Name: focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Bu araştırma Beyin ve Davranış Vakfı, NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü ile desteklenmiştir. Birkaç 3D baskılı bileşen orijinal olarak Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Fransa) tarafından tasarlanmıştır. Yazar, makalenin hazırlanmasında teknik yardım için John Heath (Caltech) ve Margaret Swift'e (Caltech) teşekkür eder.

Çıkar çatışması yok.

ATAC, doğru MRI kılavuzluğunda hedefleme, FUS-BBBO ve gen ekspresyonunun histolojik değerlendirmesi dahil olmak üzere belirli nöral devrelerin başarılı nöromodülasyonu için çeşitli tekniklerin başarılı bir şekilde uygulanmasını gerektirir. Görüntüleme kılavuzluğunda FUS-BBBO ile küçük beyin yapılarının hedeflenmesini basitleştirmek için 3D yazdırılabilir bileşenler geliştirildi.
MRG kılavuzluğunda odaklanmış ultrason (MRIgFUS) uygulaması bir takım zorluklar ortaya çıkarmaktadır. İlk olarak, tipik MRI bobini, ultrason donanımını değil, yalnızca bir numuneyi barındıracak şekilde tasarlanmış sınırlı alana sahiptir. MRI'ların daha büyük delikleri, sinyal bir bobinin32 doldurma faktörü ile ilgili olduğundan, ekipman maliyetini artırır ve görüntü kalitesini düşürür. Sonuç olarak, MRG'de bir hayvan görüntüsünün üstüne yerleştirilen herhangi bir FUS donanımı, görüntüleme kalitesinden ödün verecektir. İkincisi, MRI uyumlu cihazlar tasarlamak zor ve pahalıdır. MR uyumlu malzemelerin diyamanyetik olması, radyofrekans ışınlaması sırasında girdap akımı oluşturma eğiliminin düşük olması ve yüksek manyetik alanlarda düşük manyetik duyarlılığa sahip olması gerekir. Herhangi bir iletken malzemede, girdap akımlarının oluşması veya manyetik duyarlılığı da görüntüleme kalitesini olumsuz yönde etkileyecektir. Son olarak, mevcut MRI uyumlu malzemeler, stereotaksik çerçeveler gibi hassas hedefleme makinelerinin üretiminde tipik olarak kullanılan metallerden daha düşük Young modülüne ve dayanıklılığına sahiptir. Konumsal ayarlamalar için kullanılan motorların MRG uyumlu olması ve boyutlarından dolayı MRG deliğinin dışına yerleştirilmesi gerekir. Bu motorlar, MRI uyumlu malzemeler kullanılarak bir MRI deliği içindeki dönüştürücüye belirli bir mesafede bağlanmalıdır. Plastik çarpıtma sorunları, sağlam boyutlu bileşenleri uygulamak için deliğin içinde yeterli alan olmaması ve tüm beyin boyunca hedefleme pozisyonlarını değiştirmek için yetersiz alan, önceki çalışmalarda hedefleme doğruluğunu etkilemiştir.
Bu sorunları çözmek için MRG ve FUS-BBBO uygulamasında görüntülemenin tarayıcı dışında yapılmasına karar verildi. MRI rehberliğine izin vermek için fareler, fare beyin yapılarını hem MRG'de hem de stereotax koordinat alanında lokalize etmek için kullanılabilecek MRI ile görünür bir hedefleme kılavuzuna sahip 3D baskılı bir kısıtlamanın içine yerleştirildi. Hem fare kafatası hem de hedefleme kılavuzu kulak çubuğu tutucularına sıkıca tutturulduğundan (Şekil 1a,b), MRI görüntüsündeki uzamsal koordinatları ilişkilendirmek ve stereotaksik aletleri sıfırlamak için bir hedefleme kılavuzu kullanılabilir. Kısıtlamanın hareketli parçaları yoktur ve bir dönüştürücü içermez, bu da onu hem sağlam hem de bir MRI'nın içine sığacak kadar küçük hale getirmemize izin verdi ve dönüştürücünün elektroniğinden sinyal parazitini ortadan kaldırdı. Bazı materyaller için 3D baskılı destek MRG'de görülebildiği için hedefleme kılavuzunun içindeki boşluk oyulmuştur (Şekil 1c). Stereotax kalibrasyonunu sağlamak için düzenekte delikler açıldı (Şekil 3). Ultrason dönüştürücüsü, bir stereotaksın bir elektrot tutucusuna bağlandı ve hedefleme, bölüm 4'te açıklandığı gibi gerçekleştirildi (Şekil 1d). Dönüştürücü, düz düzlemden herhangi bir sapmayı önleyecek şekilde, kulak çubuklarının muhafazası ile uzunluğu boyunca desteklenmelidir. Dorso-ventral yönde hedefleme, dairesel bir dizide faz kaymaları kullanılarak elde edilebilir.
