Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Cerebro y Comportamiento, Premio NARSAD al Investigador Joven. Varios componentes impresos en 3D fueron diseñados originalmente por Fabien Rabusseau (Terapia Guiada por Imágenes, Francia). El autor agradece a John Heath (Caltech) y Margaret Swift (Caltech) por su ayuda técnica en la preparación del manuscrito.

Sin conflicto de intereses.

ATAC requiere la implementación exitosa de varias técnicas para la neuromodulación exitosa de circuitos neuronales específicos, incluida la orientación precisa guiada por resonancia magnética, FUS-BBBO y la evaluación histológica de la expresión génica. Se desarrollaron componentes imprimibles en 3D para simplificar la focalización de pequeñas estructuras cerebrales con FUS-BBBO guiado por imágenes.
La administración de ultrasonido focalizado guiado por resonancia magnética (MRIgFUS, por sus siglas en inglés) plantea una serie de desafíos. En primer lugar, la bobina de resonancia magnética típica tiene un espacio limitado que está diseñado para acomodar solo una muestra y no el hardware de ultrasonido. Los orificios más grandes de las resonancias magnéticas aumentan el costo del equipo y disminuyen la calidad de la imagen, ya que la señal está relacionada con el factor de llenado de una bobina32. En consecuencia, cualquier hardware FUS colocado en la parte superior de una imagen animal en la resonancia magnética comprometerá la calidad de la imagen. En segundo lugar, el diseño de dispositivos compatibles con la resonancia magnética es difícil y costoso. Los materiales compatibles con la resonancia magnética deben ser diamagnéticos, tener una baja propensión a crear corrientes de Foucault durante la irradiación de radiofrecuencia y tener una baja susceptibilidad magnética en campos magnéticos altos. En cualquier material conductor, la creación de corrientes de Foucault o su susceptibilidad magnética también afectará negativamente a la calidad de la imagen. Por último, los materiales disponibles compatibles con la resonancia magnética tienen módulos de Young y durabilidad más bajos que los metales que se utilizan normalmente en la producción de máquinas de puntería precisa, por ejemplo, monturas estereotáxicas. Los motores utilizados para los ajustes de posición deben ser compatibles con la RMN y colocarse fuera del orificio de la RMN debido a su tamaño. Estos motores deben conectarse a distancia al transductor dentro de un orificio de resonancia magnética utilizando materiales compatibles con resonancia magnética. Los problemas de deformación del plástico, la falta de espacio suficiente dentro del orificio para implementar componentes de tamaño robusto y el espacio insuficiente para cambiar las posiciones de puntería en todo el cerebro han afectado a la precisión de la puntería en trabajos anteriores.
Para resolver estos problemas, se tomó la decisión de realizar imágenes en la RM y la administración de FUS-BBBO fuera del escáner. Para permitir la guía por resonancia magnética, los ratones se colocaron dentro de una restricción impresa en 3D que tenía una guía de orientación visible por resonancia magnética que podría usarse para localizar las estructuras cerebrales del ratón tanto en la resonancia magnética como en el espacio de coordenadas estereotasis. Dado que tanto el cráneo del ratón como la guía de orientación están firmemente sujetos a los soportes de la barra de la oreja (Figura 1 a, b), se puede utilizar una guía de orientación para correlacionar las coordenadas espaciales dentro de la imagen de resonancia magnética y poner a cero los instrumentos estereotáxicos. La restricción no tiene partes móviles y no contiene un transductor, lo que nos permitió hacerla robusta y lo suficientemente pequeña como para caber dentro de una resonancia magnética y eliminó la interferencia de la señal de la electrónica del transductor. El espacio dentro de la guía de orientación se ha vaciado, ya que el soporte impreso en 3D para algunos materiales es visible en la resonancia magnética (Figura 1c). Se introdujeron orificios en el conjunto para permitir la calibración estereográfica (Figura 3). El transductor de ultrasonido se conectó a un portaelectrodos de una estereotasa y la focalización se realizó como se describe en la sección 4 (Figura 1d). El transductor debe estar soportado a lo largo de su longitud por la carcasa de las barras de los oídos, evitando cualquier desviación del plano de nivel. La focalización en la dirección dorso-ventral se puede lograr utilizando desplazamientos de fase en una matriz anular.
