Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Это исследование было поддержано Фондом мозга и поведения, NARSAD Young Investigator Award. Несколько компонентов, напечатанных на 3D-принтере, были первоначально разработаны Фабьеном Рабюссо (Fabien Rabusseau) (Image Guided Therapy, Франция). Автор благодарит Джона Хита (John Heath) и Маргарет Свифт (Margaret Swift) за техническую помощь в подготовке рукописи.

Отсутствие конфликта интересов.

ATAC требует успешного внедрения нескольких методов для успешной нейромодуляции конкретных нейронных цепей, включая точное нацеливание под контролем МРТ, FUS-BBBO и гистологическую оценку экспрессии генов. Компоненты, пригодные для 3D-печати, были разработаны для упрощения нацеливания на небольшие структуры мозга с помощью FUS-BBBO под визуальным контролем.
Проведение фокусированного ультразвука под контролем МРТ (МРТФУЗ) сопряжено с рядом проблем. Во-первых, типичная катушка МРТ имеет ограниченное пространство, которое предназначено только для размещения образца, а не ультразвукового оборудования. Большие отверстия МРТ увеличивают стоимость оборудования и снижают качество изображения, так как сигнал связан с коэффициентом заполнения катушки32. Следовательно, любое оборудование FUS, размещенное поверх изображения животного в МРТ, поставит под угрозу качество изображения. Во-вторых, разработка устройств, совместимых с МРТ, сложна и дорога. Материалы, совместимые с МРТ, должны быть диамагнитными, иметь низкую склонность к созданию вихревых токов при радиочастотном облучении и иметь низкую магнитную восприимчивость в сильных магнитных полях. В любом проводящем материале создание вихревых токов или его магнитная восприимчивость также отрицательно сказываются на качестве изображения. Наконец, доступные МРТ-совместимые материалы имеют более низкие модули Юнга и долговечность, чем металлы, обычно используемые в производстве аппаратов точного наведения, например, стереотаксических рамок. Двигатели, используемые для регулировки положения, должны быть совместимы с МРТ и располагаться за пределами отверстия МРТ из-за их размера. Эти двигатели должны быть подключены на расстоянии от датчика внутри отверстия МРТ с использованием материалов, совместимых с МРТ. Проблемы пластиковой деформации, отсутствие достаточного пространства внутри канала ствола для реализации компонентов прочного размера и недостаточное пространство для изменения положения прицеливания по всему мозгу повлияли на точность прицеливания в предыдущих работах.
Для решения этих проблем было принято решение о проведении визуализации в МРТ и введении FUS-BBBO вне сканера. Чтобы обеспечить МРТ-наведение, мышей поместили внутрь напечатанного на 3D-принтере фиксатора, который имел видимую для МРТ направляющую, которую можно было использовать для локализации структур мозга мыши как в МРТ, так и в пространстве координат стереотаксиса. Поскольку и череп мыши, и направляющая для наведения надежно прикреплены к держателям ушных планок (рис. 1, а, б), руководство по наведению может быть использовано для корреляции пространственных координат в изображении МРТ и обнуления стереотаксических инструментов. Фиксатор не имеет движущихся частей и не содержит датчика, что позволило сделать его прочным и достаточно маленьким для размещения внутри МРТ, а также устранило помехи сигнала от электроники датчика. Пространство внутри направляющей по наведению было выдолблено, так как на МРТ видна напечатанная на 3D-принтере опора для некоторых материалов (рис. 1c). Отверстия в сборке были введены для обеспечения калибровки стереотаксиса (рис. 3). Ультразвуковой преобразователь был прикреплен к электрододержателю стереотаксиса, и наведение осуществлялось, как описано в разделе 4 (рис. 1d). Преобразователь должен поддерживаться по всей длине корпусом ушных планок, предотвращая любое отклонение от плоскости уровня. Наведение в дорсо-вентральном направлении может быть достигнуто с помощью фазовых сдвигов в кольцевой решетке.
Практическая точность наведения определяется ультразвуковой фокусировкой и затуханием черепа. Процедура FUS-BBBO была подробно описана на крысах11 и была реализована на ряде других модельных организмов 23,33,34 и на людях 16,17. Зависимость между размером фокуса ультразвука обратно пропорциональна частоте, где более высокие частоты могут привести к более точной подаче. Однако затухание черепа увеличивается с частотами35, что может привести к нагреву черепа и повреждению кортикальных областей. Точная стратегия таргетинга будет зависеть от участка мозга. Участки, где в ткани мозга помещается половина максимального давления во всю ширину, позволяют предсказуемо и безопасно открывать ГЭБ во многих структурах мозга, таких как полосатое тело, средний мозг и гиппокамп. Области, расположенные вблизи основания мозга, представляют особую проблему у мышей. Мозг мыши