Name: live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in chlamydia trachomatis
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

हम सीआईपी-1 एक्सनिक मीडिया की आपूर्ति के लिए वाशिंगटन स्टेट यूनिवर्सिटी में डॉ ऐंडर्स ओम्सलैंड को धन्यवाद देते हैं । इस काम को एनआईएच ग्रांट R01AI130072, R21AI135691 और R21AI113617 ने सपोर्ट किया । इडाहो विश्वविद्यालय और उनके NIH अनुदान P20GM104420 के माध्यम से मॉडलिंग जटिल इंटरैक्शन के लिए केंद्र से स्टार्टअप फंड द्वारा अतिरिक्त सहायता प्रदान की गई थी।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी पायथन स्क्रिप्ट गिथब https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing पर उपलब्ध हैं
1. Mutagenize रिपोर्टर क्लैमाइडिया
नोट: Ctr-L2-hctB प्रोम-mKate2/euo प्रोम-क्लोवर ईबी सीधे एक्सनिक ?...

<ol>
	<li>AbdelRahman, Y., Belland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chlamydial+developmental+cycle.">The chlamydial developmental cycle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).</li><li>Clifton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chlamydial+type+III+translocated+protein+is+tyrosine-phosphorylated+at+the+site+of+entry+and+associated+with+recruitment+of+actin.">A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).</li><li>Yu, H. H. 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J., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+gene+product+EUO+is+a+transcriptional+repressor+that+selectively+regulates+promoters+of+Chlamydia+late+genes.">The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes.</a> Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).</li><li>Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+expression+of+hctB+encoding+a+strain-variant+chlamydial+histone-like+protein+with+DNA-binding+activity.">Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity.</a> Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).</li><li>Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stage-specific+metabolic+and+transcriptional+activity+of+Chlamydia+trachomatis+in+an+axenic+medium.">Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+binds+to+heparan+sulfate+receptors+on+epithelial+cells.">A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).</li><li>Edelstein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+&#181;Manager.">Computer control of microscopes using &#181;Manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Tinevez, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues.">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).</li><li>Sega, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+genetic+effects+of+ethyl+methanesulfonate.">A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate.</a> Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).</li><li>Ferguson, L., Denny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+mutagenesis+by+acridines+and+other+reversibly+binding+DNA+ligands.">Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands.</a> Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).</li></ol>

क्लैमिडियल विकासात्मक चक्र को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को विच्छेदन वर्तमान में उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की सीमाओं से बाधित किया गया है । लाइव-सेल स्वचालित माइक्रोस्कोपी के साथ हमारे प्रमोटर-रिपो...

