: Processo de direcionamento guiado por RM de FUS no ATAC. (a) Colocação do mouse com barras auriculares, um cone nasal e uma plataforma que pode ser encaixada dentro de um scanner de ressonância magnética. (b) Uma guia impressa em 3D (azul) visível na ressonância magnética foi fixada nas extremidades da estrutura da barra auricular e, em seguida, fixada no lugar com um suporte de uma bobina de ressonância magnética de superfície que contém quatro parafusos de encaixe (azul semitransparente). (c) Aparência do guia impresso em 3D em RM sagital (painel esquerdo), com uma parte inferior da representação virtual de um transdutor alinhado (semicírculo amarelo) com a parte inferior do guia. O painel direito mostra a aparência do guia impresso em 3D na RM a partir da visão coronal. O círculo brilhante foi feito de um material de suporte de polijato que tem um forte contraste de ressonância magnética. A cruz foi formada com plástico. Um círculo amarelo representa a localização do transdutor que foi alinhado concêntricamente com a guia dentro de um quadro estereotáxico. (d) Para atingir estruturas cerebrais, um transdutor virtual foi movido na direção z acima dos camundongos para corresponder à espessura de um cone/alojamento de ultrassom. Neste caso, devido à espessura do banho-maria, o transdutor foi movido 8,2 mm acima da guia para uma segmentação precisa. As estruturas cerebrais foram selecionadas usando dados de imagem de RM, e suas coordenadas de RM foram então anotadas e inseridas na máquina estereotáxica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figura 2: Interface do software utilizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figura 3: Processo de correspondência do espaço de coordenadas da RM com o instrumento estereotáxico. (a) Três orifícios dentro de um suporte do transdutor foram alinhados com três orifícios dentro da guia de RM, e três parafusos de mira cônicos foram inseridos sem causar flexão em todo o conjunto. (b) Idealmente, todos os três parafusos ficariam no centro dos buracos. (c) Se houver alguma imprecisão no alinhamento, nem todos os três parafusos se encaixariam, por exemplo, no caso de guinada pequena, provavelmente imperceptível de 1°, apenas um parafuso caberia enquanto os parafusos opostos ficariam presos no guia de ressonância magnética. Alternativamente, poderia haver flexão visível de todo o conjunto à medida que os parafusos eram forçados a passar. d) Vista alargada da montagem dos parafusos. Os parafusos devem ser colocados de forma concêntrica para a melhor precisão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figura 4: Redistribuição rápida das microbolhas no interior da seringa. (a) A seringa foi fotografada 5 s após a mistura. (b) Um minuto depois, havia uma camada claramente visível mostrando parte do concentrado de bolhas próximo ao topo da seringa de 1 mL de tuberculina. Este exemplo, em particular, usou uma solução de microbolhas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figura 5: Processo de colocação do centro de um transdutor sobre o centro de um guia de RM. (a) Nos modelos mostrados neste trabalho, o portador vermelho foi projetado para se mover 10,56 mm para frente da posição mostrada na Figura 3b, para uma posição mostrada aqui. (b) O guia de RM azul foi removido antes da sonicação, e um gel de ultrassom foi aplicado entre o camundongo e o transdutor (laranja) para garantir a passagem do ultrassom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figura 6: Visualização por RM da abertura da BBB. (a) Vista axial da abertura BBB. A área mais brilhante designada com uma ponta de seta mostra extravasamento de um agente de contraste T1 para RM. (b) Visão coronal do hipocampo dorsal e do córtex acima do hipocampo alvo com FUS-BBBO (cabeças de setas). (c) Visão coronal do hipocampo central alvo de FUS-BBBO (pontas de setas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figura 7: Exemplo de direcionamento de 4 locais cerebrais usando o sistema de segmentação de três parafusos descrito neste artigo. Áreas com pontas de setas mostraram locais abertos por BBB com difusão de contraste para RM. Os quatro sites foram alvo sucessivamente, com ~150 s entre cada abertura do BBB, de baixo para cima. A imagem foi tirada em até 2 minutos após a última abertura do BBB. A barra de escala é de 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Figura 8: Detecção da expressão DREADD.  (a) A imunomarcação para o fluoróforo ligado aos DREADDs, neste caso o mCherry foi um método confiável de detecção em alguns estudos. (b) Em outra seção representativa com DREADDs direcionados para o hipocampo usando as mesmas condições que em (a), a fluorescência de mCherry por si só produziu fundo forte e sinal relativamente fraco. (c) Como controle negativo, foi utilizado um camundongo que recebeu injeção sistêmica de AAV, mas não foi submetido ao FUS-BBBO. Nenhuma expressão significativa pode ser encontrada pela imunomarcação de mCherry. As barras de escala são de 500 mm. (Dados em a, c adaptados de7 com permissões, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Este protocolo delineia as etapas necessárias para a entrega gênica através da abertura da barreira hematoencefálica (BHE) por ultrassom focado, avaliação da expressão gênica resultante e mensuração da atividade neuromoduladora de receptores quimiogenéticos por meio de testes histológicos.

Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

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