Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Denna forskning stöddes av Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Flera 3D-printade komponenter designades ursprungligen av Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrike). Författaren tackar John Heath (Caltech) och Margaret Swift (Caltech) för teknisk hjälp med att förbereda manuskriptet.

Ingen intressekonflikt.

ATAC kräver framgångsrik implementering av flera tekniker för framgångsrik neuromodulering av specifika neurala kretsar, inklusive noggrann MRI-styrd målinriktning, FUS-BBBO och histologisk utvärdering av genuttryck. 3D-printbara komponenter utvecklades för att förenkla målsökning av små hjärnstrukturer med bildstyrd FUS-BBBO.
Administration av MRI-styrt fokuserat ultraljud (MRIgFUS) innebär ett antal utmaningar. För det första har typisk MR-spole begränsat utrymme som är utformat för att endast rymma ett prov och inte ultraljudshårdvaran. De större borrningarna i MRI ökar kostnaden för utrustning och minskar bildkvaliteten, eftersom signalen är relaterad till fyllnadsfaktorn för en spole32. Följaktligen kommer all FUS-hårdvara som placeras ovanpå en djurbild i MRT att äventyra bildkvaliteten. För det andra är det svårt och dyrt att designa MRI-kompatibla enheter. MRT-kompatibla material måste vara diamagnetiska, ha låg benägenhet att skapa virvelströmmar under radiofrekvent bestrålning och ha låg magnetisk känslighet i höga magnetfält. I alla ledande material kommer skapandet av virvelströmmar eller dess magnetiska känslighet också att påverka bildkvaliteten negativt. Slutligen har de tillgängliga MRI-kompatibla materialen lägre Youngs moduli och hållbarhet än de metaller som vanligtvis används vid tillverkning av precisionsmålsökningsmaskiner, t.ex. stereotaktiska ramar. Motorerna som används för positionsjusteringar måste vara MR-kompatibla och placerade utanför MR-hålet på grund av sin storlek. Dessa motorer måste anslutas på avstånd till givaren inuti ett MR-hål med hjälp av MRI-kompatibla material. Problem med plastskevhet, brist på tillräckligt med utrymme inuti hålet för att implementera robust dimensionerade komponenter och otillräckligt utrymme för att ändra målpositionerna över hela hjärnan har påverkat målsökningsnoggrannheten i tidigare arbete.
För att lösa dessa problem togs ett beslut om att utföra avbildning i MR och FUS-BBBO-administrering utanför skannern. För att möjliggöra MRI-vägledning placerades mössen i en 3D-printad fasthållning som hade en MRI-synlig målinriktningsguide som kunde användas för att lokalisera mushjärnstrukturerna både i MRT och i stereotax-koordinatrymden. Eftersom både musskallen och inriktningsguiden är ordentligt fastsatta på öronstångshållare (Figur 1a,b), kan en målinriktningsguide användas för att korrelera rumsliga koordinater inom MRT-bilden och nollställa de stereotaktiska instrumenten. Fasthållningsanordningen har inga rörliga delar och innehåller ingen givare, vilket gjorde det möjligt för oss att göra den både robust och tillräckligt liten för att passa in i en MR och tog bort signalstörningar från givarens elektronik. Utrymmet inuti målguiden har urholkats eftersom det 3D-printade stödet för vissa material är synligt i MRT (Figur 1c). Hål i enheten infördes för att möjliggöra stereoskattekalibrering (figur 3). Ultraljudsgivaren fästes på en elektrodhållare för en stereoskatt och inriktningen utfördes enligt beskrivningen i avsnitt 4 (figur 1d). Givaren bör stödjas längs sin längd med hölje av öronstänger, vilket förhindrar avvikelser från nivåplanet. Inriktningen i dorso-ventral riktning kan uppnås med hjälp av fasförskjutningar i en ringformig matris.
Den praktiska målprecisionen bestäms av ultraljudsfokusering och dämpning av skallen. FUS-BBBO-proceduren har beskrivits i detalj för råttor 11 och har implementerats i ett antal andra modellorganismer23,33,34 och i människor 16,17. Förhållandet mellan ultraljudsfokusstorlek omvänt proportionellt mot frekvensen, där högre frekvenser kan resultera i mer exakt leverans. Dämpningen av skallen ökar dock med frekvenserna35 vilket kan leda till att skallen värms upp och att de kortikala områdena skadas. Den exakta inriktningsstrategin beror på hjärnans plats. De platser där ett fullt bredd halvt maximalt tryck passar in i hjärnvävnaden möjliggör förutsägbar och säker BBB-öppning i många hjärnstrukturer som striatum, mitthjärnan och hippocampus. Regioner nära hjärnans bas utgör en särskild utmaning