क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस (सीटीआर) एक अनिवार्य इंट्रासेलुलर रोगजनक है जो एक बिफेसिक विकासात्मक चक्र के माध्यम से प्रगति करता है जो इसके अस्तित्व और प्रसार के लिए आवश्यक है1। इस चक्र में दो विकासात्मक रूप होते हैं, प्राथमिक निकाय (ईबी) और रेटिकलेट बॉडी (आरबी)। ईबी अक्षम है लेकिन प्रभावक प्रेरित एंडोसाइटोसिस2के माध्यम से सेल आक्रमण को मध्यस्थता करता है । एक बार मेजबान में, ईबी प्रतिकृति आरबी के लिए परिपक्व होता है। आरबी संक्रमण के बाद के दौर शुरू करने के लिए ईबी में वापस बदलने से पहले प्रतिकृति के कई दौर किया जाता है ।
आनुवंशिक उपकरणों की सीमित सरणी जैव रासायनिक अध्ययन या सरोगेट सिस्टम के उपयोग के लिए क्लैमिडियल अनुसंधान के अधिकांश प्रतिबंधित है । परिणामस्वरूप, विकास चक्र के जीन विनियमन और नियंत्रण की स्पष्टता कठिन रही है3,,4. क्लैमिडियल क्षेत्र में अधिक महत्वपूर्ण चुनौतियों में से एक क्लैमिडियल विकासात्मक चक्र की उच्च संकल्प लौकिक ट्रैकिंग और इसके नियमन में शामिल प्रोटीन की पहचान है । क्लैमिडियल विकास चक्र के दौरान जीन अभिव्यक्ति पारंपरिक रूप से विनाशकारी "एंड पॉइंट" तरीकों द्वारा की गई है जिसमें आरएनएक्यू, क्यूपीसीआर और फिक्स्ड सेल माइक्रोस्कोपी5,,6शामिल हैं। यद्यपि इन तरीकों ने अमूल्य जानकारी प्रदान की है, नियोजित तकनीकें श्रमसाध्य हैं और कम लौकिक संकल्प5,,6हैं।
पिछले दशक के भीतर, सीटीआर के आनुवंशिक हेरफेर ने प्लाज्मिड परिवर्तन और,म्यूटेनेसिस7,8,9के लिए विधियों की शुरुआत के साथ प्रगति की है।, इस अध्ययन के लिए, संक्रमण के दौरान वास्तविक समय में व्यक्तिगत समावेशन में क्लैमिडियल विकास की निगरानी के लिए एक प्लाज्मिड-आधारित प्रणाली विकसित की गई थी। एक क्लैमिडियल ट्रांसफॉर्मेंट बनाया गया था जिसने आरबी और ईबी सेल-टाइप विशिष्ट प्रमोटर-रिपोर्टर दोनों को व्यक्त किया था। आरबी विशिष्ट रिपोर्टर फ्लोरोसेंट प्रोटीन क्लोवर के प्रारंभिक आरबी जीन यूओ अपस्ट्रीम के प्रमोटर को फ्यूज करके बनाया गया था । यूईओ एक प्रतिलेखन नियामक है जो देर से ईबी संबद्ध जीन10के सबसेट का दमन करता है । एचसीटीबीके प्रमोटर, जो ईबी न्यूक्लियॉइड संघनन में शामिल एक हिस्टोन जैसे प्रोटीन को एन्कोड करते हैं, को ईबी विशिष्ट रिपोर्टर11बनाने के लिए सीधे mKate2 (RFP) के ऊपर क्लोन किया गया था । एचसीटीबीप्रोम-एमकेटे2/यूओ प्रोम-क्लोवर के लिए रीढ़ p2TK2SW27था ।euo एचसीटीबी और यूओ प्रमोटरों को सीटीआर-एल2 जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित किया गया था । प्रत्येक प्रमोटर अनुक्रम में निर्दिष्ट क्लैमिडियल जीन के लिए अनुमानित ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट के ~ 100 बेस जोड़े शामिल थे और संबंधित ओआरएफ के पहले 30 न्यूक्लियोटाइड (10 अमीनो एसिड) थे। फ्लोरोसेंट एफपी वेरिएंट को व्यावसायिक रूप से सीटीआर कोडन अनुकूलित जीन ब्लॉक के रूप में प्राप्त किया गया था और प्रत्येक क्लैमिडियल जीन और प्रमोटर के पहले 30 न्यूक्लियोटाइड के साथ फ्रेम में क्लोन किया गया था। आईएनसीडी टर्मिनेटर को सीधे mKate2 के डाउनस्ट्रीम क्लोन किया गया था। दूसरा प्रमोटर-रिपोर्टर को आईएनसीडी टर्मिनेटर के डाउनस्ट्रीम डाला गया । p2TK2SW2 में एम्पीसिलिन प्रतिरोध जीन(बला)को pBam4 से aadA जीन (स्पेक्टिनोमाइसिन प्रतिरोध) के साथ प्रतिस्थापित किया गया था। इसके परिणामस्वरूप अंतिम निर्माण p2TK2-hctB प्रोम-mKate2/euo प्रोम-क्लोवर(चित्रा 1A)है कि Ctr-L27में तब्दील हो गया था ।hctBeuo इस आरबी/ईबी रिपोर्टर तनाव लाइव सेल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1बी, सी)का उपयोग कर एकल समावेशन के भीतर विकास चक्र के अवलोकन के लिए अनुमति दी ।
रासायनिक म्यूटागेनिसिस के संयोजन में हमारे प्रमोटर-रिपोर्टर निर्माण को नियोजित करना, एक प्रोटोकॉल को ट्रैक करने और अलग करने के लिए तैयार किया गया था जो सीटीआर सेवर एल 2 की म्यूटेजेनाइज्ड आबादी से विकासात्मक असामान्यताओं को प्रदर्शित करता था। यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत क्लैमिडियल समावेशन की सीधी निगरानी, समय के साथ जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की ट्रैकिंग, क्लैमिडियल क्लोन की पहचान करने की अनुमति देता है जो एक परिवर्तित विकासात्मक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को व्यक्त करते हैं, और व्यक्तिगत समावेशन से क्लैमाइडिया के क्लोनल अलगाव।
हालांकि यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से क्लैमिडियल विकास में शामिल जीन की पहचान के लिए बनाया गया है, लेकिन क्लैमिडियल आनुवंशिक मार्गों की किसी भी संख्या से पूछताछ करने के लिए इसे आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well polystyrene plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Cell culture growth for reinfection of isolates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td>Cell culture growth for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Cell culture growth for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bold line CO2 Unit</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>CO2 UNIT BL</td>
			<td>Stage incubator CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bold line T Unit</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td>Stage incubator temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B1005010</td>
			<td>Capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-514/30-25</td>
			<td>Fluoescent filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-641/75-25</td>
			<td>Fluoescent filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydia trachmatis serovar L2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-577</td>
			<td>Chlamydia trachomatis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP-1 media</td>
			<td>In house</td>
			<td>NA</td>
			<td>Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 &#956;M amino acids, 0.5 
			mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 &#956;M GTP, UTP, and 
			CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cos-7 cells (ATCC)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cell (host cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194527</td>
			<td>Host cell growth inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC205260100</td>
			<td>Mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Plex</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-602</td>
			<td>Supplement for base growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>NA</td>
			<td>Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy 170 S CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO1700100X</td>
			<td>Cell culture incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin 10mg/ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td>Antibiotic for growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CM</td>
			<td>Host cells rinse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Amersham Life Science</td>
			<td>16920</td>
			<td>inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td>pH buffer for growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5179 000.018</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter Notebook</td>
			<td>https://jupyter.org/</td>
			<td>NA</td>
			<td>Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 10-3</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>LB10-3</td>
			<td>Filter wheel controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oko Touch</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>Oko Touch</td>
			<td>Interface to control the Bold line T and CO2 Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior XY stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>H107</td>
			<td>Motorized XY microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrismR Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C2500-R</td>
			<td>Temperature controlled microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Problot Hybridization oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>H1200A</td>
			<td>Rocking Incubator for infection with Chlamydia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Prior</td>
			<td>H30V4</td>
			<td>XYZ microscope stage controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Class 2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>362804</td>
			<td>Cell culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no phenol red)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td>Base growth media for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (phenol red)</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td>Base growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm)</td>
			<td>scopeLED</td>
			<td>F140</td>
			<td>Excitation light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-338-550</td>
			<td>Sonicator, resuspending chlamydial pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage incubator</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>H301-K-FRAME</td>
			<td>Cluster well plate incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG)</td>
			<td>In house</td>
			<td>NA</td>
			<td>Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE 300 inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>16724</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THOR LED</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>White light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Dislodges host cells from flask for seeding into plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ZYLA-5.5-USB3</td>
			<td>imaging camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;Manager 2.0gamma</td>
			<td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td>
			<td>NA</td>
			<td>Open sourse automated microscope control software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in chlamydia trachomatis