Pratik hedefleme hassasiyeti, ultrason odaklama ve kafatası zayıflaması ile belirlenir. FUS-BBBO prosedürü sıçanlarda 11 ayrıntılı olarak tanımlanmıştır ve bir dizi başka model organizmada23,33,34 ve insanlarda 16,17 uygulanmıştır. Ultrason odak boyutu arasındaki ilişki, frekansla ters orantılıdır, burada daha yüksek frekanslar daha hassas teslimatla sonuçlanabilir. Bununla birlikte, kafatasının zayıflaması, kafatasının ısınmasına ve kortikal alanlarda hasara yol açabilecek35 frekanslarıyla artar. Kesin hedefleme stratejisi beyin bölgesine bağlı olacaktır. Beyin dokusu içinde tam genişlikte yarım maksimum basıncın sığdığı bölgeler, striatum, orta beyin ve hipokampus gibi birçok beyin yapısında öngörülebilir ve güvenli BBB açılmasına izin verir. Beynin tabanına yakın bölgeler farelerde özel bir zorluk teşkil eder. Fare beyni, dorso-ventral yönde yaklaşık 8-10 mm'dir, bu da piyasada bulunan birçok dönüştürücünün tam genişlikte yarı maksimum boyutuyla karşılaştırılabilir. Sonuç olarak, kafatasının dibini hedeflemek, kulak kanallarında, ağızda veya nefes borusunda bulunan kemiklerden ve havadan ultrason yansımasına yol açabilir ve bu da öngörülemeyen yüksek ve düşük basınç modellerine yol açabilir36. Bu basınçların bazıları, kanamaya ve doku hasarına neden olduğu gösterilen bir atalet kavitasyon eşiğini geçebilir37. Kafatasının tabanına yakın bölgeleri hedeflemek için, kesişimsel genetik38'in gen ekspresyonunu FUS ışını ile hedeflenenden daha küçük bir alanla sınırlamak için kullanıldığı kesişimsel ATAC7'nin kullanılması tercih edilebilir. Yayınlanmış kesişimsel ATAC örneğinde, dopaminerjik hücrelerde bir gen düzenleme enzimini (Cre38) eksprese eden transgenik bir hayvan, dopaminerjik hücrelerin bulunduğu bölgenin alt bölümünde ultrason ile hedeflenmiştir. Son olarak, kortikal bölgeler FUS ile hedeflenebilir, ancak ultrasonun kırınımı ve yansıması meydana gelebilir ve bu da eşit olmayan basınç profillerine yol açabilir. Bu protokol, kullanılan türlere büyük ölçüde bağımlı olacağından kortikal bölgelerin hedeflenmesini kapsamaz; bununla birlikte, hipokampus 7'nin üzerindeki korteksin bir miktar hedeflendiği gözlemlenmiştir (örneğin, Şekil 7), en azından farelerde bunun mümkün olduğunu göstermektedir.