hos möss. Mushjärnan mäter cirka 8-10 mm i dorso-ventral riktning, vilket är jämförbart med den maximala storleken på många kommersiellt tillgängliga givare. Följaktligen kan inriktning på botten av skallen leda till ultraljudsreflektion från benen och luften som finns i hörselgångarna, munnen eller luftstrupen, vilket kan leda till oförutsägbara mönster av högt och lågt tryck36. Vissa av dessa tryck kan passera en tröghetskavitationströskel som har visat sig orsaka blödning och vävnadsskada37. För att rikta in sig på regioner som ligger nära skallbasen kan det vara att föredra att använda intersektionell ATAC7, där intersektionell genetik38 används för att begränsa genuttrycket till ett mindre område än det som är måltavla för FUS-strålen. I det publicerade exemplet med intersektionell ATAC har ett transgent djur som uttrycker ett genredigeringsenzym (Cre38) i dopaminerga celler riktats mot ultraljud i den del av regionen som innehåller dopaminerga celler. Slutligen kan de kortikala regionerna riktas mot FUS, men diffraktion och reflektion av ultraljud kan förekomma vilket leder till ojämna tryckprofiler. Detta protokoll omfattar inte inriktning på kortikala regioner eftersom det kommer att vara starkt beroende av de arter som används. En viss inriktning av cortex ovanför hippocampus 7 (t.ex. figur 7) har dock observerats, vilket tyder på att det är möjligt åtminstone hos möss.
Valet av en kemogenetisk aktivator och dosering beror på de specifika experimentella behoven. Ett antal studier, inklusive en av författarnas studier7, visade inget signifikant icke-specifikt svar39,40, medan högre doser (t.ex. 10 mg/kg) kan ge biverkningar, åtminstone i vissa fall41. Men som med alla beteendeexperiment är korrekta kontroller31 viktiga på grund av potentiell off-target-aktivitet av CNO och dess metaboliter42. Sådana kontroller kan innefatta administrering av CNO- och saltlösningskontroller till djur som uttrycker DREADDs och administrering av CNO till vildtypsdjur eller, i vissa specifika fall, en jämförelse av ipsi- och kontralaterala platser i hjärnan som uttrycker respektive inte uttrycker kemogenetiska receptorer. Dessutom avslöjade ny forskning ett antal nya DREADD-agonister med förbättrad specificitet28,29,43. Andra kemogenetiska receptorer 5,25,44 kan också användas i samband med ATAC-proceduren.
Histologisk utvärdering av genuttryck är nödvändig efter döden för varje djur. En liten andel av djuren uppvisar dåligt genuttryck efter FUS-BBBO7. Dessutom är det nödvändigt att visa den rumsliga noggrannheten och specificiteten av genuttryck eftersom felinriktning är möjlig. Observera att vissa AAV:er kan visa retrograd eller anterograd spårningsförmåga45 och kan orsaka transfektion långt från den plats som är riktad med ultraljud trots korrekt ultraljudsinriktning. Om den uttryckta kemogenetiska receptorn är sammansmält med eller samuttrycker en fluorofor, kan avbildning av fluoroforen i vävnadssnitt vara tillräcklig för att utvärdera lokalisering och uttrycksintensitet. Många fluorescerande proteiner skadas dock av vävnadsfixeringsprocessen, och immunfärgning för mCherry-protein som ofta används med DREADDs gav bättre signal i tidigarestudier7. Slutligen, på grund av tätheten av neuroner i vissa delar av hjärnan (t.ex. granulärt cellager i hippocampus), kan det vara fördelaktigt att använda nutydligt lokaliserade fluoroforer uttryckta under IRES, i motsats till fusioner, för att utföra cellräkningar eftersom kärnor lätt kan segmenteras och motfärgas med kärnfärgningar, såsom DAPI eller TO-PRO-3. För att utvärdera neuromodulering genom c-Fos-färgning är det absolut nödvändigt att utföra nukleär motfärgning och räkna c-Fos-positiva kärnor, snarare än någon fluorescenssignal. I vissa fall kan cellulärt skräp visa fluorescens och förvirra mätningarna av positiva celler.
Begränsningar av läkemedlet och genleveransen med FUS-BBBO inkluderar lägre upplösning än tillförsel med invasiva intrakraniella injektioner och behovet av större mängder injicerade läkemedel eller virala vektorer. Dessutom, medan en direkt injektion i hjärnan resulterar i exklusiv tillförsel till ett injicerat ställe, använder FUS-BBBO en intravenös väg som resulterar i möjlig leverans till perifera vävnader. Begränsningar med att använda kemogenetik för neuromodulering inkluderar en långsam tidsskala, vilket kan vara otillräckligt för vissa beteendeprotokoll som kräver snabba förändringar i intensiteten av neuromodulering.