La precisión práctica de la orientación está determinada por el enfoque ultrasónico y la atenuación del cráneo. El procedimiento FUS-BBBO se ha descrito en detalle para ratas 11 y se ha implementado en otros organismos modelo23,33,34 y en humanos 16,17. La relación entre el tamaño del foco de ultrasonido es inversamente proporcional a la frecuencia, donde las frecuencias más altas pueden dar lugar a una entrega más precisa. Sin embargo, la atenuación del cráneo aumenta con frecuencias35, lo que puede provocar calentamiento del cráneo y daños en las áreas corticales. La estrategia de focalización exacta dependerá del sitio del cerebro. Los sitios donde una presión media máxima de ancho completo encaja dentro del tejido cerebral permiten una apertura predecible y segura de la BHE en muchas estructuras cerebrales, como el cuerpo estriado, el mesencéfalo y el hipocampo. Las regiones cercanas a la base del cerebro plantean un desafío específico en ratones. El cerebro del ratón mide aproximadamente 8-10 mm en dirección dorso-ventral, lo que es comparable a la mitad del tamaño máximo de ancho completo de muchos transductores disponibles comercialmente. En consecuencia, apuntar a la parte inferior del cráneo puede conducir a la reflexión ultrasónica de los huesos y el aire presente en los canales auditivos, la boca o la tráquea, lo que puede conducir a patrones impredecibles de presiones altas y bajas36. Algunas de estas presiones pueden cruzar un umbral de cavitación inercial que se ha demostrado que causa hemorragias y daño tisular37. Para dirigirse a las regiones que se encuentran cerca de la base del cráneo, puede ser preferible utilizar el ATAC7 interseccional, donde la genética interseccional38 se utiliza para restringir la expresión génica a un área más pequeña que la que se dirige con el haz FUS. En el ejemplo publicado de ATAC interseccional, un animal transgénico que expresa una enzima de edición genética (Cre38) en células dopaminérgicas ha sido atacado con ultrasonido en la subsección de la región que contiene células dopaminérgicas. Por último, las regiones corticales pueden ser atacadas con FUS, pero la difracción y la reflexión de los ultrasonidos pueden producirse, lo que da lugar a perfiles de presión desiguales. Este protocolo no cubre la focalización de regiones corticales, ya que dependerá en gran medida de la especie utilizada; sin embargo, se ha observado cierta orientación de la corteza por encima del hipocampo 7 (por ejemplo, Figura 7), lo que indica que, al menos en ratones, es posible.
La elección de un activador quimiogenético y la dosificación dependerán de las necesidades experimentales específicas. Varios estudios, incluido uno de los estudios de los autores7, no mostraron una respuesta inespecífica significativa39,40, mientras que dosis más altas (p. ej., 10 mg/kg) pueden producir efectos secundarios, al menos en algunos casos41. Sin embargo, al igual que con todos los experimentos conductuales, los controles adecuados31 son esenciales debido a la posible actividad fuera del objetivo de CNO y sus metabolitos42. Dichos controles podrían incluir la administración de controles de CNO y solución salina a animales que expresen DREADD y la administración de CNO a animales de tipo salvaje o, en algunos casos específicos, una comparación de sitios ipsi y contralaterales del cerebro que expresan y no expresan receptores quimiogenéticos, respectivamente. Además, investigaciones recientes revelaron una serie de nuevos agonistas de DREADD con especificidad mejorada28,29,43. Otros receptores quimiogenéticos 5,25,44 también se pueden utilizar junto con el procedimiento ATAC.
