Name: live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in chlamydia trachomatis
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Vi takker Dr. Anders Omsland ved Washington State University for å ha levert CIP-1 øksemedier. Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipendet R01AI130072, R21AI135691 og R21AI113617. Ytterligere støtte ble gitt av oppstartsmidler fra University of Idaho og Center for Modeling Complex Interactions gjennom deres NIH-stipend P20GM104420.

Alle Python-skript som brukes i denne protokollen, er tilgjengelige på Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. Mutagenize Reporter Klamydia
MERK: Ctr-L2-hctBprom-mKate2 /euoprom-Clover EBs ble direkte mutagenisert ved hjelp av etylmetansulfonat (EMS) i akseniske medier CIP-1 som dette mediet støtter EB metabolisme og vedlikehold av EB infectivity12.
<ol><li>Tin en klamydial lager på ...

<ol>
	<li>AbdelRahman, Y., Belland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chlamydial+developmental+cycle.">The chlamydial developmental cycle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).</li><li>Clifton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chlamydial+type+III+translocated+protein+is+tyrosine-phosphorylated+at+the+site+of+entry+and+associated+with+recruitment+of+actin.">A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).</li><li>Yu, H. H. Y., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#963;28+RNA+polymerase+regulates+hctB,+a+late+developmental+gene+in+Chlamydia.">&#963;28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia.</a> Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).</li><li>Koo, I., Stephens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Developmentally+Regulated+Two-component+Signal+Transduction+System+in+Chlamydia.">A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).</li><li>Grieshaber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Active+Metabolism+on+Elementary+Body+Transcript+Profile+and+Infectivity.">Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity.</a> Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).</li><li>Belland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of.">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis:+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Nguyen, B., Valdivia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches.">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li><li>Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> MBio. 7 (1), 01817 (2016).</li><li>Rosario, C. J., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+gene+product+EUO+is+a+transcriptional+repressor+that+selectively+regulates+promoters+of+Chlamydia+late+genes.">The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes.</a> Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).</li><li>Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+expression+of+hctB+encoding+a+strain-variant+chlamydial+histone-like+protein+with+DNA-binding+activity.">Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity.</a> Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).</li><li>Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stage-specific+metabolic+and+transcriptional+activity+of+Chlamydia+trachomatis+in+an+axenic+medium.">Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+binds+to+heparan+sulfate+receptors+on+epithelial+cells.">A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).</li><li>Edelstein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+&#181;Manager.">Computer control of microscopes using &#181;Manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Plotly Technologies Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Collaborative data science. , (2015).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues.">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).</li><li>Sega, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+genetic+effects+of+ethyl+methanesulfonate.">A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate.</a> Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).</li><li>Ferguson, L., Denny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+mutagenesis+by+acridines+and+other+reversibly+binding+DNA+ligands.">Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands.</a> Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).</li></ol>

Dissekere mekanismene som styrer klamydia utviklingssyklusen har blitt hindret av begrensningene i de tilgjengelige genetiske verktøy. Ved hjelp av vår promotor-reporter Chlamydia sammen med live-cell automatisert mikroskopi, ble det bygget et system som muliggjør overvåking av celletypeutvikling i individuelle inneslutninger over en 24-timersperiode. Dette systemet, i kombinasjon med kjemisk mutagenese og direkte inkludering isolasjon har etablert en metode for raskt og klontalt velge Klamydia uttr...