Användning av kretsspecifika neuromodulationstekniker, såsom optogenetik1,2 och kemogenetik 3,4,5, har ökat vår förståelse av psykiatriska tillstånd som neuronala kretsstörningar. Neuronala kretsar är svåra att studera och ännu svårare att kontrollera vid behandling av hjärnsjukdomar eftersom de vanligtvis definieras av specifika celltyper, hjärnregioner, molekylära signalvägar och tidpunkt för aktivering. Idealet för både forskning och kliniska tillämpningar är att sådan kontroll utövas icke-invasivt, men att uppnå både exakt och icke-invasiv neuromodulering är en utmaning. Till exempel, medan neuroaktiva läkemedel kan nå hjärnan icke-invasivt, saknar de rumslig specificitet genom att verka i hela hjärnan. Å andra sidan kan elektrisk djup hjärnstimulering kontrollera specifika hjärnregioner men har svårt att kontrollera specifika celltyper och kräver operation och placeringav enheten 6.
Akustiskt riktad kemogenetik7 (ATAC) ger neuromodulering med rumslig, celltyps- och tidsspecificitet. Den kombinerar tre tekniker: fokuserad ultraljudsinducerad blod-hjärnbarriäröppning (FUS-BBBO) för rumslig inriktning, användning av adenoassocierade virala vektorer (AAV) för att icke-invasivt leverera gener under kontroll av celltypsspecifika promotorer och konstruerade kemogenetiska receptorer för att modulera transfekterade neurala kretsar selektivt via läkemedelsadministrering. FUS är en FDA-godkänd teknik som drar nytta av ultraljudets förmåga att fokusera djupt inne i vävnader, inklusive den mänskliga hjärnan, med millimeter rumslig precision. Vid hög effekt används FUS för icke-invasiv riktad ablation, inklusive en FDA-godkänd behandling för essentiell tremor8. FUS-BBBO kombinerar lågintensivt ultraljud med systemiskt administrerade mikrobubblor, som oscillerar i blodkärlen vid ultraljudsfokus, vilket resulterar i lokaliserad, tillfällig (6-24 timmar) och reversibel öppning av BBB9. Denna öppning möjliggör leverans av proteiner 9,10, små molekyler11 och virala vektorer 7,12,13,14 till hjärnan utan betydande vävnadsskador hos gnagare 10 och icke-mänskliga primater 15. Kliniska prövningar pågår för FUS-BBBO16,17, vilket indikerar möjliga terapeutiska tillämpningar av denna teknik.
Viral genleverans med hjälp av AAV avancerar också snabbt till klinisk användning för CNS-sjukdomar, med de senaste FDA- och EU-godkännandena som viktiga milstolpar. Slutligen används kemogenetiska receptorer18, såsom designerreceptorer som aktiveras uteslutande av designerdroger (DREADDs), i stor utsträckning av neuroforskare för att ge farmakologisk kontroll över neuronal excitation hos transgena eller transfekterade djur19,20. DREADDs är G-proteinkopplade receptorer (GPCR) som har modifierats genetiskt för att svara på syntetiska kemogenetiska molekyler snarare än endogena ligander, så att systemisk administrering av dessa ligander ökar eller minskar excitabiliteten hos DREADD-uttryckande neuroner. När dessa tre tekniker kombineras till ATAC kan de användas för icke-invasiv modulering av utvalda neurala kretsar med rumslig, celltyp och tidsmässig precision.
Här utökar och uppdaterar vi ett tidigare publicerat protokoll för FUS-BBBO11 genom att inkludera metodik för noggrann målsökning av hjärnregioner med FUS-BBBO i möss med hjälp av enkel 3D-printad målsökningsutrustning. Vi visar också en tillämpning av FUS-BBBO på ATAC. Vi visar steg som är nödvändiga för leverans av AAVs som bär kemogenetiska receptorer, och utvärdering av genuttryck och neuromodulering genom histologi. Denna teknik är särskilt användbar för att rikta in sig på stora eller flera hjärnregioner för genuttryck eller neuromodulering. Till exempel kan ett stort område av en cortex enkelt transduceras med FUS-BBBO och moduleras med hjälp av kemogenetik. Genleverans med en alternativ teknik, intrakraniella injektioner, skulle dock kräva ett stort antal invasiva injektioner och kraniotomier. FUS-BBBO och dess tillämpning, ATAC, kan skalas till djur av olika storlekar, där hjärnregionerna är större och svårare att rikta in sig på invasivt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

