Name: investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل منحة المعاهد الوطنية للصحة GM118085، وجزؤا من مؤسسة روبرت ويلش (منحة F-1811 إلى R.M.H.).

1. عزل المسوخ القامع في سلالات نقص الحركة
ملاحظة: استخدم هذا الأسلوب ك "catch-all" واسعة لتحديد الطبيعة العامة للعيب الحركة.
<ol><li>إعداد لوحة لينة أجار ملاحظة: لينة أجار، ويشار إليها أيضا باسم الحركة- أو السباحة أجار، هو agar نسبة منخفضة (~0.2-0.35٪ ث /v)، وتستخدم منذ فترة طويلة ...

وقد ساهم عزل وتوصيف الطفرات القامعة بنجاح في تحديد المكونات الرئيسية لنظام chemotaxis35،36،37، وكذلك الآلات الحركية نفسها38،39،40. 11- ومن المهم، أثناء استخدام البروتوكول 1، إدراج نسخ متماثلة مستق...

البكتيريا تستخدم العديد من الزوائد للحركة والتشتت في منافذها الإيكولوجية1. حركية Flagella يحركها هو أسرع من هذه، وتعزيز استعمار محلى مواتية استجابة للإشارات البيئية، والمساهمة بشكل كبير في القدرة المسببة للأمراض من بعض الأنواع2،3. يمكن للبكتيريا flagellated السباحة بشكل فردي في السائل السائبة، أو سرب كمجموعة على سطح شبه صلب4. يلتصق flagella خارج الخلية بمحركات دوارة مضمنة في الغشاء ويقودها ، والتي تسخر قوة تدرجات الأيونات لتوليد عزم الدوران الذي يسبب الدوران1،2،4،5،6،7،8. في الإشريكية القولونية، التي تعمل محركاتها بعزم دوران ثابت9، يمكن تصنيف إخراج المحرك من حيث سرعة الدوران وتبديل الدوار بين اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة (CCW) واتجاه عقارب الساعة (CW). يعزز دوران اتفاقية الأسلحة التقليدية تشكيل حزمة flagellar متماسكة تدفع الخلية إلى الأمام (تشغيل) ، في حين أن التبديل العابر في اتجاه الدوران (CW) يتسبب في تفكيك الحزمة إما جزئيا أو كليا10، والخلية لإعادة توجيه اتجاه السباحة (تعثر). E. القولونية تشغيل عادة لثانية واحدة وتعثر لمدة عشر من الثانية. يتم التحكم في تبديل تردد الدوار أو "التحيز المتعثر" من خلال نظام الإشارات chemotaxis ، حيث تكتشف مستقبلات الشيمورسيبتس العابرةmembrane الإشارات الكيميائية الخارجية وتنقلها عبر الفوسفوريلاي إلى محرك flagellar لتمديد الأشواط استجابة للمجذبات ، أو قمعها استجابة للمواد الكيميائية السامة11،12. يتم فحص حركة السباحة في أجار ناعم بنسبة 0.3٪.
أثناء يحتشدون، البكتيريا التنقل على سطح شبه صلب كمجموعة كثيفة، حيث حزم من البكتيريا تيار في حركة الدوامةالمستمرة 2،13،14،15. E. أسراب القولونية المعرض تغيير علم وظائف الأعضاء chemosensory (انخفاض التحيز تعثر), سرعات أعلى, وارتفاع التسامح مع مضادات الميكروبات على الخلايا السباحة في السائل السائب16,17. أسراب تختلف في نشرها لعدد كبير من الاستراتيجيات التي تساعد على الحركة، بما في ذلك إنتاج السطحي، فرط التضخم، وإطالة الخلية2. يحتشدون يقدم البكتيريا ميزة تنافسية في كل من الإيكولوجية والإعداداتالسريرية 18،19،20. هناك فئتان من البكتيريا يحتشدون: أسراب المعتدلة، والتي يمكن أن سرب فقط على وسائل الإعلام توطدت مع 0.5-0.8٪ أجار، وأسراب قوية، والتي يمكن التنقل عبر تركيزات أجار أعلى21.
توجد مجموعة متنوعة من المقايسات لاستجواب حركة السباحة وتنظيمها. عندما تضعفها الطفرات أو الظروف البيئية ، فإن الحركة نفسها تقدم مجموعة قوية لتحديد طفرات القامع لكسب الوظيفة. يمكن أن تكون هذه القامعات عودة حقيقية للطفرة الأصلية ، أو العودة الزائفة ، حيث تستعيد الطفرة الثانية الوظائف. ويمكن تحديد هذه المسوخ من خلال تسلسل الجينوم كله (WGS). البديل لاختيار القامع غير المتحيز هو استراتيجية الطفرات المستهدفة المتحيزة (على سبيل المثال ، تولد الطفرات PCR). وغالبا ما تسلط هذه المنهجيات الضوء على وظيفة جهاز الحركة أو تنظيمه البيئي. إذا كان الهدف هو دراسة الوظيفة الحركية ، فإن استعادة الحركة البرية كما تقاس بالنعومة قد لا تشير بالضرورة إلى استعادة إخراج المحرك البري. يمكن أن يكون المقايسة التي تربط الخلايا، والتي يتم فيها ربط الخلايا بسطح زجاجي بواسطة علم واحد ويتم رصد دوران جسم الخلية لاحقا، هي المقايسة الأولية للاختيار لتقييم السلوك الحركي. على الرغم من أن أكثر منهجيات متطورة متاحة الآن لرصد خصائص المحرك، المطلوبة عالية السرعة الكاميرا انشاء وتطبيق حزم البرمجيات لتحليل الحركة تحد من استخدامها على نطاق واسع22،23،24،25. يتطلب الفحص ربط الخلية فقط أن يتم قص flagella ، مما يسمح بتعلق خيوط قصيرة إلى شريحة زجاجية ، تليها تسجيل فيديو دوران جسم الخلية. على الرغم من أن السرعات الحركية المسجلة منخفضة في هذا المقايسة بسبب الحمل العالي الذي يمارسه جسم الخلية على flagellum ، إلا أن هذا الفحص ساهم مع ذلك في رؤى قيمة في الاستجابات الكيميائية26و27و28و29، ولا يزال أداة تحقيق صالحة كما هو موضح أدناه.
تشكل الحركة المحتشدة مجموعة مختلفة من التحديات للباحثين. اختيار القامع كسب وظيفة يعمل فقط في أسراب التي تنتج السطحي وفيرة وسرب بسهولة13. السطحية غير المنتجين مثل كولاي هي fastidious فيما يتعلق باختيار أجار، وتكوين وسائل الإعلام والرطوبة للبيئة2،13،14،21. وبمجرد تهيئة الظروف المحتشدة، فإن المقايسة17 لعبور الحدود هي منهجية مفيدة لاستجواب قدرة سرب على التنقل في ظروف جديدة/قاسية. على الرغم من أن البروتوكولات المعروضة أدناه تتعلق بالإشريكية القولونية، إلا أنه يمكن تكييفها بسهولة للتطبيق في الأنواع الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