Chlamydia trachomatis (Ctr) er et obligatorisk intracellulært patogen som utvikler seg gjennom en bifasisk utviklingssyklus som er avgjørende for overlevelse og spredning1. Denne syklusen består av to utviklingsformer, den elementære kroppen (EB) og reticulate kroppen (RB). EB er replikering inkompetent, men formidler celleinvasjon gjennom effector indusert endocytosis2. En gang i verten modnes EB til den replikerte RB. RB utfører flere runder med replikering før konvertering tilbake til EB for å initiere påfølgende runder med infeksjon.
Det begrensede utvalget av genetiske verktøy har begrenset det meste av klamydiaforskningen til biokjemiske studier eller bruk av surrogatsystemer. Som en konsekvens har belysning av genregulering og kontroll av utviklingssyklusen vært vanskelig3,4. En av de viktigste utfordringene i klamydialfeltet er den høyoppløsnings temporale sporingen av klamydiautviklingssyklusen og identifisering av proteinene som er involvert i reguleringen. Genuttrykk under klamydiautviklingssyklusen har tradisjonelt blitt utført ved destruktive "sluttpunkt" metoder, inkludert RNAseq, qPCR og fast cellemikroskopi5,,6. Selv om disse metodene har gitt uvurderlig informasjon, teknikkene ansatt er arbeidskrevende og har lav timeligoppløsning 5,6.
I løpet av det siste tiåret har genetisk manipulering av Ctr utviklet seg med innføringen av plasmid transformasjon og metoder for mutagenese7,8,9. For denne studien ble et plasmidbasert system utviklet for å overvåke klamydiautvikling i individuelle inneslutninger i sanntid i løpet av en infeksjon. En klamydial transformant ble opprettet som uttrykte både en RB og EB celle-type spesifikk promotor-reporter. Den RB spesifikke reporteren ble konstruert ved å fikse promoteren av det tidlige RB-genet euo oppstrøms av det fluorescerende proteinet Clover. EUO er en transkripsjonsregulator som undertrykker en undergruppe av sene EB-tilknyttede gener10. Arrangøren av hctB, som koder en histone-lignende protein involvert i EB nukleoid kondens, ble klonet direkte oppstrøms av mKate2 (RFP) for å lage EB spesifikk reporter11. Ryggraden for hctBprom-mKate2 /euoprom-Clover var p2TK2SW27. HctB- og euo-promotorene ble forsterket fra Ctr-L2 genomisk DNA. Hver promotorsekvens besto av ~100 basispar oppstrøms av det forventede transkripsjonsstartstedet for det angitte klamydiagenet pluss de første 30 nukleotid (10 aminosyrene) av de respektive ORF. De fluorescerende FP-variantene ble kommersielt oppnådd som Ctr codon optimaliserte genblokker og klonet i rammen med de første 30 nukleotid av hvert klamydiale gen og promotor. IncD-terminatoren ble klonet direkte nedstrøms av mKate2. Den andre promotor-reporteren ble satt inn nedstrøms av incD-terminatoren. Ampicillinresistensgenet (bla) i p2TK2SW2 ble erstattet med aadA-genet (Spectinomycin resistens) fra pBam4. Dette resulterte i den endelige konstruksjonen p2TK2-hctBprom-mKate2 /euoprom-Clover (Figur 1A) som ble forvandlet til Ctr-L27. Denne RB / EB reporter belastning tillatt for observasjon av utviklingssyklusen innenfor enkelt inneslutninger ved hjelp av live-celle mikroskopi (Figur 1B, C).
Ved hjelp av vår promotor-reporter konstruere i kombinasjon med kjemisk mutagenese, ble en protokoll utviklet for å spore og isolere individuelle kloner som viste utviklingsmessige abnormiteter fra mutageniserte populasjoner av Ctr serovar L2. Denne protokollen muliggjør direkte overvåking av individuelle klamydial inneslutninger, sporing av genuttrykksprofiler over tid, identifisering av klamydial kloner som uttrykker et endret utviklingsgenuttrykksmønster og klonalt isolasjon av Klamydia fra individuelle inneslutninger.
Selv om denne protokollen er opprettet spesielt for identifisering av gener involvert i klamydial utvikling, kan det lett tilpasses for å avhøre en rekke klamydiagene veier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well polystyrene plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Cell culture growth for reinfection of isolates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td>Cell culture growth for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Cell culture growth for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bold line CO2 Unit</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>CO2 UNIT BL</td>
			<td>Stage incubator CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bold line T Unit</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td>Stage incubator temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B1005010</td>
			<td>Capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-514/30-25</td>
			<td>Fluoescent filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-641/75-25</td>
			<td>Fluoescent filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydia trachmatis serovar L2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-577</td>
			<td>Chlamydia trachomatis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP-1 media</td>
			<td>In house</td>
			<td>NA</td>
			<td>Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 &#956;M amino acids, 0.5 
			mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 &#956;M GTP, UTP, and 
			CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cos-7 cells (ATCC)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cell (host cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194527</td>
			<td>Host cell growth inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC205260100</td>
			<td>Mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Plex</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-602</td>
			<td>Supplement for base growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>NA</td>
			<td>Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy 170 S CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO1700100X</td>
			<td>Cell culture incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin 10mg/ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td>Antibiotic for growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CM</td>
			<td>Host cells rinse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Amersham Life Science</td>
			<td>16920</td>
			<td>inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td>pH buffer for growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5179 000.018</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter Notebook</td>
			<td>https://jupyter.org/</td>
			<td>NA</td>
			<td>Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 10-3</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>LB10-3</td>
			<td>Filter wheel controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oko Touch</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>Oko Touch</td>
			<td>Interface to control the Bold line T and CO2 Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior XY stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>H107</td>
			<td>Motorized XY microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrismR Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C2500-R</td>
			<td>Temperature controlled microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Problot Hybridization oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>H1200A</td>
			<td>Rocking Incubator for infection with Chlamydia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Prior</td>
			<td>H30V4</td>
			<td>XYZ microscope stage controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Class 2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>362804</td>
			<td>Cell culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no phenol red)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td>Base growth media for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (phenol red)</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td>Base growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm)</td>
			<td>scopeLED</td>
			<td>F140</td>
			<td>Excitation light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-338-550</td>
			<td>Sonicator, resuspending chlamydial pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage incubator</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>H301-K-FRAME</td>
			<td>Cluster well plate incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG)</td>
			<td>In house</td>
			<td>NA</td>
			<td>Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE 300 inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>16724</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THOR LED</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>White light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Dislodges host cells from flask for seeding into plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ZYLA-5.5-USB3</td>
			<td>imaging camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;Manager 2.0gamma</td>
			<td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td>
			<td>NA</td>
			<td>Open sourse automated microscope control software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in chlamydia trachomatis