Akustiskt riktad kemogenetik (ATAC) möjliggör icke-invasiv kontroll av specifika neurala kretsar. ATAC uppnår sådan kontroll genom en kombination av fokuserat ultraljud (FUS) inducerad blod-hjärnbarriäröppning (FUS-BBBO), genleverans med adenoassocierade virala (AAV) vektorer och aktivering av cellulär signalering med konstruerade, kemogenetiska proteinreceptorer och deras besläktade ligander. Med ATAC är det möjligt att transducera både stora och små hjärnregioner med millimeterprecision med hjälp av en enda icke-invasiv ultraljudsapplikation. Denna transduktion kan senare möjliggöra en långsiktig, icke-invasiv, enhetsfri neuromodulering hos fritt rörliga djur med hjälp av ett läkemedel. Eftersom FUS-BBBO, AAV och kemogenetik har använts på flera djur bör ATAC också vara skalbart för användning i andra djurarter. Denna artikel bygger vidare på ett tidigare publicerat protokoll och beskriver hur man kan optimera genleveransen med FUS-BBBO till små hjärnregioner med MRI-vägledning men utan behov av en komplicerad MRI-kompatibel FUS-enhet. Protokollet beskriver också utformningen av musinriktnings- och fasthållningskomponenter som kan 3D-printas av vilket laboratorium som helst och enkelt kan modifieras för olika arter eller anpassad utrustning. För att underlätta reproducerbarheten beskriver protokollet i detalj hur mikrobubblor, AAV och venpunktion användes i ATAC-utvecklingen. Slutligen visas ett exempel på data för att vägleda de preliminära undersökningarna av studier som använder ATAC.