Kemogenetik aktivatör seçimi ve dozlama, spesifik deneysel ihtiyaçlara bağlı olacaktır. Yazarların çalışmalarından biri de dahil olmak üzere bir dizi çalışma7, önemli bir spesifik olmayan yanıtgöstermedi 39,40, daha yüksek dozlar (ör., 10 mg / kg) en azından bazı durumlarda41 yan etkilere neden olabilir. Bununla birlikte, tüm davranışsal deneylerde olduğu gibi, CNO ve metabolitlerinin42 potansiyel hedef dışı aktivitesi nedeniyle uygun kontroller31 gereklidir. Bu tür kontroller, DREADD'leri eksprese eden hayvanlara CNO ve salin kontrollerinin uygulanmasını ve CNO'nun vahşi tip hayvanlara uygulanmasını veya bazı özel durumlarda, sırasıyla kemogenetik reseptörleri eksprese eden ve eksprese etmeyen beynin ipsi ve kontralateral bölgelerinin karşılaştırılmasını içerebilir. Ek olarak, son araştırmalar, geliştirilmiş özgüllüğe sahip bir dizi yeni DREADD agonistiortaya çıkardı 28,29,43. Diğer kemogenetik reseptörler 5,25,44 de ATAC prosedürü ile birlikte kullanılabilir.
Gen ekspresyonunun histolojik değerlendirmesi, her hayvan için ölüm sonrası gereklidir. Hayvanların küçük bir kısmı, FUS-BBBO7'yi takiben zayıf gen ekspresyonu gösterir. Ek olarak, yanlış hedefleme mümkün olduğundan, gen ekspresyonunun uzamsal doğruluğunu ve özgüllüğünü göstermek gerekir. Bazı AAV'ler retrograd veya anterograd izleme yeteneği45 gösterebilir ve doğru ultrason hedeflemesine rağmen ultrason ile hedeflenen bölgeden uzakta transfeksiyona neden olabilir. Eksprese edilen kemogenetik reseptör bir floroforla kaynaşmışsa veya birlikte eksprese ediyorsa, doku kesitlerinde floroforun görüntülenmesi, ekspresyonun lokalizasyonunu ve yoğunluğunu değerlendirmek için yeterli olabilir. Bununla birlikte, birçok floresan proteini doku fiksasyon işlemi tarafından hasar görür ve DREADD'lerle sıklıkla kullanılan mCherry proteini için immün boyama, önceki çalışmalarda daha iyi sinyal vermiştir7. Son olarak, beynin belirli bölgelerindeki nöronların yoğunluğu nedeniyle (örneğin, hipokampustaki granüler hücre tabakası), hücre sayımlarını gerçekleştirmek için füzyonların aksine, IRES altında eksprese edilen nükleer lokalize floroforların kullanılması faydalı olabilir, çünkü çekirdekler DAPI veya TO-PRO-3 gibi nükleer lekelerle kolayca bölümlere ayrılabilir ve karşı boyanabilir. Nöromodülasyonu c-Fos boyama ile değerlendirmek için, herhangi bir floresan sinyali yerine nükleer karşı boyama yapmak ve c-Fos pozitif çekirdeklerini saymak zorunludur. Bazı durumlarda, hücresel kalıntılar floresan gösterebilir ve pozitif hücrelerin ölçümlerini karıştırabilir.
FUS-BBBO ile ilaç ve gen iletiminin sınırlamaları, invaziv intrakraniyal enjeksiyonlarla verilenden daha düşük çözünürlüğü ve daha büyük miktarlarda enjekte edilen ilaçlara veya viral vektörlere olan ihtiyacı içerir. Ek olarak, beyne doğrudan enjeksiyon, enjekte edilen bir bölgeye özel bir iletimle sonuçlanırken, FUS-BBBO, periferik dokulara olası bir iletimle sonuçlanan intravenöz bir yol kullanır. Nöromodülasyon için kemogenetik kullanımının sınırlamaları, nöromodülasyonun yoğunluğunda hızlı değişiklikler gerektiren bazı davranışsal protokoller için yetersiz olabilecek yavaş bir zaman ölçeğini içerir.