La evaluación histológica de la expresión génica es necesaria post mortem para cada animal. Una pequeña fracción de los animales muestra una expresión génica deficiente después de FUS-BBBO7. Además, es necesario demostrar la precisión espacial y la especificidad de la expresión génica, ya que es posible que se dirijan mal. Cabe destacar que algunos AAV pueden mostrar una capacidad de rastreo retrógrada o anterógrada45 y pueden causar transfección lejos del sitio objetivo con ultrasonido a pesar de la precisión de la orientación del ultrasonido. Si el receptor quimiogenético expresado se fusiona con un fluoróforo o lo coexpresa, las imágenes del fluoróforo en secciones de tejido pueden ser suficientes para evaluar la localización y la intensidad de la expresión. Sin embargo, muchas proteínas fluorescentes son dañadas por el proceso de fijación tisular, y la inmunotinción para la proteína mCherry que se usa con frecuencia con DREADDs produjo una mejor señal en estudios previos7. Por último, debido a la densidad de neuronas en ciertas partes del cerebro (por ejemplo, la capa de células granulares en el hipocampo), el uso de fluoróforos localizados nuclearmente expresados en IRES, en lugar de fusiones, para realizar recuentos celulares puede ser beneficioso, ya que los núcleos pueden segmentarse fácilmente y contrateñirse con tinciones nucleares, como DAPI o TO-PRO-3. Para evaluar la neuromodulación mediante tinción de c-Fos, es imprescindible realizar la contratinción nuclear y contar los núcleos positivos de c-Fos, en lugar de cualquier señal de fluorescencia. En algunos casos, los desechos celulares pueden mostrar fluorescencia y confundir las mediciones de las células positivas.
Las limitaciones de la administración de fármacos y genes con FUS-BBBO incluyen una resolución más baja que la administración con inyecciones intracraneales invasivas y la necesidad de mayores cantidades de fármacos inyectados o vectores virales. Además, mientras que una inyección directa en el cerebro da como resultado una administración exclusiva en un sitio inyectado, FUS-BBBO utiliza una vía intravenosa que da como resultado una posible administración a los tejidos periféricos. Las limitaciones del uso de la quimiogenética para la neuromodulación incluyen una escala de tiempo lenta, que puede ser inadecuada para algunos protocolos conductuales que requieren cambios rápidos en la intensidad de la neuromodulación.

El uso de tecnologías de neuromodulación específicas de circuitos, como la optogenética1,2 y la quimiogenética 3,4,5, ha avanzado en nuestra comprensión de las afecciones psiquiátricas como trastornos del circuito neuronal. Los circuitos neuronales son difíciles de estudiar y aún más difíciles de controlar en el tratamiento de trastornos cerebrales porque generalmente se definen por tipos específicos de células, regiones cerebrales, vías de señalización molecular y tiempo de activación. Idealmente, tanto para la investigación como para las aplicaciones clínicas, dicho control se ejercería de forma no invasiva, pero lograr una neuromodulación precisa y no invasiva es un desafío. Por ejemplo, aunque los fármacos neuroactivos pueden llegar al cerebro de forma no invasiva, carecen de especificidad espacial al actuar en todo el cerebro. Por otro lado, la estimulación eléctrica cerebral profunda puede controlar regiones cerebrales específicas, pero tiene dificultades para controlar tipos específicos de células y requiere cirugíay colocación de dispositivos.
La quimiogenética acústicamente dirigida7 (ATAC) proporciona neuromodulación con especificidad espacial, de tipo celular y temporal. Combina tres técnicas: la apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado (FUS-BBBO) para la orientación espacial, el uso de vectores virales adenoasociados (AAV) para administrar genes de forma no invasiva bajo el control de promotores específicos del tipo de célula y receptores quimiogenéticos diseñados para modular los circuitos neuronales transfectados de forma selectiva mediante la administración de fármacos. FUS es una tecnología aprobada por la FDA que aprovecha la capacidad del ultrasonido para enfocarse profundamente dentro de los tejidos, incluido el cerebro humano, con precisión espacial milimétrica. A alta potencia, el FUS se utiliza para la ablación dirigida no invasiva, incluido un tratamiento aprobado por la FDA para el temblor esencial8. FUS-BBBO combina ultrasonidos de baja intensidad con microburbujas administradas sistémicamente, que oscilan en los vasos sanguíneos en el foco de ultrasonido, lo que resulta en una apertura localizada, temporal (6-24 h) y reversible de la BHE9. Esta apertura permite la entrega de proteínas9,10, moléculas pequeñas 11 y vectores virales7,12,13,14 al cerebro sin daño tisular significativo en roedores 10 y primates no humanos 15. Se están llevando a cabo ensayos clínicos para FUS-BBBO16,17, lo que indica posibles aplicaciones terapéuticas de esta técnica.
