Name: investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所助成金GM118085とロバート・ウェルチ財団(R.M.H.にF-1811を付与)によって部分的に支援されました。

1. 運動不足株におけるサプレッサー変異体の分離
注: この方法を広範な「キャッチオール」として使用して、運動性欠陥の一般的な性質を特定してください。
<ol><li>ソフト寒天プレートの準備 注:軟寒天は、運動性または水泳寒天とも呼ばれ、低パーセンテージ寒天(〜0.2-0.35%w/v)であり、長い間気胸31,32をアッセ...

サプレッサー突然変異の分離と特徴付けは、気化システム35、36、37、ならびにモータ機器自体38、39、40の主要成分の同定に成功した。プロトコル1を使用している間、運動性の喪失を補うことができる突然変異の大きなスペクトルの分離を確実にするた?...

細菌は、その生態学的ニッチに移動と分散のための多くの付属物を採用しています1.これらの中で最も速いのが、環境信号に応答して好ましいロケールの植民地化を促進し、いくつかの種2,3の病原性能力に大きく寄与する。バネラ菌は、バルク液体で個別に泳ぐか、半固体表面4の上に集団として群がることができます。細胞外のフラグラは膜に埋め込まれた回転モーターによって取り付けられて駆動され、イオン勾配の力を利用して回転1、2、4、5、6、7、8を引き起こすトルクを発生させる。モーターが一定のトルク9で動く大腸菌では、モーター出力は回転速度と回転子の反時計回り(CCW)方向と時計回り(CW)方向の切り替えの観点から分類することができる。CCW回転は、セルを前方に推進するコヒーレント・フラネラ・バンドルの形成を促進し(CW)、一時的な回転方向スイッチ(CW)を行うと、バンドルは部分的または完全に10個を分解し、細胞は泳方向(タンブル)を再び向きにします。大腸菌は通常1秒間走り、10分の1秒は転倒する。ロータまたは「タンブルバイアス」のスイッチング周波数は、化学運動体信号システムによって制御され、膜貫通化学受容体は外部の化学信号を検出し、リンベレーを介してフラゲラモーターに伝達し、誘引物質に応答してランを延長するか、または有毒化学物質11、12に応答してそれらを抑制する。水泳運動は0.3%柔らかい寒天でアッセイされます。
群れの間、細菌は半固体表面を密な集団として移動し、連続渦巻き運動2、13、14、15の中で細菌のパックが流れる。大腸菌群は、変化した化学感覚生理学(低タンブルバイアス)、より高速、およびバルク液体16、17で泳ぐ細胞に対する抗菌性に対する耐性の高さを示す。スウォーマーは、界面活性剤の生産、ハイパーフラフェレーション、細胞伸長2を含む、運動を助ける多くの戦略の展開において異なる。群れは、細菌に生態学的および臨床的な設定18、19、20の両方で競争上の優位性を提供しています。群れの細菌には、0.5-0.8%寒天で固められた媒体でのみ群がることができる温帯スウォーマーと、より高い寒天濃度21を横切ってナビゲートできる堅牢なスウォーマーの2つのカテゴリーがあります。
水泳の運動性とその規制を尋問するために様々なアッセイが存在します。突然変異や環境条件によって障害を受けた場合、運動性自体は、機能の得るサプレッサー突然変異を同定するための強力な選択を提供する。これらのサプレッサーは、元の突然変異の本物の復帰剤、または第2の突然変異が機能を回復する疑似戻し物である可能性があります。このような変異体は全ゲノムシーケンシング(WGS)によって同定することができる。非バイアスサプレッサー選択の代替は、偏った標的突然変異誘発戦略(例えば、PCR変異生成)である。これらの方法論は、多くの場合、運動装置の機能または環境調節に光を当てる。モータ機能を研究することが目標である場合、軟寒天で測定された野生型運動性の回復は、必ずしも野生型モーター出力の回復を示すものではない。細胞テザリングアッセイは、細胞が単一の旗臼によってガラス表面に結合され、その後、細胞体の回転が監視される、運動行動を評価するための最初のアッセイであり得る。モーターの特性を監視するためにより高度な方法論が利用可能になりましたが、モーション分析のためのソフトウェアパッケージの必要な高速カメラのセットアップと適用は、その広範な使用を制限します22,23,24,25.細胞テザリングアッセイは、フラゲラをせき止めることだけを必要とし、短いフィラメントをガラススライドに取り付けることができ、続いて細胞体の回転をビデオ撮影する。このアッセイでは、細胞体がフラゲラムにかかる負荷が高いため、記録されたモータ速度は低いが、このアッセイは、化学戦術応答26、27、28、29に関する貴重な洞察に寄与しており、以下で説明するように有効な調査ツールのままである。
群れの運動性は、研究者にとって異なる課題をもたらします。機能向上抑制剤の選択は、豊富な界面活性剤を生成し、容易に13を群がって生じるスウォーマーでのみ機能する。大腸菌のような界面活性剤非生産者は、寒天、培地組成及び環境2、13、14、21の湿度の選択に対して潔癖性である。群れの状態が確立されると、国境を越えるアッセイ17は、群れが新しい/過酷な条件をナビゲートする能力を尋問するのに有用な方法論です。以下に示すプロトコルは大腸菌に関連していますが、他の種での適用に容易に適応することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