Optogenetik 1,2 ve kemogenetik 3,4,5 gibi devreye özgü nöromodülasyon teknolojilerinin kullanımı, nöronal devre bozuklukları olarak psikiyatrik durumları anlamamızı sağlamıştır. Nöronal devrelerin incelenmesi zordur ve beyin bozukluklarının tedavisinde kontrol edilmesi daha da zordur, çünkü tipik olarak belirli hücre tipleri, beyin bölgeleri, moleküler sinyal yolları ve aktivasyon zamanlaması ile tanımlanırlar. Hem araştırma hem de klinik uygulamalar için ideal olarak, bu tür bir kontrol noninvaziv olarak uygulanacaktır, ancak hem kesin hem de noninvaziv nöromodülasyon elde etmek zordur. Örneğin, nöroaktif ilaçlar beyne noninvaziv olarak ulaşabilirken, beyin boyunca hareket ederek uzamsal özgüllükten yoksundurlar. Öte yandan, elektriksel derin beyin stimülasyonu belirli beyin bölgelerini kontrol edebilir, ancak belirli hücre tiplerini kontrol etmekte zorlanır ve ameliyat ve cihaz yerleştirme gerektirir6.
Akustik Hedefli Kemogenetik7 (ATAC), uzamsal, hücre tipi ve zamansal özgüllük ile nöromodülasyon sağlar. Üç tekniği birleştirir: uzamsal hedefleme için odaklanmış ultrason kaynaklı kan-beyin bariyeri açma (FUS-BBBO), hücre tipine özgü promotörlerin kontrolü altında genleri noninvaziv olarak iletmek için adeno ilişkili viral vektörlerin (AAV'ler) kullanımı ve transfekte edilmiş nöral devreleri ilaç uygulaması yoluyla seçici olarak modüle etmek için tasarlanmış kemogenetik reseptörler. FUS, ultrasonun insan beyni de dahil olmak üzere dokuların derinliklerine milimetre uzamsal hassasiyetle odaklanma yeteneğinden yararlanan FDA onaylı bir teknolojidir. Yüksek güçte FUS, esansiyel tremor8 için FDA onaylı bir tedavi de dahil olmak üzere noninvaziv hedefli ablasyon için kullanılır. FUS-BBBO, düşük yoğunluklu ultrasonu, ultrason odağında kan damarlarında salınan sistemik olarak uygulanan mikro kabarcıklarla birleştirir ve BBB9'un lokalize, geçici (6-24 saat) ve geri dönüşümlü açılmasına neden olur. Bu açıklık, kemirgenlerde10 ve insan olmayan primatlarda 15 önemli doku hasarı olmadan proteinlerin 9,10, küçük moleküllerin 11 ve viral vektörlerin7,12,13,14 beyne iletilmesine izin verir. FUS-BBBO16,17 için klinik çalışmalar devam etmekte olup, bu tekniğin olası terapötik uygulamalarını göstermektedir.
AAV kullanılarak viral gen iletimi, CNS bozuklukları için klinik kullanıma doğru hızla ilerlemektedir ve son FDA ve AB düzenleyici onayları önemli kilometre taşları olarak kabul edilmektedir. Son olarak, yalnızca Tasarımcı İlaçlar Tarafından Aktive Edilen Tasarımcı Reseptörleri (DREADD'ler) gibi kemogenetik reseptörler18, sinirbilimciler tarafından transgenik veya transfekte edilmiş hayvanlarda nöronal uyarılma üzerinde farmakolojik kontrol sağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır19,20. DREADD'ler, endojen ligandlardan ziyade sentetik kemogenetik moleküllere yanıt vermek üzere genetik olarak tasarlanmış G proteinine bağlı reseptörlerdir (GPCR'ler), öyle ki bu ligandların sistemik uygulaması, DREADD eksprese eden nöronların uyarılabilirliğini arttırır veya azaltır. Bu üç teknoloji ATAC'ta birleştirildiğinde, seçilen nöral devrelerin uzamsal, hücre tipi ve zamansal hassasiyetle noninvaziv modülasyonu için kullanılabilirler.