La administración de genes virales mediante AAV también está avanzando rápidamente hacia el uso clínico para los trastornos del SNC, con las recientes aprobaciones regulatorias de la FDA y la UE como hitos importantes. Por último, los receptores quimiogenéticos18, como los Receptores de Diseño Activados Exclusivamente por Fármacos de Diseño (DREADDs), son ampliamente utilizados por los neurocientíficos para proporcionar control farmacológico sobre la excitación neuronal en animales transgénicos o transfectados 19,20. Los DREADDs son receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) que han sido modificados genéticamente para responder a moléculas quimiogenéticas sintéticas en lugar de ligandos endógenos, de modo que la administración sistémica de estos ligandos aumenta o reduce la excitabilidad de las neuronas que expresan DREADD. Cuando estas tres tecnologías se combinan en ATAC, se pueden utilizar para la modulación no invasiva de circuitos neuronales seleccionados con precisión espacial, de tipo celular y temporal.
Aquí, ampliamos y actualizamos un protocolo previamente publicado para FUS-BBBO11 mediante la inclusión de una metodología para la orientación precisa de las regiones cerebrales con FUS-BBBO en ratones utilizando un equipo de orientación simple impreso en 3D. También mostramos una aplicación de FUS-BBBO a ATAC. Mostramos los pasos necesarios para la administración de AAVs portadores de receptores quimiogenéticos, y la evaluación de la expresión génica y la neuromodulación por histología. Esta técnica es particularmente aplicable para apuntar a regiones cerebrales grandes o múltiples para la expresión génica o la neuromodulación. Por ejemplo, un área amplia de una corteza puede ser fácilmente transducida con FUS-BBBO y modulada usando quimiogenética. Sin embargo, la administración de genes con una técnica alternativa, las inyecciones intracraneales, requeriría un gran número de inyecciones invasivas y craneotomías. FUS-BBBO y su aplicación, ATAC, se pueden escalar a animales de diferentes tamaños, donde las regiones del cerebro son más grandes y más difíciles de atacar de forma invasiva.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

La quimiogenética acústicamente dirigida (ATAC) permite el control no invasivo de circuitos neuronales específicos. ATAC logra dicho control a través de una combinación de apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado (FUS) (FUS-BBBO), la administración de genes con vectores virales adenoasociados (AAV) y la activación de la señalización celular con receptores de proteínas quimiogenéticos y sus ligandos afines. Con ATAC, es posible transducir regiones cerebrales grandes y pequeñas con precisión milimétrica utilizando una sola aplicación de ultrasonido no invasivo. Esta transducción puede permitir posteriormente una neuromodulación a largo plazo, no invasiva y sin dispositivos en animales que se mueven libremente utilizando un fármaco. Dado que FUS-BBBO, AAV y quimiogenética se han utilizado en múltiples animales, ATAC también debería ser escalable para su uso en otras especies animales. Este artículo amplía un protocolo publicado anteriormente y describe cómo optimizar la entrega de genes con FUS-BBBO a pequeñas regiones del cerebro con guía por resonancia magnética, pero sin necesidad de un complicado dispositivo FUS compatible con resonancia magnética. El protocolo, también, describe el diseño de los componentes de orientación y restricción de ratones que pueden ser impresos en 3D por cualquier laboratorio y pueden ser fácilmente modificados para diferentes especies o equipos personalizados. Para ayudar a la reproducibilidad, el protocolo describe en detalle cómo se utilizaron las microburbujas, los AAV y la venopunción en el desarrollo de ATAC. Finalmente, se muestran datos de ejemplo para guiar las investigaciones preliminares de los estudios que utilizan ATAC.