الحركة أمر بالغ الأهمية لبقاء ونجاح العديد من الأنواع البكتيرية. توجد العديد من المنهجيات لاستغلال الحركة لفهم مسارات الإشارات ، لتوضيح وظيفة وتجميع أجزاء flagellar ، ودراسة وفهم أنماط الحركة. هنا نبين مجموعة من ثلاث من هذه المنهجيات. الحركة في أجار لينة هو الأقدم، وتقدم مجموعة قوية لعزل الطفرات القامع كسب الوظيفة في سلالات حركية ضعف، حيث يتم استعادة الحركة من خلال طفرة ثانية. ويمكن استخدام تقنية ربط الخلايا، التي استخدمت لأول مرة لإثبات الطبيعة الدوارة لمحرك flagellar، لتقييم تأثير تأثيرات الإشارات على سرعة المحرك وقدرته على تبديل الاتجاه الدوراني. أما المقايسة "العابرة للحدود" فهي أحدث عهدا، حيث يمكن تجهيز بكتيريا السباحة للانتقال إلى التحرك الجماعي كسرب. وتمثل هذه البروتوكولات مجتمعة نهجا منهجيا وقويا لتحديد مكونات آلية الحركة، وتوصيف دورها في مختلف جوانب السباحة والازحراب. ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة الحركة في الأنواع البكتيرية الأخرى.

تم تفصيل عزل الرجعيات الزائفة في سلالة الإشريكية القولونية التي تضعف حركتها بسبب المستويات العالية من جزيء الإشارات c-di-GMP ، في العمل الأخير من مختبرنا34. هذه السلالة (JP1442) تؤوي اثنين من الطفرات:Δ yhjH وΔ ycgR. YhjH هو فوسفوديستراز الأكثر نشاطا أن يحط ج دي GMP في الإشريك?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

تستخدم العديد من البكتيريا الحركة التي تحركها flagella للتنقل في بيئتها واستعمار المناطق المحيطة المواتية على حد سواء بشكل فردي وجماعي. يتضح هنا هو استخدام ثلاث طرق راسخة تستغل الحركة كأداة اختيار لتحديد المكونات / المسارات المساهمة في السباحة والحركة.