Burada, basit 3D baskılı hedefleme ekipmanı kullanarak farelerde FUS-BBBO ile beyin bölgelerinin doğru hedeflenmesi için metodolojiyi dahil ederek FUS-BBBO11 için daha önce yayınlanmış bir protokolü genişletiyor ve güncelliyoruz. Ayrıca, FUS-BBBO'nun ATAC'a bir uygulamasını da gösteriyoruz. Kemogenetik reseptörleri taşıyan AAV'lerin verilmesi ve gen ekspresyonunun ve nöromodülasyonun histoloji ile değerlendirilmesi için gerekli adımları gösteriyoruz. Bu teknik, özellikle gen ekspresyonu veya nöromodülasyon için büyük veya çoklu beyin bölgelerini hedeflemek için geçerlidir. Örneğin, bir korteksin geniş bir alanı FUS-BBBO ile kolayca transdüksiyon yapılabilir ve kemogenetik kullanılarak modüle edilebilir. Bununla birlikte, alternatif bir teknik olan intrakraniyal enjeksiyonlarla gen iletimi, çok sayıda invaziv enjeksiyon ve kraniotomi gerektirecektir. FUS-BBBO ve uygulaması ATAC, beyin bölgelerinin daha büyük ve invaziv olarak hedeflenmesinin daha zor olduğu farklı boyutlardaki hayvanlara ölçeklendirilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="873">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">21-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14826C</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">25-gauge butterfly catheter</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Bioscience</td>
			<td>725966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">30-gauge needles (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14826F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Absorbent blue pad</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>902406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-c-Fos antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:161px;">SC-253-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Anti-mCherry antibody</td>
			<td style="width:173px;">Thermofisher</td>
			<td>PA534974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Bruker Biospec 70/30</td>
			<td style="width:173px;">Bruker</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>includes the RF coils</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clozapine-n-oxide</td>
			<td style="width:173px;">Tocris</td>
			<td style="width:161px;">4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td>download from szablowskilab.org/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Custom MRIgFUS machine</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Definity microbubbles</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">DE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Degassed aquasonic/ultrasound gel</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>5067714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Depilation cr&#232;me</td>
			<td style="width:173px;">Nair</td>
			<td style="width:161px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Eight-element annular array transducer</td>
			<td style="width:173px;">Imasonic Inc.</td>
			<td style="width:161px;">custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Office Depot</td>
			<td>599893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heparin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Ketamine</td>
			<td style="width:173px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:161px;">07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:265px;">Neutral buffered formalin (10%)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Optical fiber hydrophone</td>
			<td style="width:173px;">Precision Acoustics</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">PE10 tubing</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC1513314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>524650-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Prohance contrast agent</td>