Det intracellulære bakterielle patogenet Chlamydia trachomatis gjennomgår en utviklingssyklus bestående av to morfologisk diskrete utviklingsformer. Den ikke-repliktive elementære kroppen (EB) initierer infeksjon av verten. Når du er inne, skiller EB seg inn i reticulate kroppen (RB). RB gjennomgår deretter flere runder med replikering, før de differensierer tilbake til den smittsomme EB-formen. Denne syklusen er avgjørende for klamydia overlevelse som unnlatelse av å bytte mellom celletyper hindrer enten vert invasjon eller replikering.
Begrensninger i genetiske teknikker på grunn av den obligatoriske intracellulære naturen til Klamydia har hindret identifisering av molekylære mekanismer som er involvert i celletypeutviklingen. Vi designet et nytt dobbelt promoter-reporter plasmid system som, sammen med live-celle mikroskopi, tillater visualisering av celletype bytte i sanntid. For å identifisere gener som er involvert i reguleringen av celletypeutvikling, ble live-cell promoter-reporter-systemet utnyttet for utviklingen av en fremadstormende genetisk tilnærming ved å kombinere kjemisk mutagenese av den doble reporterstammen, bildebehandling og sporing av Klamydia med endret utviklingskinetikk, etterfulgt av klonnal isolasjon av mutanter. Denne fremadgående genetiske arbeidsflyten er et fleksibelt verktøy som kan endres for ledet avhør til et bredt spekter av genetiske veier.

Direkte EMS mutagenesis av vår promotor-reporter klamydial belastning resulterte i en ~ 75% reduksjon i infectivity. Ved hjelp av den beskrevne live-cell imaging protokollen, ~ 600 inneslutninger ble avbildet og sporet over en 24 t periode. Den fluorescerende uttrykkskinetikken til begge journalistene i hver inkludering ble visualisert ved hjelp av tilpassede Python-notatbokskript. To visualiseringstilnærminger ble implementert for å identifisere kandidatmutatisert Klamydia for isolasjon. Den første metodikk...

Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Denne protokollen benytter fluorescerende promotor-reportere, live-celle mikroskopi, og individuell inkludering utvinning i en rettet fremover genetisk tilnærming for å identifisere og isolere utviklingsmutanter av Chlamydia trachomatis.