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

The protocols demonstrated in this video can be reproduced in any lab in the world. In combination, they represent a systematic and powerful approach to characterizing bacterial flagellum motility. Motility is a crucial aspect of bacterial dissemination and survival, and these three methods are useful and powerful tools for the analysis of both individual and collective motility.The techniques described here can readily be applied to study an array of bacteria, including those classified as pathogenic in nature. When attempting this procedure for the first time, keep in mind that if the swarm plates are prepared incorrectly, inconsistent behavior or patterns that mimic but do not truly reflect collective motion may be observed. Grow overnight cultures of the desired motility deficient strain in five milliliters of Lennox broth at 30 degrees Celsius with horizontal shaking, then subculture in fresh LB under the same conditions to exponential phase.Inoculate six microliters of the culture into the center of a soft agar plate, pushing the loaded pipette tip into the agar to gently expel the contents. Incubate the plate at 30 degrees Celsius until motility flares are evident, emanating from the inoculation point or the periphery of the motility rings. Use a sterile wire loop to lift the cells from the flare region and streak them onto an LB hard agar plate in order to purify single colonies.To confirm that the isolated suppressor mutants have restored motility, culture them on soft agar plates for strains of interest. Include wild-type and the starting motility deficient strain for comparison. After incubating the culture plates at 30 degrees Celsius for eight to 10 hours, record the diameter of the outermost ring to establish which of the isolates have substantially restored motility.Prepare an exponential phase culture of the strain of interest. Then pellet 10 milliliters of cells by centrifugation at 2000 times G for three minutes, and resuspend them in 10 milliliters of filter sterilized motility buffer, or MB.Wash the cells two more times in MB and resuspend them in one milliliter of MB after the final centrifugation. Transfer the cell suspension into a one milliliter syringe and attach a 23 gauge needle to the end.Assemble an identical syringe and needle apparatus and attach the two together via six inches of polyethylene tubing, tightly sheathed over each needle tip. Shear the flagella by gently passing the cell suspension back and forth from one syringe to the other 50 times with one minute pauses between every 10 passes. Then centrifuge the sheared cells at 2000 times G for three minutes and resuspend them in 500 microliters of MB.To prepare a cell fixation chamber, stack an 18 by 18 millimeter cover slip over a glass microscope slide separated by double-sided tape.Add 0.01%polylysine solution to the top of the chamber to flush it. Tilt the bottom edge onto a task wipe to draw the solution through the chamber, then leave it at room temperature for 10 minutes. Wash the chamber three times with 40 microliters of MB and add 40 microliters of sheared cell suspension to the top of the chamber.Allow the cells to attach to the cover slip for 10 minutes, then gently flush the chamber with 40 microliters of MB to remove unattached cells. Transfer the slide to the microscope stage and use phase contrast microscopy and a 100X objective to scan the population for cells that are fixed in place and rotating on a single axis. Open the microscope software, make sure that the cells are in focus, and begin video acquisition to record the cell rotation for one minute.From video playback, quantify the number of complete rotations per minute and the number of times the cell changes direction. Inoculate six microliters of a mid-exponential culture by spotting it on top of the agar. Leave the lid off for five to 10 minutes and replace it when the inoculum has dried into the agar surface.Then incubate the plate at 30 degrees Celsius for eight hours. Pour approximately 30 milliliters of swarm agar into the right chamber of a dual compartment petri dish, ensuring that it is level with the plastic divider between chambers, but not overflowing into the left. After the agar is hardened, fill the left chamber with approximately 30 milliliters of swim or swarm agar.Before it sets, use a sterile pipette tip to gently drive the agar over the border and connect the two sides with a one millimeter tall agar bridge that spans the entire length of the divide. Allow the plate to dry at room temperature. As you pour the agar, pay attention to its depth.If it is too high, it will overflow. If it's too low, you will be unable to bridge the two chambers. This protocol was used to isolate pseudo revertant flares in a double mutant E.coli strain with impaired motility.One of these revertants displayed motility close to wild-type. The double mutant parent and isogenic wild-type strain were used as controls. Video captures were analyzed to calculate rotations per minute, and the fraction of time that motors rotate in a clockwise direction, or tumble bias.The yhjH mutant showed a few rotations per minute and a lower tumble bias compared to wild-type E.coli, as expected. Both the double mutant and its suppressor showed motor behavior similar to wild-type. The border crossing assay was used to compare the abilities of the wild-type and the suppressor isolate to swarm and then to move across the border and swarm on agar supplemented with kanamycin.Both strains showed similar rates of swarming from an identical inoculation point, but crossover of the swarm to the antibiotic chamber was consistently greater for the wild-type than the suppressor. The difference between the two strains was more pronounced at higher kanamycin concentrations. The swarm assays can be tricky to set up.You may need to spend some time optimizing the drawing conditions to suit your bacteria of interest, as well as your lab conditions during media preparation. The techniques in this protocol have been applied to an array of flagellated bacteria, and can likely be applied to a plethora of untested species.

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...