имеет размеры примерно 8-10 мм в дорсо-вентральном направлении, что сопоставимо с половиной максимального размера многих коммерчески доступных датчиков. Следовательно, нацеливание на нижнюю часть черепа может привести к отражению ультразвука от костей и воздуха, присутствующего в ушных каналах, во рту или трахее, что может привести к непредсказуемым картинам высокого и низкого давления36. Некоторые из этих давлений могут пересекать порог инерционной кавитации, который, как было показано, вызывает кровотечение и повреждение тканей37. Для нацеливания на области, расположенные вблизи основания черепа, может быть предпочтительнее использовать интерсекциональный ATAC7, где интерсекционная генетика38 используется для ограничения экспрессии генов меньшей областью, чем та, на которую нацелен пучок FUS. В опубликованном примере интерсекционального ATAC трансгенное животное, экспрессирующее фермент редактирования генов (Cre38) в дофаминергических клетках, было направлено ультразвуком в подсекцию области, содержащей дофаминергические клетки. Наконец, ФУЗИ может воздействовать на кортикальные области, но дифракция и отражение ультразвука могут приводить к неравномерным профилям давления. Этот протокол не охватывает нацеливание на области коры головного мозга, так как он будет сильно зависеть от используемого вида; тем не менее, было обнаружено некоторое нацеливание на кору головного мозга над гиппокампом 7 (например, рис.7), что указывает на то, что, по крайней мере, у мышей, это возможно.
Выбор хемогенетического активатора и дозировка будут зависеть от конкретных потребностей эксперимента. В ряде исследований, в том числе в одном из исследований авторов7, не было выявлено значимого неспецифического ответа39,40, в то время как более высокие дозы (например, 10 мг/кг) могут вызывать побочные эффекты, по крайней мере, в некоторых случаях41. Однако, как и во всех поведенческих экспериментах, надлежащий контроль31 имеет важное значение из-за потенциальной нецелевой активности CNO и его метаболитов42. Такой контроль может включать введение CNO и физиологического раствора животным, экспрессирующим DREADD, и введение CNO животным дикого типа, или, в некоторых конкретных случаях, сравнение ипси- и контралатеральных участков мозга, которые, соответственно, экспрессируют и не экспрессируют хемогенетические рецепторы. Кроме того, недавние исследования выявили ряд новых агонистов DREADD с улучшенной специфичностью28,29,43. Другие хемогенетические рецепторы 5,25,44 также могут быть использованы в сочетании с процедурой ATAC.
Гистологическая оценка экспрессии генов необходима посмертно для каждого животного. Небольшая часть животных демонстрирует плохую экспрессию генов после FUS-BBBO7. Кроме того, необходимо показать пространственную точность и специфичность экспрессии генов, так как возможно неправильное нацеливание. Следует отметить, что некоторые ААВ могут демонстрировать ретроградную или антероградную способность к отслеживанию45 и могут вызывать трансфекцию вдали от участка, на который направлено ультразвуковое исследование, несмотря на точное ультразвуковое наведение. Если экспрессируемый хемогенетический рецептор сливается с флуорофором или совместно экспрессирует его, визуализации флуорофора в срезах ткани может быть достаточно для оценки локализации и интенсивности экспрессии. Тем не менее, многие флуоресцентные белки повреждаются в процессе фиксации тканей, и иммуноокрашивание для белка mCherry, которое часто используется с DREADD, дало лучший сигнал в предыдущих исследованиях7. Наконец, из-за плотности нейронов в определенных частях мозга (например, в слое зернистых клеток в гиппокампе), использование ядерно-локализованных флуорофоров, экспрессируемых при IRES, в отличие от слияний, для подсчета клеток может быть полезным, поскольку ядра могут быть легко сегментированы и окрашены ядерными красителями, такими как DAPI или TO-PRO-3. Для оценки нейромодуляции с помощью окрашивания c-Fos необходимо выполнить ядерное контрокрашивание и подсчет положительных ядер c-Fos, а не какого-либо флуоресцентного сигнала. В некоторых случаях клеточный мусор может проявлять флуоресценцию и искажать измерения положительных клеток.
Ограничения доставки лекарств и генов с помощью FUS-BBBO включают более низкое разрешение, чем при инвазивных внутричерепных инъекциях, и необходимость введения большего количества инъекционных препаратов или вирусных векторов. Кроме того, в то время как прямая инъекция в мозг приводит к исключительной доставке в место инъекции, FUS-BBBO использует внутривенный путь, что приводит к возможной доставке в периферические ткани. К ограничениям использования хемогенетики для нейромодуляции относится медленная временная шкала, которая может быть неадекватна некоторым поведенческим протоколам, требующим быстрых изменений интенсивности нейромодуляции.