Live-Cell Forward Genetisk tilnærming til å identifisere og isolere utviklingsmutanter i Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Denne protokollen gir et unikt verktøy for generering og isolering av Klamydia med endrede utviklingsprofiler, noe som til slutt åpner for identifisering av genene som regulerer utviklingssyklusen. De viktigste fordelene med denne metoden er evnen til å spore klamydia celletypeutvikling i sanntid og evnen til å isolere klamydia, med endre utviklingsprogrammer. For å mutagenize en klamydia trachomatis reporter, så en klamydial lager som inneholder omtrent tre ganger 10th til den syvende elementære organer.Forvandlet med reporterplasma av interesse og pellet, er tanken fylt av centrofugation. bruke sonikering ved 10% strøm i 10 sekunder, for å gjenbruke de elementære legemene i 100 mikroliter av utilsiktet metabolismebuffer og dele den resulterende elementære kroppssuspensjonen likt, mellom to 1,5 milliliter mikro sentrifugerør. Tilsett 50 mikroliter med nylaget EMS metabolismeløsning i klamydia aliquots for mutagenesis og 50 mikroliter vaccinic metabolisme buffer til klamydial aliquot bare for lager mutagenesis og inkubere begge prøvene i 20 minutter, ved romtemperatur.EMS er et kjent kreftfremkallende brukshansker under håndtering, og suge alle EMS forurenset utstyr og medium, i en molar natriumhydroksid i 24 timer før avhending. For å sette opp en engroskultur, for avbildning og isolering av mutigeniserte klamydia trachometers. Seed seks brønnglass bunnplater, med seks ganger 10 til femte koster syv celler, i to milliliter av komplett medium per brønn og frø en 24 brønn polystyren plate med 10 til den femte årsaken syv celler i en milliliter komplett medium per brønn.For å infisere vertscellekulturen med mutagenisert benekter klamydia trachomatis infisere, fem Brønner av et glass bunnplate med omtrent seks ganger 10 til den femte, av mutageniserte elementære organer. I 1,5 milliliter iskald HBSS per brønn. og infisere de resterende brønnen, med omtrent to ganger 10 til femte mock mutagenized elementære legemer i 1,5 milliliter iskalde HBSS per brønn, etter en 15 minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius, med gynge, vask de infiserte cellene med 37 grader Celsius HBSS supplert med ett milligram per milliliter heparin, etterfulgt umiddelbart av en HBSS skyll.vaske cellene med heparin igjen, etterfulgt umiddelbart av to skyll med HBSS alene for å sikre at alt heparin fjernes. Etter den siste vasken, legg til fire milliliter på 37 grader Celsius bildemedium, til hver brønn. Og fyll de inter brønnrommene med 37 grader Celsius deionisert vann og legg platene i cellekulturinkubatoren i 10 timer.På slutten av inkubasjonen satt mikroskopet scenen inkubator til 5% karbondioksid, og 37 grader Celsius. Og plasser de seks brønnglassbunnplaten, inn i scenen inkubator. I bildeprogramvaren, Bruk høy innhold screening plugin for å velge de seks brønnplate mal, og generere en bildeplassering liste bestående av 12 synsfelt per godt bruke autofokus alternativet for å sette fokus for automatisert bildebehandling og sette eksponeringen til 250 millisekunder med en 4% intensitet i GFB-kanalen og en 18% i tetthet i RFP-kanalen.Så ved bildesyklusen i 24 timer, med 30 minutters intervaller, for å fange kinetikken i utviklingssyklusen og angi bildeopptaket til å inkludere flere Z-stabler med en rekke fokus som slutter på hver side av InFocus-sektoren, velg deretter relativ Z for bildebehandling, flere skiver i oppkjøpsvinduet og bruk bildestakkfilalternativet. for å angi at bildene skal lagres som TIFF-stakkfiler. For å identifisere inkluderingsspor, med endre utviklingsprofiler, bruk importcellen i EMS-skjermen, markdown Python notebook, til å importere inkluderingsspordataene fra stedene i sporstatistikk, CSV-filer til Pandas dataramme.Bruk beregn cellen til å beregne tiden for å ha maksimalt uttrykk for både tidlige og avdøde reportere for hvert spor, og bruk bokeh plotting pakken, i den halv max plot celle, for å visualisere tiden to halv maks uttrykk til halv maksimal uttrykk mot hctB prom. Bruk bokeh interaktive spor ID Explorer, for å identifisere inneslutninger fra mutant befolkningen, som faller utenfor mock behandlet scatter sky. For å visualisere endringer i promotoruttrykket kinetikk dynamisk i den animerte blodlegemer graf uttrykket intensiteter av EOU prom mot hctB prom.Deretter visualiserer du et øyeblikksbilde fra den animerte grafen, i inkluderingslokatorcellen. For å isolere utviklings newtons, fra inneslutninger av interesse, plassere synsfeltet over en brønn med en identifisert inkludering, og passere nålen over fase differensial interferens kontrast hvitt lys kanal lyskilde, for å visualisere nålen, bruk 595 nanometer, excitation kanal, for å visualisere elementære organer for utvinning. Og bruk finjusteringen og