इंट्रासेलुलर बैक्टीरियल रोगजनक क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस एक विकासात्मक चक्र से गुजरता है जिसमें दो रूपात्मक रूप से असतत विकासीय रूप होते हैं। गैर-प्रतिकृति प्राथमिक शरीर (ईबी) मेजबान के संक्रमण की शुरुआत करता है। एक बार अंदर, ईबी जालीदार शरीर (आरबी) में अंतर करता है। आरबी तो प्रतिकृति के कई दौर से गुजरता है, संक्रामक ईबी फार्म में वापस अंतर से पहले । यह चक्र क्लैमिडियल अस्तित्व के लिए आवश्यक है क्योंकि सेल प्रकारों के बीच स्विच करने में विफलता मेजबान आक्रमण या प्रतिकृति को रोकती है।
क्लैमाइडिया की अनिवार्य इंट्रासेलुलर प्रकृति के कारण आनुवंशिक तकनीकों में सीमाएं कोशिका-प्रकार के विकास में शामिल आणविक तंत्र की पहचान में बाधा उत्पन्न हुई हैं। हमने एक उपन्यास ड्यूल प्रमोटर-रिपोर्टर प्लाज्मिड सिस्टम तैयार किया है, जो लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर, वास्तविक समय में सेल प्रकार स्विचिंग के दृश्य के लिए अनुमति देता है। सेल-प्रकार के विकास के नियमन में शामिल जीन की पहचान करने के लिए, लाइव-सेल प्रमोटर-रिपोर्टर प्रणाली को दोहरे रिपोर्टर स्ट्रेन के रासायनिक म्यूटेनेसिस, इमेजिंग और क्लैमाइडिया की ट्रैकिंग को बदल विकासात्मक काइनेटिक्स के साथ जोड़कर एक फॉरवर्ड जेनेटिक दृष्टिकोण के विकास के लिए लीवरेज किया गया था, जिसके बाद म्यूटेंट के क्लोनल अलगाव थे । यह आगे आनुवंशिक कार्यप्रवाह एक लचीला उपकरण है कि आनुवंशिक रास्तों की एक विस्तृत श्रृंखला में निर्देशित पूछताछ के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