運動性は、多くの細菌種の生存と成功に不可欠です。運動性を利用して信号経路を理解し、フラネラ部の機能と組み立てを解明し、運動パターンを調べ、理解するために多くの方法論が存在する。ここでは、これらの方法の3つの組み合わせを示します。柔らかい寒天の運動性は最も古く、運動性障害のある株の機能利得抑制性突然変異を分離するための強力な選択を提供し、運動性は第2の突然変異によって回復する。細胞テザリング技術は、最初に、フラグラーモータの回転性を実証するために使用され、モータ速度および回転方向を切り替える能力に対するシグナルエフェクタの影響を評価するために使用することができる。「国境を越える」アッセイは、水泳細菌が群れとして集団的に移動する準備ができる、より最近のものです。これらのプロトコルは、運動機械の構成要素を特定し、水泳や群れの異なる側面におけるその役割を特徴付けるための体系的かつ強力なアプローチを表しています。それらは他の細菌種の運動性を研究するために容易に合わせることができる。

高レベルのシグナル伝達分子c-di-GMPによって運動性が損なわれる大腸菌株における擬似復帰物質の単離は、我々の研究室34からの最近の研究で詳述された。この株(JP1442)は、ΔyhjHとΔycgRの2つの突然変異を抱えた。YhjHは、大腸菌のc-di-GMPを分解する最も活性なホスホジエステラーゼである。YhjHの不在は、上昇したc-di-GMPレベルと運動性の阻害につなが...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