Det första steget i att utföra ATAC-protokollet är att rikta FUS-BBBO till de önskade hjärnregionerna. Till exempel, enligt det beskrivna protokollet, riktades hippocampus mot FUS-BBBO, och kontrastmedel och AAV9-bärande DREADDs injicerades i mössen, följt av en FLASH 3D MRI-sekvens som tar bilder av mushjärnan. En förstärkning av T1-signalen uppnåddes i hippocampusregionen (Figur 6) och i andra delar av hjärnan (Figur 7). Efter flera veckor uttrycktes DREADDs i målhjärnregionen. Medan många DREADDs är sammansmälta med en fluorescerande reporter (t.ex. mCherry), visade sig perfusionsprocessen och fixering med formaldehyd drastiskt minska fluorescensen hos dessa proteiner. Immunfärgning mot mCherry eller DREADD ledde till en mer tillförlitlig detektion av uttrycket (Figur 8) baserat på tidigare erfarenheter. I tidigare experiment visade ~85 % av mössen uttryck efter FUS-BBBO7. Ett enkelt test för tillräckliga nivåer av uttryck av DREADDs är att testa deras funktionalitet på cellulär nivå. Det kan till exempel göras genom att tillhandahålla en kemogenetisk ligand eller en saltlösningskontroll, såsom CNO 19, desklorklozapin28 eller andra 29, och vänta 2 timmar innan en hjärtperfusion och fixering. Hjärnsnitten var sedan co-immunfärgade för c-Fos protein30, vilket indikerar ökad aktivitet hos nervceller, och för DREADD. Experimentet ansågs vara framgångsrikt om den del av hjärnan som var föremål för DREADDs visade signifikant högre antal neuronala kärnor som är c-Fos-positiva i gruppen som fick en kemogenetisk ligand jämfört med gruppen som fick saltlösning7 eller jämfört med en kontralateral plats som inte utsattes för FUS-BBBO. Värt att notera är att det finns en potential för vissa av dessa ligander att aktivera neuroner icke-specifikt utan uttryck av DREADDs. Till exempel har CNO visat sig metaboliseras till låga nivåer av klozapin hos möss, som korsar BBB och aktiverar DREADDs med hög potens27. Men det visade sig också binda till icke-specifika platser. Som i alla experiment är det viktigt att inkludera alla korrekta kontroller i kemogenetiska studier31. En möjlig kontroll är administrering av den kemogenetiska liganden till vildtypsmöss, utan procedurer, för att utesluta effekter av läkemedlet ensamt på den önskade beteendemässiga eller histologiska analysen. En annan kontroll skulle kunna vara inkludering av fyra grupper: DREADD + ligand, DREADD + vehikel, EGFP + ligand, EGFP + vehikel, som kommer att ta hänsyn till eventuella effekter av både genleverans med FUS-BBBO och den kemogenetiska liganden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figur 1: Processen för MRT-styrd målsökning av FUS i ATAC. a) Musplacering med öronspärrar, en noskon och en plattform som kan monteras inuti en MR-skanner. (b) En 3D-printad guide (blå) som är synlig i MRT fästes i ändarna av öronbågens ram och säkrades sedan på plats med en hållare av en yt-MRT-spole som innehåller fyra snäppbultar (halvtransparent blå). (c) Utseende av den 3D-printade guiden i sagittal MRT (vänster panel), med en botten av den virtuella representationen av en givare i linje (gul halvcirkel) med botten av guiden. Den högra panelen visar utseendet på den 3D-printade guiden på MR från koronavy. Den ljusa cirkeln tillverkades av ett polyjet-stödmaterial som har en stark MR-kontrast. Korset formades av plast. En gul cirkel representerar givarens placering som var i linje koncentriskt med styrningen inuti en stereotaktisk ram. (d) För att rikta in sig på hjärnstrukturer flyttades en virtuell givare i z-riktning ovanför mössen för att matcha tjockleken på en ultraljudskon/hölje. I det här fallet, på grund av vattenbadets tjocklek, flyttades givaren 8,2 mm ovanför guiden för exakt inriktning. Hjärnstrukturerna valdes ut med hjälp av MRI-bilddata, och deras MRI-koordinater skrevs sedan ner och matades in i den stereotaktiska maskinen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figur 2: Gränssnitt för den programvara som används. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figur 3: Process för matchning av MRT-koordinatrummet till stereotaktiskt instrument. (a) Tre hål i en givarhållare var i linje med tre hål i MRT-guiden, och tre koniska målbultar sattes in utan att orsaka böjning av hela enheten. (b) Helst skulle alla tre bultarna sitta i mitten av hålen. (c) Om det finns någon oprecision i inriktningen skulle inte alla tre bultarna passa in, t.ex. vid liten, sannolikt omärklig gir på 1°, skulle endast en bult passa in medan de motsatta bultarna skulle sitta fast vid MRT-guiden. Alternativt kunde det finnas synlig flex i hela enheten när bultar pressades igenom. (d) Förstorad vy av bultmontering. Bultarna bör placeras koncentriskt för bästa noggrannhet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figur 4: Snabb omfördelning av mikrobubblor i sprutan. (a) Sprutan fotograferades 5 sekunder efter blandning. b) En minut senare syntes ett tydligt skikt som visade en del av bubbelkoncentratet nära toppen av en 1 ml tuberkulinspruta. I det här exemplet användes särskilt en lösning av mikrobubblor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figur 5: Process för att placera mitten av en givare över ett centrum av en MRT-guide. (a) I de modeller som visas i detta dokument har den röda bäraren konstruerats för att röra sig 10,56 mm framåt från den position som visas i figur 3b till en position som visas här. (b) Den blå MRT-guiden togs bort före ultraljudsbehandling, och en ultraljudsgel applicerades mellan musen och givaren (orange) för att säkerställa ultraljudspassage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figur 6: MRT-visualisering av BBB-öppningen. a) Axiell bild av BBB-öppningen. Ett ljusare område med en pilspets visar extravasering av ett MRT T1-kontrastmedel . (b) Koronabild av dorsala hippocampus och cortex ovanför hippocampus riktad med FUS-BBBO (pilspetsar). (c) Koronabild av den centrala hippocampus riktad med FUS-BBBO (pilspetsar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figur 7: Exempel på inriktning på 4 hjärnställen med hjälp av det trebultade målsökningssystemet som beskrivs i det här dokumentet. Områden med pilspetsar visade att BBB öppnade platser med diffusion av ett MRT-kontrastmedel. De fyra platserna riktades in sig på varandra i följd, med ~150 s mellan varje BBB-öppning, från botten till toppen. Bilden är tagen inom 2 min efter den sista BBB-öppningen. Skalstrecket är 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Bild 8: Identifiering av DREADD-uttryck.  a) Immunfärgning av fluoroforen på dreadd, i detta fall mCherry, var en tillförlitlig detektionsmetod i vissa studier. (b) I ett annat representativt avsnitt med DREADDs riktade mot hippocampus med samma betingelser som i (a), gav fluorescensen av mCherry i sig stark bakgrund och relativt svag signal. c) Som en negativ kontroll användes en mus som fick systemisk injektion av AAV, men som inte genomgick FUS-BBBO. Inget signifikant uttryck kan hittas genom mCherry immunfärgning. Skalstrecken är 500 mm. (Data i a, c anpassad från7 med tillstånd, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Detta protokoll beskriver steg som är nödvändiga för genleveransen genom fokuserad öppning av blod-hjärnbarriären (BBB) med ultraljud, utvärdering av det resulterande genuttrycket och mätning av neuromoduleringsaktivitet hos kemogenetiska receptorer genom histologiska tester.

Fokuserad ultraljudsinducerad blod-hjärnbarriäröppning för att rikta in sig på hjärnstrukturer och utvärdera kemogenetisk neuromodulering

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Högupplösta Confocal avbildning av den Blood - brain barriären: bildbehandling, 3D rekonstruktion och kvantifiering av transcytos

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjärnbarriären permeabilitet test på möss med Fluorescently märkt spårämnen

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

En In Vivo -bedömning av blod - hjärnbarriären störningar i en råtta modell av ischemisk Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

En bänktop till den platsspecifika blodhjärnbarriäröppningen med fokuserat ultraljud i en råttmodell

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Ett bildstyrt stereotaktiskt neuronavigation med hög genomströmning och fokuserat ultraljudssystem för öppning av blod- hjärnbarriärer hos gnagare

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Riktade neuronal skada för icke-invasiv frånkoppling av brain circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Leverans av antikroppar i hjärnan med hjälp av fokuserad skanning ultraljud

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registrering av barriärfunktionell integritet på bEnd.3 vaskulära endotelceller via transendotelial elektrisk motståndsdetektering

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Rekonstruktion av blod-hjärnbarriären in vitro för att modellera och terapeutiskt rikta in sig på neurologiska sjukdomar

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...