El primer paso para realizar el protocolo ATAC es dirigir el FUS-BBBO a las regiones cerebrales deseadas. Por ejemplo, siguiendo el protocolo descrito, el hipocampo se atacó con FUS-BBBO, y se inyectó en los ratones un agente de contraste y AAV9 portador de DREADD, seguido de una secuencia de resonancia magnética 3D FLASH que adquiere imágenes del cerebro del ratón. Se logró una mejora de la señal T1 en la región del hipocampo (Figura 6) y en otras partes del cerebro (Figura 7). Después de varias semanas, los DREADDs se expresaron dentro de la región del cerebro objetivo. Si bien muchos DREADD se fusionan con un indicador fluorescente (por ejemplo, mCherry), se descubrió que el proceso de perfusión y fijación con formaldehído reduce drásticamente la fluorescencia de estas proteínas. La inmunotinción contra mCherry o el DREADD condujo a una detección más fiable de la expresión (Figura 8) basada en la experiencia previa. En experimentos anteriores, ~85% de los ratones mostraron expresión siguiendo FUS-BBBO7. Una prueba sencilla para determinar los niveles suficientes de expresión de los DREADD es comprobar su funcionalidad a nivel celular. Se puede hacer, por ejemplo, proporcionando un ligando quimiogenético o un control salino, como CNO 19, descloroclozapina28 u otros29, y esperando 2 horas antes de una perfusión y fijación cardíaca. A continuación, las secciones cerebrales se inmunodescribieron conjuntamente para la proteína c-Fos30, que indica una mayor actividad de las neuronas, y para DREADD. El experimento se consideró exitoso si el sitio del cerebro atacado con DREADDs mostró un número significativamente mayor de núcleos neuronales que son c-Fos positivos en el grupo que recibió un ligando quimiogenético en comparación con el grupo que recibió solución salina7 o en comparación con un sitio contralateral que no fue sometido a FUS-BBBO. Cabe destacar que existe la posibilidad de que algunos de estos ligandos activen neuronas de forma no específica sin expresión de DREADDs. Por ejemplo, se ha demostrado que el CNO se metaboliza en niveles bajos de clozapina en ratones, que atraviesa la barrera hematoencefálica y activa los DREADD con alta potencia27. Sin embargo, también se demostró que se unía a ubicaciones no específicas. Como en todos los experimentos, es fundamental incluir todos los controles adecuados en los estudios quimiogenéticos31. Un posible control es la administración del ligando quimiogenético a ratones de tipo salvaje, sin procedimientos, para excluir los efectos del fármaco solo en el ensayo conductual o histológico deseado. Otro control podría ser la inclusión de cuatro grupos: ligando DREADD +, DREADD + vehículo, EGFP + ligando, EGFP + vehículo, que tendrán en cuenta cualquier efecto potencial tanto de la entrega génica con FUS-BBBO como del ligando quimiogenético.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figura 1: El proceso de focalización guiada por resonancia magnética de la FUS en ATAC. (a) Colocación del ratón con barras en las orejas, un cono en la nariz y una plataforma que pueda caber dentro de un escáner de resonancia magnética. (b) Una guía impresa en 3D (azul) que es visible en la resonancia magnética se fijó a los extremos del marco de la barra de la oreja y luego se aseguró en su lugar con un soporte de una bobina de resonancia magnética de superficie que contiene cuatro pernos a presión (azul semitransparente). (c) Apariencia de la guía impresa en 3D en la resonancia magnética sagital (panel izquierdo), con una parte inferior de la representación virtual de un transductor alineada (semicírculo amarillo) con la parte inferior de la guía. El panel derecho muestra la apariencia de la guía impresa en 3D en la resonancia magnética desde la vista coronal. El círculo brillante estaba hecho de un material de soporte de polijet que tiene un fuerte contraste de resonancia magnética. La cruz se formó con plástico. Un círculo amarillo representa la ubicación del transductor que se alineó concéntricamente con la guía dentro de un marco estereotáxico. (d) Para apuntar a las estructuras cerebrales, se movió un transductor virtual en dirección z por encima de los ratones para que conotara el grosor de un cono / carcasa de ultrasonido. En este caso, debido al grosor del baño de agua, el transductor se movió 8,2 mm por encima de la guía para apuntar con precisión. Las estructuras cerebrales se seleccionaron utilizando datos de imágenes de resonancia magnética, y sus coordenadas de resonancia magnética se escribieron y se introdujeron en la máquina