Использование технологий нейромодуляции, специфичных для конкретных цепей, таких как оптогенетика1,2 и хемогенетика 3,4,5, продвинуло наше понимание психических состояний как расстройств нейрональной цепи. Нейронные цепи трудно изучать и еще труднее контролировать при лечении заболеваний головного мозга, потому что они, как правило, определяются конкретными типами клеток, областями мозга, молекулярными сигнальными путями и временем активации. В идеале, как для исследовательских, так и для клинических применений, такой контроль должен осуществляться неинвазивно, но достижение как точной, так и неинвазивной нейромодуляции является сложной задачей. Например, в то время как нейроактивные препараты могут достигать мозга неинвазивным путем, им не хватает пространственной специфичности, поскольку они действуют по всему мозгу. С другой стороны, электрическая глубокая стимуляция мозга может контролировать определенные области мозга, но имеет трудности с контролем определенных типов клеток и требует хирургического вмешательстваи установки устройства.
Акустически таргетная хемогенетика7 (ATAC) обеспечивает нейромодуляцию с пространственной, клеточной и временной специфичностью. Он сочетает в себе три метода: сфокусированное ультразвуковое индуцированное открытие гематоэнцефалического барьера (FUS-BBBO) для пространственного таргетирования, использование аденоассоциированных вирусных векторов (AAV) для неинвазивной доставки генов под контролем специфических промоторов клеточного типа и сконструированные хемогенетические рецепторы для селективной модуляции трансфицированных нейронных цепей путем введения лекарств. FUS — это одобренная FDA технология, которая использует способность ультразвука фокусироваться глубоко в тканях, включая мозг человека, с пространственной точностью до миллиметра. При высокой мощности ФУЗ используется для неинвазивной таргетной абляции, включая одобренное FDA лечение эссенциального тремора8. FUS-BBBO сочетает в себе низкоинтенсивный ультразвук с системно вводимыми микропузырьками, которые колеблются в кровеносных сосудах в фокусе ультразвука, что приводит к локализованному, временному (6-24 ч) и обратимому раскрытию ГЭБ9. Это отверстие позволяет доставлять белки9,10, малые молекулы 11 и вирусные векторы7,12,13,14 в мозг без значительного повреждения тканей грызунов 10 и нечеловекообразных приматов 15. В настоящее время продолжаются клинические испытания FUS-BBBO16,17, что указывает на возможное терапевтическое применение этой методики.
Доставка вирусных генов с помощью AAV также быстро продвигается в клиническое использование при заболеваниях ЦНС, а недавние одобрения FDA и регулирующих органов ЕС являются важными вехами. Наконец, хемогенетические рецепторы18, такие как рецепторы, активируемые исключительно дизайнерскими препаратами (DREADDs), широко используются нейробиологами для обеспечения фармакологического контроля над возбуждением нейронов у трансгенных или трансфицированных животных19,20. DREADD — это рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), которые были генетически модифицированы для реагирования на синтетические хемогетические молекулы, а не на эндогенные лиганды, так что системное введение этих лигандов увеличивает или снижает возбудимость нейронов, экспрессирующих DREADD. Когда эти три технологии объединены в ATAC, их можно использовать для неинвазивной модуляции выбранных нейронных цепей с пространственной, клеточной и временной точностью.
В этой статье мы расширяем и обновляем ранее опубликованный протокол для FUS-BBBO11 , включив в него методологию точного нацеливания на области мозга с помощью FUS-BBBO у мышей с использованием простого напечатанного на 3D-принтере оборудования для наведения. Мы также показываем применение FUS-BBBO в ATAC. Мы показываем шаги, необходимые для доставки AAV, несущих хемогетические рецепторы, а также для оценки экспрессии генов и нейромодуляции с помощью гистологии. Этот метод особенно применим для воздействия на большие или множественные области мозга для экспрессии генов или нейромодуляции. Например, обширная область коры головного мозга может быть легко трансдуцирована с помощью FUS-BBBO и модулирована с помощью хемогенетики. Тем не менее, доставка генов с помощью альтернативного метода, внутричерепных инъекций, потребует большого количества инвазивных инъекций и краниотомий. FUS-BBBO и его приложение, ATAC, могут быть масштабированы для животных разных размеров, где области мозга больше и труднее поддаются инвазивному воздействию.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