			<td style="width:173px;">Bracco</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Saline</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9054335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti goat</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Secondary antibody, Donkey-anti rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">84546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Surgical scissors (straight)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>17467480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">ThermoGuide Software</td>
			<td style="width:173px;">ImageGuidedTherapy</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tissue glue (Gluture)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC9855218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">VeroClear 3D printable material</td>
			<td style="width:173px;">Stratasys</td>
			<td style="width:161px;">RGD810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vialmix microbubble activation device</td>
			<td style="width:173px;">Lantheus</td>
			<td style="width:161px;">VMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Vibrating microtome</td>
			<td style="width:173px;">Compresstome</td>
			<td style="width:161px;">VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Xylazine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound induced blood-brain barrier opening for targeting brain structures and evaluating chemogenetic neuromodulation

Akustik Hedefli Kemogenetik (ATAC), spesifik nöral devrelerin noninvaziv kontrolüne izin verir. ATAC, odaklanmış ultrason (FUS) ile indüklenen kan-beyin bariyeri açılışı (FUS-BBBO), adeno-ilişkili viral (AAV) vektörlerle gen iletimi ve tasarlanmış, kemogenetik, protein reseptörleri ve bunların akraba ligandları ile hücresel sinyallemenin aktivasyonunun bir kombinasyonu yoluyla bu kontrolü sağlar. ATAC ile tek bir noninvaziv ultrason uygulaması kullanarak hem büyük hem de küçük beyin bölgelerini milimetre hassasiyetinde transdüksiyon yapmak mümkündür. Bu transdüksiyon daha sonra bir ilaç kullanarak serbestçe hareket eden hayvanlarda uzun süreli, invaziv olmayan, cihazsız bir nöromodülasyona izin verebilir. FUS-BBBO, AAV'ler ve kemogenetik birden fazla hayvanda kullanıldığından, ATAC diğer hayvan türlerinde kullanım için de ölçeklenebilir olmalıdır. Bu makale, daha önce yayınlanmış bir protokolü genişletmekte ve karmaşık bir MRG uyumlu FUS cihazına ihtiyaç duymadan, MRG kılavuzluğunda küçük beyin bölgelerine FUS-BBBO ile gen iletiminin nasıl optimize edileceğini özetlemektedir. Protokol ayrıca, herhangi bir laboratuvar tarafından 3D olarak basılabilen ve farklı türler veya özel ekipman için kolayca değiştirilebilen fare hedefleme ve kısıtlama bileşenlerinin tasarımını da açıklar. Tekrarlanabilirliğe yardımcı olmak için protokol, ATAC geliştirmede mikro kabarcıkların, AAV'lerin ve damar delinmesinin nasıl kullanıldığını ayrıntılı olarak açıklar. Son olarak, ATAC kullanan çalışmaların ön araştırmalarına rehberlik etmesi için örnek bir veri gösterilmiştir.

ATAC protokolünü gerçekleştirmenin ilk adımı, FUS-BBBO'nun istenen beyin bölgelerine hedeflenmesidir. Örneğin, tarif edilen protokolü takiben, hipokampus FUS-BBBO ile hedeflendi ve farelere kontrast madde ve AAV9 taşıyan DREADD'ler enjekte edildi, ardından fare beyninin görüntülerini alan bir FLASH 3D MRI dizisi izledi. Hipokampal bölgede (Şekil 6) ve beynin diğer bölgelerinde (Şekil 7) bir T1 sinyal artışı sağlandı. Birkaç hafta sonra, DREADD'ler hedef beyin bölgesinde eksprese edildi. Birçok DREADD, bir floresan raportöre (örneğin mCherry) kaynaştırılırken, formaldehit ile perfüzyon ve fiksasyon işleminin bu proteinlerin floresansını büyük ölçüde azalttığı bulunmuştur. mCherry veya DREADD'a karşı immün boyama, önceki