हमारे प्रमोटर-रिपोर्टर क्लैमिडियल स्ट्रेन के डायरेक्ट ईएमएस म्यूटेनेसिस के परिणामस्वरूप संक्रमितता में ~ 75% की कमी हुई। वर्णित लाइव-सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके, ~ 600 समावेशन को 24 घंटे की अवधि मे?...

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Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

यह प्रोटोकॉल क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिसके विकासात्मक म्यूटेंट की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए एक निर्देशित आगे आनुवंशिक दृष्टिकोण में फ्लोरोसेंट प्रमोटर-रिपोर्टर्स, लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी, और व्यक्तिगत समावेशन निष्कर्षण का उपयोग करता है।

क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस में विकासात्मक म्यूटेंट की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए लाइव-सेल फॉरवर्ड जेनेटिक दृष्टिकोण

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

एक जेनेटिक पृथक करने के लिए स्क्रीन Toxoplasma gondii मेजबान सेल निकास म्यूटेंट

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

में फॉरवर्ड जेनेटिक प्रयास<em&gt; क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

कल्पना और quantitate फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग<em&gt; क्लैमाइडिया</em&gt; रिक्तिका विकास की गतिशीलता जीवित कोशिकाओं में

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

फॉरवर्ड जेनेटिक्स पहचानें मैक्रोफेज का प्रयोग स्क्रीन<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; जीन महत्वपूर्ण प्रतिरोध करने के लिए IFN-γ-निर्भर सेल स्वायत्त प्रतिरक्षण

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

एक सरल और कुशल दृष्टिकोण उत्परिवर्ती चेचक वायरस वैक्टर का निर्माण करने के लिए

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

एक आनुवंशिक दृष्टिकोण के रूप में अध्ययन करने के लिए सहायक टी कोशिकाओं की रेट्रोवायरल पारगमन तंत्र उनके भेदभाव और फंक्शन को नियंत्रित करना

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

एक सरल लाल रक्त कोशिका बी Lymphoblastoid सेल लाइनों की स्थापना के लिए Lysis विधि

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

जीर्ण सक्रिय Epstein-बर्र वायरस संक्रमण के साथ रोगियों से NK और टी सेल लाइनों की स्थापना करने के लिए एक कुशल और सरल तरीका

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces विकासात्मक म्यूटेंट का दृश्य एवं सूक्ष्म मूल्यांकन

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

लाइव सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी उपसेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण और बैक्टीरिया में सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन की जांच करने के लिए

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...