mikromanipulatoren, for å manøvrere kapillærnålen til inkluderingen, bryte inkluderingen med nålen, og bruk mikroinjektoren til å trekke de elementære kroppene inn i kapillærnålespissen.Fjern de ekstraherte elementære kroppene, fra kapillærnålen til en enkelt brønn, av den tilberedte ved 24 godt polystyrenplate, og bruk en ny kapillær nål til neste ekstraksjon. Etter en tilstrekkelig utvidelse av hver isolat, forstyrre den infiserte monolayer med en ett milliliter mikropipet tips og overføre medium celle rusk og utgitt klamydia inn i en ny 1,5 milliliter mikrocentrifuge tube. Pellet høstet klamydia ved sentrifugering, og resuspend pellet i 75 mikroliter iskald, sukrose fosfat glutamat buffer, deretter dele inkludering suspensjon likt, mellom tre nye 1,5 milliliter skrue cap mikro sentrifuge rør, og lagre rørene på minus 80 for å lese Celsius.For å sette opp en vertscellekultur for avbildning av mutagen ISED isolerer frø en 96 brønn glass bunnplate med 1,6 ganger 10 til den fjerde kostnaden syv celler, i 100 mikroliter av komplett medium per brønn. Etter at vertscellemonolaget når samløpet tine de høstede muterte klonene og de ville klamydialagrene på is og bruker en kolonne per isolat for å utføre, en to ganger seriell fortynning av hver mutantisore. Infisere, den gjenværende kolonnen med vill-type klamydia, ved et mangfold av infeksjon på ca 0,5, og plasser en plate i cellekulturinkubatoren i 10 timer på slutten av inkubasjonen, velg tre brønner per mutert isolat som tilsvarer en mangfold av infeksjon på mindre enn én, og generere en bildeposisjonsliste.bestående av to synsfelt per brønn. I denne scatterplot, tid til halv maksimal uttrykk for EOU og hctB arrangører fra individuelle klamydial isolater kan observeres kloner A3667 og B3858 ble valgt for isolasjon som de produserte kortere ganger for å ha maksimal uttrykk, fra EOU promotor og lengre ganger fire hctB. Inneslutninger med endret kinetikk kan identifiseres basert på visualiseringen, det dynamiske genuttrykket til de to promotorene, og et øyeblikksbilde av den animerte grafen kan brukes til å identifisere plasseringen av interesseforslutningene.I disse representative visualiseringene ble totalt 24 inneslutninger identifisert for isolasjon, hvorav 10 viste differensial kinetikk, ved retesting i tre forskjellige fenotypiske kategorier, viste åtte isolater redusert EOU promotoruttrykk ved ca. 24 timer etter infeksjon. Som demonstrert av A3667 klone, B3858 isolate, viste også en redusert EOU promotor uttrykk, på ca 24 timer etter infeksjon. Men en generell økning i hctB promotor uttrykk, mens B3662 isolere, uttrykte økte nivåer av florescence fra EOU arrangør etterfulgt av et plutselig tap av uttrykk i begge arrangører.Analyse av de levende cellemikrografene for muterte B3662, avslører at vertscellelyse oppstod, i celler infisert med denne mutanten, mye tidligere enn i ville typeinfiserte celler. Celletypeutvikling mangelfull klamydiagjenoppretting, kan ikke være mulig, da disse cellene ikke kan reinfisere verten. Genomomfattende foreningsstudier kan brukes etter isolasjon, for å identifisere utviklingsgener, gjennom statistisk korrelasjon, med inkorporering av alternative promotorer.Denne metoden kan utvides, til sondering av mange genetiske veier, inn i disseksjon av genetiske kretsmekanismer og andre intracellulære patogener.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En Screeningsteknikken å isolere Toxoplasma gondii Host-celle Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetiske tilnærminger i<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Bruke Fluorescent Proteiner å visualisere og kvantifisere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vekst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics vinduene ved hjelp Makrofager å identifisere<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gener Viktig for Resistance til IFN-γ-Dependent Cell Autonomous immunitet

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel og effektiv tilnærming til Konstruer Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral Transduksjon T-hjelpeceller som genetisk tilnærming å studere mekanismer kontrollere sine Differensiering og funksjon

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

En enkel røde blodceller Lysis Metode for opprettelse av B lymfoblastoide cellelinjer

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv og enkel metode for å etablere NK og T cellelinjer fra pasienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfeksjon

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuelle og mikroskopiske evaluering av Streptomyces utviklingsmessige mutanter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Live-Cell fluorescens mikroskopi å undersøke Subcellulære protein lokalisering og Cell morfologi endringer i bakterier

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...