deneyimlere dayanarak ekspresyonun daha güvenilir bir şekilde tespit edilmesini sağlamıştır (Şekil 8). Önceki deneylerde, farelerin ~% 85'i FUS-BBBO7'yi takiben ekspresyon gösterdi. DREADD'lerin yeterli düzeyde ekspresyonu için basit bir test, işlevselliklerini hücresel düzeyde test etmektir. Örneğin, CNO19, deskloroklozapin28 veya diğerleri29 gibi bir kemogenetik ligand veya salin kontrolü sağlayarak ve kardiyak perfüzyon ve fiksasyondan önce 2 saat bekleyerek yapılabilir. Beyin bölümleri daha sonra nöronların aktivitesinin arttığını gösteren c-Fos proteini30 ve DREADD için birlikte immün boyandı. DREADD'lerle hedeflenen beyin bölgesi, kemogenetik ligand alan grupta salin7 alan gruba kıyasla veya FUS-BBBO'ya maruz kalmayan kontralateral bir bölgeye kıyasla önemli ölçüde daha fazla sayıda nöronal çekirdek gösteriyorsa, deney başarılı kabul edildi. Dikkat çekici bir şekilde, bu ligandların bazılarının, DREADD'lerin ekspresyonu olmadan spesifik olmayan nöronları aktive etme potansiyeli vardır. Örneğin, CNO'nun farelerde düşük seviyelerde klozapin metabolize edildiği gösterilmiştir, bu da BBB'yi geçer ve yüksek potens27 ile DREADD'leri aktive eder. Bununla birlikte, belirli olmayan konumlara bağlandığı da gösterilmiştir. Her deneyde olduğu gibi, kemogenetik çalışmalarda tüm uygun kontrollerin dahil edilmesi çok önemlidir31. Olası bir kontrol, kemogenetik ligandın, ilacın tek başına istenen davranışsal veya histolojik tahlil üzerindeki etkilerini dışlamak için prosedürler olmaksızın vahşi tip farelere uygulanmasıdır. Başka bir kontrol, dört grubun dahil edilmesi olabilir: DREADD + ligand, DREADD + araç, EGFP + ligand, EGFP + araç, hem FUS-BBBO ile gen iletiminin hem de kemogenetik ligandın olası etkilerini açıklayacak.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Şekil 1: ATAC'ta FUS'un MRI kılavuzluğunda hedeflenmesi süreci. (a) Kulak çubukları, bir burun konisi ve bir MRI tarayıcısının içine sığabilecek bir platform ile fare yerleşimi. (b) MRG'de görülebilen 3D baskılı bir kılavuz (mavi) kulak çubuğu çerçevesinin uçlarına takıldı ve daha sonra dört geçmeli cıvata (yarı saydam mavi) içeren bir yüzey MRI bobini tutucusu ile yerine sabitlendi. (c) 3D baskılı kılavuzun sagital MRG'de (sol panel) görünümü, kılavuzun alt kısmıyla hizalanmış bir dönüştürücünün sanal temsilinin alt kısmı (sarı yarım daire). Sağ panel, koronal görünümden MRG'de 3D baskılı kılavuzun görünümünü gösterir. Parlak daire, güçlü bir MRI kontrastına sahip bir polijet destek malzemesinden yapılmıştır. Haç plastikle oluşturuldu. Sarı bir daire, stereotaksik bir çerçeve içindeki kılavuzla eşmerkezli olarak hizalanmış dönüştürücü konumunu temsil eder. (d) Beyin yapılarını hedeflemek için, sanal bir dönüştürücü, bir ultrason konisinin / yuvasının kalınlığına uyması için farelerin üzerinde z yönünde hareket ettirildi. Bu durumda, su banyosunun kalınlığı nedeniyle, doğru hedefleme için dönüştürücü kılavuzun 8,2 mm yukarısına hareket ettirildi. Beyin yapıları MRG görüntüleme verileri kullanılarak seçildi ve MRG koordinatları daha sonra yazıldı ve stereotaksik makineye girildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Şekil 2: Kullanılan yazılımın arayüzü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Şekil 3: MRG koordinat alanını stereotaksik aletle eşleştirme işlemi. (a) Bir dönüştürücü tutucu içindeki üç delik, MRI kılavuzundaki üç delikle hizalandı ve tüm düzeneğe esnemeye neden olmadan üç konik hedefleme cıvatası yerleştirildi. (b) İdeal olarak, üç cıvata da deliklerin ortasına oturacaktır. (c) Hizalamada herhangi bir belirsizlik varsa, üç cıvatanın tümü yerine oturmaz, örneğin, 1°'lik küçük, muhtemelen algılanamayan sapma durumunda, zıt cıvatalar MRI kılavuzuna sıkışırken yalnızca bir cıvata sığar. Alternatif olarak, cıvatalar zorlandığı için tüm