Акустически направленная хемогенетика (ATAC) позволяет осуществлять неинвазивный контроль над определенными нейронными цепями. ATAC достигает такого контроля за счет комбинации индуцированного гематоэнцефалического барьера (FUS-BBBO), индуцированного фокусированным ультразвуком (FUS-BBBO), доставки генов с помощью аденоассоциированных вирусных векторов (AAV) и активации клеточной сигнализации с помощью инженерных, хемогенетических, белковых рецепторов и их родственных лигандов. С помощью ATAC можно трансдуцировать как большие, так и маленькие участки мозга с точностью до миллиметра с помощью одного неинвазивного ультразвукового приложения. Эта трансдукция в дальнейшем может обеспечить длительную, неинвазивную, безаппаратную нейромодуляцию у свободно движущихся животных с помощью лекарственного препарата. Поскольку FUS-BBBO, AAV и хемогенетика использовались на нескольких животных, ATAC также должен быть масштабируемым для использования на других видах животных. Эта статья расширяет ранее опубликованный протокол и описывает, как оптимизировать доставку генов с помощью FUS-BBBO в небольшие участки мозга под контролем МРТ, но без необходимости использования сложного МРТ-совместимого устройства FUS. Протокол также описывает конструкцию компонентов наведения и удержания мыши, которые могут быть напечатаны на 3D-принтере в любой лаборатории и могут быть легко модифицированы для различных видов или специального оборудования. Для обеспечения воспроизводимости протокол подробно описывает, как микропузырьки, AAV и венепункция использовались при разработке ATAC. Наконец, приведен пример данных, которыми можно руководствоваться при проведении предварительных исследований с использованием ATAC.