estereotáxica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figura 2: Interfaz del software utilizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figura 3: Proceso de coincidencia del espacio de coordenadas de la RM con el instrumento estereotáxico. (a) Se alinearon tres orificios dentro de un soporte de transductor con tres orificios dentro de la guía de resonancia magnética, y se insertaron tres pernos de orientación cónicos sin causar flexión en todo el conjunto. (b) Idealmente, los tres pernos se ubicarían en el centro de los agujeros. (c) Si hay alguna imprecisión en la alineación, no encajarían los tres pernos, por ejemplo, en caso de guiñada pequeña y probablemente imperceptible de 1°, solo encajaría un perno mientras que los pernos opuestos se atascarían en la guía de resonancia magnética. Alternativamente, podría haber una flexión visible de todo el conjunto a medida que se forzaran los pernos. d) Ampliación de la vista del ajuste de los pernos. Los pernos deben colocarse concéntricamente para obtener la mejor precisión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figura 4: Redistribución rápida de microburbujas dentro de la jeringa. (a) La jeringa fue fotografiada 5 s después de la mezcla. (b) Un minuto después, había una capa claramente visible que mostraba algunas de las burbujas concentradas cerca de la parte superior de la jeringa de tuberculina de 1 mL. En este ejemplo, en particular, se utilizó una solución de microburbujas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figura 5: Proceso de colocación del centro de un transductor sobre el centro de una guía de resonancia magnética. (a) En los modelos que se muestran en este documento, el portador rojo ha sido diseñado para moverse 10,56 mm hacia adelante desde la posición que se muestra en la Figura 3b, a la que se muestra aquí. (b) Se retiró la guía azul de RM antes de la sonicación y se aplicó un gel de ultrasonido entre el ratón y el transductor (naranja) para asegurar el paso de la ecografía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figura 6: Visualización por resonancia magnética de la abertura de la BHE. (a) Vista axial de la abertura de la BBB. El área más brillante designada con una punta de flecha muestra la extravasación de un agente de contraste T1 de RMN. (b) Vista coronal del hipocampo dorsal y la corteza por encima del hipocampo apuntado con FUS-BBBO (puntas de flecha). (c) Vista coronal del hipocampo central apuntado con FUS-BBBO (puntas de flecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figura 7: Ejemplo de focalización de 4 sitios cerebrales utilizando el sistema de focalización de tres pernos descrito en este artículo. Las áreas con puntas de flecha mostraron sitios abiertos de BHE con difusión de un agente de contraste para RMN. Los cuatro sitios fueron atacados en sucesión, con ~150 s entre cada abertura BBB, de abajo hacia arriba. La imagen fue tomada dentro de los 2 minutos posteriores a la última apertura de BBB. La barra de escala es de 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Figura 8: Detección de la expresión TEDR.  (a) La inmunotinción para el fluoróforo unido a los DREADDs, en este caso mCherry fue un método fiable de detección en algunos estudios. (b) En otra sección representativa con DREADDs dirigidos al hipocampo utilizando las mismas condiciones que en (a), la fluorescencia de mCherry por sí sola produjo un fondo fuerte y una señal relativamente débil. (c) Como control negativo, se utilizó un ratón que recibió una inyección sistémica de AAV, pero que no se sometió a FUS-BBBO. No se puede encontrar una expresión significativa mediante la inmunotinción de mCherry. Las barras de escala son de 500 mm. (Datos en a, c adaptados de7 con permisos, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Este protocolo delinea los pasos necesarios para la administración de genes a través de la apertura de la barrera hematoencefálica (BBB) por ultrasonido focalizado, la evaluación de la expresión génica resultante y la medición de la actividad de neuromodulación de los receptores quimiogenéticos a través de pruebas histológicas.

Apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado para dirigirse a las estructuras cerebrales y evaluar la neuromodulación quimiogenética

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Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registro de la integridad funcional de la barrera en las células endoteliales vasculares bEnd.3 mediante detección de resistencia eléctrica transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...