tertibatta gözle görülür bir esneme olabilir. (d) Cıvata bağlantısının büyütülmüş görünümü. En iyi doğruluk için cıvatalar eşmerkezli olarak yerleştirilmelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Şekil 4: Şırınga içindeki mikro kabarcıkların hızlı yeniden dağılımı. (a) Şırınga karıştırıldıktan 5 saniye sonra fotoğraflandı. (b) Bir dakika sonra, 1 mL tüberkülin şırıngasının tepesine yakın bir yerde yoğunlaşan kabarcıkların bir kısmını gösteren açıkça görülebilen bir tabaka vardı. Bu örnek, özellikle, bir mikro kabarcık çözeltisi kullanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Şekil 5: Bir dönüştürücünün merkezini bir MRI kılavuzunun merkezine yerleştirme işlemi. (a) Bu belgede gösterilen modellerde, kırmızı taşıyıcı, Şekil 10.56b'de gösterilen konumdan burada gösterilen konuma 3 mm ileri hareket edecek şekilde tasarlanmıştır. (b) Mavi MRI kılavuzu sonikasyondan önce çıkarıldı ve ultrason geçişini sağlamak için fare ile dönüştürücü (turuncu) arasına bir ultrason jeli uygulandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Şekil 6: BBB açıklığının MRG görselleştirmesi. (a) BBB açıklığının eksenel görünümü. Ok ucu ile gösterilen daha parlak alan, bir MRI T1 kontrast maddesinin ekstravazasyonunu gösterir. (b) Dorsal hipokampusun ve hipokampusun üzerindeki korteksin FUS-BBBO (ok uçları) ile hedeflenen koronal görünümü. (c) FUS-BBBO (ok uçları) ile hedeflenen merkezi hipokampusun koronal görünümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Şekil 7: Bu yazıda açıklanan üç cıvatalı hedefleme sistemi kullanılarak 4 beyin bölgesinin hedeflenmesi örneği. Ok uçlu alanlar, bir MRG kontrast maddesinin difüzyonu ile BBB açılmış bölgeleri gösterdi. Dört bölge, aşağıdan yukarıya doğru her BBB açıklığı arasında ~ 150 s olacak şekilde art arda hedeflendi. Görüntü, son BBB açılışından sonraki 2 dakika içinde çekildi. Ölçek çubuğu 2 mm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Şekil 8: DREADD ifadesinin algılanması.  (a) DREADD'lere bağlı florofor için immün boyama, bu durumda mCherry bazı çalışmalarda güvenilir bir tespit yöntemiydi. (b) (a)'daki ile aynı koşulları kullanarak hipokampusu hedefleyen DREADD'lerin bulunduğu başka bir temsili bölümde, mCherry'nin floresansı kendi başına güçlü bir arka plan ve nispeten zayıf sinyal üretti. (c) Negatif kontrol olarak, sistemik AAV enjeksiyonu alan, ancak FUS-BBBO uygulanmayan bir fare kullanıldı. mCherry immün boyama ile anlamlı bir ekspresyon bulunamaz. Ölçek çubukları 500 mm'dir. (a, c'deki veriler7'den izinlerle uyarlanmıştır, Telif Hakkı 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation at JoVE.com

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Bu protokol, odaklanmış ultrason kan beyin bariyeri (BBB) açılması, ortaya çıkan gen ekspresyonunun değerlendirilmesi ve histolojik testlerle kemogenetik reseptörlerin nöromodülasyon aktivitesinin ölçülmesi yoluyla gen iletimi için gerekli adımları tanımlar.

Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Kan - beyin bariyerini yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme: görüntüleme, 3D yeniden yapılanma ve Transcytosis miktar

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Bir Sıçan Modelinde Odaklanmış Ultrason Kullanarak Konuma Özgü Kan Beyin Bariyeri Açılışına Tezgah Üstü Yaklaşım

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Kemirgenlerde Kan-Beyin Bariyeri Açıklığı için Yüksek Verimli Görüntü Destekli Stereotaktik Nöronavigasyon ve Odaklanmış Ultrason Sistemi

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Beyin Devrelerinin İnvaziv Olmayan Bağlantısının Hedefli Nöronal Yaralanma

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Odaklanmış Taramalı Ultrason Kullanarak Antikorların Beyne Verilmesi

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...