Первым этапом выполнения протокола ATAC является нацеливание FUS-BBBO на нужные участки мозга. Например, в соответствии с описанным протоколом, в гиппокамп нацеливался FUS-BBBO, а мышам вводили контрастное вещество и AAV9, несущие DREADD, после чего проводилась FLASH 3D МРТ-последовательность, которая получала изображения мозга мыши. Усиление сигнала Т1 было достигнуто в области гиппокампа (рис. 6) и в других частях мозга (рис. 7). Через несколько недель внутри целевой области мозга экспрессировались DREADD. В то время как многие DREADD соединяются с флуоресцентным репортером (например, mCherry), было обнаружено, что процесс перфузии и фиксации формальдегидом резко снижает флуоресценцию этих белков. Иммуноокрашивание против mCherry или DREADD привело к более надежному выявлению экспрессии (рис. 8), основанному на предыдущем опыте. В предыдущих экспериментах ~85% мышей показали экспрессию после FUS-BBBO7. Простым тестом на достаточный уровень экспрессии DREADD является проверка их функциональности на клеточном уровне. Это можно сделать, например, путем введения хемогенетического лиганда или физиологического раствора, такого как CNO 19, дешлорозапин28 или другие29, и подождать 2 часа перед сердечной перфузией и фиксацией. Затем срезы головного мозга были совместно окрашены на белок c-Fos30, который указывает на повышенную активность нейронов, и на DREADD. Эксперимент считался успешным, если участок мозга, на который были нацелены DREADD, показывал значительно большее количество ядер нейронов, которые являются c-Fos положительными в группе, получавшей хемогенетический лиганд, по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор7, или по сравнению с контралатеральным участком, который не подвергался воздействию FUS-BBBO. Следует отметить, что некоторые из этих лигандов могут неспецифически активировать нейроны без экспрессии DREADD. Например, было показано, что CNO метаболизируется в низких уровнях клозапина у мышей, который проникает через ГЭБ и активирует DREADD с высокой активностью27. Тем не менее, было также показано, что он привязывается к неопределенным местам. Как и в любом эксперименте, крайне важно включить все надлежащие средства контроля в хемогенетические исследования31. Одним из возможных способов контроля является введение хемогенетического лиганда мышам дикого типа без процедур, чтобы исключить влияние только препарата на желаемый поведенческий или гистологический анализ. Другим контролем может быть включение четырех групп: DREADD + лиганд, DREADD + носитель, EGFP + лиганд, EGFP + транспортное средство, что будет учитывать любые потенциальные эффекты как доставки генов с помощью FUS-BBBO, так и хемогенетического лиганда.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Рисунок 1: Процесс наведения FUS под контролем МРТ в ATAC. (a) Размещение мыши с помощью ушных планок, носового конуса и платформы, которая может быть установлена внутри МРТ-сканера. (b) Напечатанный на 3D-принтере шаблон (синий), который виден на МРТ, был прикреплен к концам рамки ушной планки, а затем закреплен на месте держателем поверхностной катушки МРТ, содержащей четыре защелкивающихся болта (полупрозрачный синий). (c) Внешний вид напечатанного на 3D-принтере шаблона в сагиттальной МРТ (левая панель) с нижней частью виртуального изображения датчика, выровненной (желтый полукруг) с нижней частью проводника. На правой панели показан внешний вид напечатанного на 3D-принтере шаблона на МРТ с корональной проекции. Яркий круг был изготовлен из полиструйного поддерживающего материала, обладающего сильным МРТ-контрастом. Крест был сформирован пластиком. Желтый круг обозначает расположение преобразователя, которое было концентрически выровнено по направляющему внутри стереотаксической рамки. (d) Для воздействия на структуры мозга виртуальный датчик был перемещен в направлении z над мышами, чтобы соответствовать толщине ультразвукового конуса/корпуса. При этом из-за толщины водяной бани преобразователь был перемещен на 8,2 мм выше направляющей для точного наведения. Структуры головного мозга были выбраны с использованием данных МРТ-томографии, а затем их МРТ-координаты записывались и вводились в стереотаксическую машину. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Рисунок 2: Интерфейс используемого программного обеспечения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Рисунок 3: Процесс сопоставления координатного пространства МРТ со стереотаксическим прибором. (a) Три отверстия в держателе преобразователя были совмещены с тремя отверстиями в направляющей МРТ, и три конических болта наведения были вставлены, не вызывая изгиба всего узла. (b) В идеале все три болта должны располагаться в центре отверстий. (c) Если есть какая-либо неточность в выравнивании, не все три болта будут подходить, например, в случае небольшого, вероятно, незаметного рыскания 1° только один болт войдет в него, в то время как противоположные болты застрянут в направляющей МРТ. Кроме того, может наблюдаться видимый изгиб всей сборки при проталкивании болтов. (d) Увеличенный вид болтового крепления. Болты должны быть размещены концентрически для лучшей точности. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Рисунок 4: Быстрое перераспределение микропузырьков внутри шприца. а) Шприц был сфотографирован через 5 с после смешивания. (b) Через минуту был отчетливо виден слой, показывающий концентрат некоторых пузырьков в верхней части туберкулинового шприца объемом 1 мл. В этом примере, в частности, использовался раствор микропузырьков. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Рисунок 5: Процесс размещения центра датчика над центром проводника МРТ. (a) В моделях, показанных в этой статье, красная несущая была спроектирована таким образом, чтобы перемещаться на 10,56 мм вперед из положения, показанного на рисунке 3b, в положение, показанное здесь. (b) Синий направляющий для МРТ был удален перед ультразвуковой обработкой, и между мышью и датчиком был нанесен ультразвуковой гель (оранжевый) для обеспечения прохождения ультразвука. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Рисунок 6: МРТ-визуализация отверстия ГЭБ. (a) Осевой вид отверстия BBB. Более яркая область, обозначенная стрелкой, показывает экстравазацию контрастного вещества МРТТ1 . (b) Корональный вид дорсального гиппокампа и коры головного мозга над гиппокампом, направленный на FUS-BBBO (наконечники стрел). (c) Корональная проекция центрального гиппокампа с помощью FUS-BBBO (наконечники стрел). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Рисунок 7: Пример нацеливания на 4 участка мозга с использованием трехболтовой системы наведения, описанной в этой статье. На участках со стрелками были выявлены открытые участки ГЭБ с диффузией контрастного вещества для МРТ. Четыре участка были выбраны последовательно, с ~150 секундами между каждым открытием BBB, снизу вверх. Снимок был сделан в течение 2 минут после последнего вскрытия BBB. Масштабная линейка составляет 2 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Рисунок 8: Обнаружение экспрессии DREADD.  (a) Иммуноокрашивание флуорофора, прикрепленного к DREADD, в данном случае mCherry был надежным методом обнаружения в некоторых исследованиях. (b) В другой репрезентативной секции с DREADD, направленными на гиппокамп с использованием тех же условий, что и на рисунке (a), флуоресценция mCherry сама по себе производила сильный фон и относительно слабый сигнал. (c) В качестве отрицательного контроля использовали мышь, которая получала системную инъекцию AAV, но не подвергалась FUS-BBBO. При иммуноокрашивании mCherry не может быть обнаружена значительная экспрессия. Масштабные линейки составляют 500 мм. (Данные в a, c адаптированы из7 с разрешениями, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Этот протокол определяет шаги, необходимые для доставки гена через фокусированное ультразвуковое открытие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), оценку результирующей экспрессии генов и измерение нейромодуляционной активности хемогенетических рецепторов с помощью гистологических тестов.

Открытие гематоэнцефалического барьера с помощью фокусированного ультразвука для воздействия на структуры головного мозга и оценки хемогенетической нейромодуляции

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Высоким разрешением конфокальная томография Blood - brain барьер: Визуализация, 3D-реконструкции и количественной оценки Трансцитоз

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

В естественных условиях Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

В естественных условиях оценки разрушения гематоэнцефалический барьер в мышиной модели ишемического инсульта

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Бенчтоп Подход к местоположению Конкретный барьер мозга крови Открытие с помощью целенаправленного ультразвука в крысиной модели

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Высокой пропускной способностью изображения руководствуясь стереотаксической нейронавигации и целенаправленной ультразвуковой системы для гемовеленно-мозгового барьера Открытие у грызунов

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Целевая нейронная травма для неинвазивного отключения головной цепи

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Доставка антител в мозг с помощью сфокусированного сканирующего ультразвука

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Регистрация функциональной целостности барьера на клетках эндотелия сосудов bEnd.3 с помощью детектирования трансэндотелиального электрического сопротивления

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Реконструкция гематоэнцефалического барьера in vitro для моделирования и терапевтического воздействия на неврологические заболевания

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...