The protocols demonstrated in this video can be reproduced in any lab in the world. In combination, they represent a systematic and powerful approach to characterizing bacterial flagellum motility. Motility is a crucial aspect of bacterial dissemination and survival, and these three methods are useful and powerful tools for the analysis of both individual and collective motility.The techniques described here can readily be applied to study an array of bacteria, including those classified as pathogenic in nature. When attempting this procedure for the first time, keep in mind that if the swarm plates are prepared incorrectly, inconsistent behavior or patterns that mimic but do not truly reflect collective motion may be observed. Grow overnight cultures of the desired motility deficient strain in five milliliters of Lennox broth at 30 degrees Celsius with horizontal shaking, then subculture in fresh LB under the same conditions to exponential phase.Inoculate six microliters of the culture into the center of a soft agar plate, pushing the loaded pipette tip into the agar to gently expel the contents. Incubate the plate at 30 degrees Celsius until motility flares are evident, emanating from the inoculation point or the periphery of the motility rings. Use a sterile wire loop to lift the cells from the flare region and streak them onto an LB hard agar plate in order to purify single colonies.To confirm that the isolated suppressor mutants have restored motility, culture them on soft agar plates for strains of interest. Include wild-type and the starting motility deficient strain for comparison. After incubating the culture plates at 30 degrees Celsius for eight to 10 hours, record the diameter of the outermost ring to establish which of the isolates have substantially restored motility.Prepare an exponential phase culture of the strain of interest. Then pellet 10 milliliters of cells by centrifugation at 2000 times G for three minutes, and resuspend them in 10 milliliters of filter sterilized motility buffer, or MB.Wash the cells two more times in MB and resuspend them in one milliliter of MB after the final centrifugation. Transfer the cell suspension into a one milliliter syringe and attach a 23 gauge needle to the end.Assemble an identical syringe and needle apparatus and attach the two together via six inches of polyethylene tubing, tightly sheathed over each needle tip. Shear the flagella by gently passing the cell suspension back and forth from one syringe to the other 50 times with one minute pauses between every 10 passes. Then centrifuge the sheared cells at 2000 times G for three minutes and resuspend them in 500 microliters of MB.To prepare a cell fixation chamber, stack an 18 by 18 millimeter cover slip over a glass microscope slide separated by double-sided tape.Add 0.01%polylysine solution to the top of the chamber to flush it. Tilt the bottom edge onto a task wipe to draw the solution through the chamber, then leave it at room temperature for 10 minutes. Wash the chamber three times with 40 microliters of MB and add 40 microliters of sheared cell suspension to the top of the chamber.Allow the cells to attach to the cover slip for 10 minutes, then gently flush the chamber with 40 microliters of MB to remove unattached cells. Transfer the slide to the microscope stage and use phase contrast microscopy and a 100X objective to scan the population for cells that are fixed in place and rotating on a single axis. Open the microscope software, make sure that the cells are in focus, and begin video acquisition to record the cell rotation for one minute.From video playback, quantify the number of complete rotations per minute and the number of times the cell changes direction. Inoculate six microliters of a mid-exponential culture by spotting it on top of the agar. Leave the lid off for five to 10 minutes and replace it when the inoculum has dried into the agar surface.Then incubate the plate at 30 degrees Celsius for eight hours. Pour approximately 30 milliliters of swarm agar into the right chamber of a dual compartment petri dish, ensuring that it is level with the plastic divider between chambers, but not overflowing into the left. After the agar is hardened, fill the left chamber with approximately 30 milliliters of swim or swarm agar.Before it sets, use a sterile pipette tip to gently drive the agar over the border and connect the two sides with a one millimeter tall agar bridge that spans the entire length of the divide. Allow the plate to dry at room temperature. As you pour the agar, pay attention to its depth.If it is too high, it will overflow. If it's too low, you will be unable to bridge the two chambers. This protocol was used to isolate pseudo revertant flares in a double mutant E.coli strain with impaired motility.One of these revertants displayed motility close to wild-type. The double mutant parent and isogenic wild-type strain were used as controls. Video captures were analyzed to calculate rotations per minute, and the fraction of time that motors rotate in a clockwise direction, or tumble bias.The yhjH mutant showed a few rotations per minute and a lower tumble bias compared to wild-type E.coli, as expected. Both the double mutant and its suppressor showed motor behavior similar to wild-type. The border crossing assay was used to compare the abilities of the wild-type and the suppressor isolate to swarm and then to move across the border and swarm on agar supplemented with kanamycin.Both strains showed similar rates of swarming from an identical inoculation point, but crossover of the swarm to the antibiotic chamber was consistently greater for the wild-type than the suppressor. The difference between the two strains was more pronounced at higher kanamycin concentrations. The swarm assays can be tricky to set up.You may need to spend some time optimizing the drawing conditions to suit your bacteria of interest, as well as your lab conditions during media preparation. The techniques in this protocol have been applied to an array of flagellated bacteria, and can likely be applied to a plethora of untested species.

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

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の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

生物学

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;と<em&gt;コレラ菌</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査