Name: live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in chlamydia trachomatis
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Washington State Üniversitesi'nden Dr. Anders Omsland'a CIP-1 baltalı medyayı sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe R01AI130072, R21AI135691 ve R21AI113617 tarafından desteklenmiştir. Idaho Üniversitesi ve Merkezi Modelleme Karmaşık Etkileşimler için kendi NIH hibe P20GM104420 aracılığıyla başlangıç fonları tarafından ek destek sağlanmıştır.

Bu protokolde kullanılan tüm Python komut dosyaları Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. Mutagenize Muhabiri Klamidya
NOT: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EB'ler, eksenik ortam CIP-1'de etil metansülfonat (EMS) kullanılarak doğrudan mutajenleştirildi, çünkü bu ortam EB enfektivitesinin bakımını ve bakımını destekler12.
<ol><li>P2TK2-hctBprom-mKate2/...

<ol>
	<li>AbdelRahman, Y., Belland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chlamydial+developmental+cycle.">The chlamydial developmental cycle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).</li><li>Clifton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chlamydial+type+III+translocated+protein+is+tyrosine-phosphorylated+at+the+site+of+entry+and+associated+with+recruitment+of+actin.">A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).</li><li>Yu, H. H. Y., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#963;28+RNA+polymerase+regulates+hctB,+a+late+developmental+gene+in+Chlamydia.">&#963;28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia.</a> Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).</li><li>Koo, I., Stephens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Developmentally+Regulated+Two-component+Signal+Transduction+System+in+Chlamydia.">A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).</li><li>Grieshaber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Active+Metabolism+on+Elementary+Body+Transcript+Profile+and+Infectivity.">Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity.</a> Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).</li><li>Belland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of.">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis:+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Nguyen, B., Valdivia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches.">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li><li>Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> MBio. 7 (1), 01817 (2016).</li><li>Rosario, C. J., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+gene+product+EUO+is+a+transcriptional+repressor+that+selectively+regulates+promoters+of+Chlamydia+late+genes.">The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes.</a> Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).</li><li>Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+expression+of+hctB+encoding+a+strain-variant+chlamydial+histone-like+protein+with+DNA-binding+activity.">Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity.</a> Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).</li><li>Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stage-specific+metabolic+and+transcriptional+activity+of+Chlamydia+trachomatis+in+an+axenic+medium.">Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+binds+to+heparan+sulfate+receptors+on+epithelial+cells.">A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).</li><li>Edelstein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+&#181;Manager.">Computer control of microscopes using &#181;Manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Plotly Technologies Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Collaborative data science. , (2015).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues.">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).</li><li>Sega, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+genetic+effects+of+ethyl+methanesulfonate.">A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate.</a> Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).</li><li>Ferguson, L., Denny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+mutagenesis+by+acridines+and+other+reversibly+binding+DNA+ligands.">Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands.</a> Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).</li></ol>

Klamydial gelişim döngüsünü kontrol eden mekanizmaların incelenmesi, mevcut genetik araçların sınırlamaları nedeniyle engellenmiştir. Canlı hücreli otomatik mikroskopi ile birlikte organizatör-muhabirkla Klamidya'yı istihdam eden bir sistem, 24 saatlik bir süre içinde bireysel içermelerde hücre tipi gelişimin izlenmesini sağlayan bir sistem inşa edilmiştir. Bu sistem, kimyasal mutagenez ve doğrudan dahil izolasyon ile birlikte hızlı ve klonsal klamidya değiştirilmiş gelişi...

Klamidya trachomatis (Ctr) onun hayatta kalma ve proliferasyon için gerekli olan bir bifhasik gelişim döngüsü ile ilerler zorunlu bir hücre içipatojen1. Bu döngü iki gelişimsel formdan oluşur: temel gövde (EB) ve retikülat gövdesi (RB). EB çoğaltma yetersiz ama etkili veya indüklenen endocytosis2ile hücre invazyonu aracılık . Bir kez ana bilgisayarda, EB çoğaltıcı RB olgunlaşır. RB, sonraki enfeksiyon turlarını başlatmak için EB'ye geri dönmeden önce birden fazla çoğaltma turu yapar.
Genetik araçların sınırlı dizi biyokimyasal çalışmalar veya vekil sistemlerin kullanımı için klamydial araştırma çoğu kısıtlamıştır. Sonuç olarak, gen regülasyonu ve gelişim döngüsünün kontrolü açıklaması zor olmuştur3,4. Klamydial alanında daha önemli sorunlardan biri klamydial gelişim döngüsünün yüksek çözünürlüklü zamansal izleme ve onun düzenlenmesinde yer proteinlerin belirlenmesidir. Klamydial gelişim döngüsü sırasında gen ekspresyonu geleneksel RNAseq, qPCR ve sabit hücre mikroskobu5dahil yıkıcı "bitiş noktası" yöntemleri ile yapılmıştır 5,6. Bu yöntemler paha biçilmez bilgiler sağlasa da, kullanılan teknikler zahmetli dir ve düşük zamansal çözünürlüğesahiptir 5,6.
Son on yıl içinde, Ctr genetik manipülasyon plazmid dönüşüm ve mutagenesis,7,8,9için yöntemlerin giriş ile ilerlemiştir. Bu çalışma için, plazmid tabanlı bir sistem bir enfeksiyon boyunca gerçek zamanlı olarak bireysel inklütal gelişimi izlemek için geliştirilmiştir. Bir chlamydial transformant hem bir RB ve EB hücre tipi özel organizatör-muhabir ifade oluşturuldu. RB özel muhabiri floresan protein Yonca erken RB gen euo upstream organizatörü eriterek inşa edilmiştir. EUO geç EB ilişkili genlerin bir alt kümesi bastırır transkripsiyondüzenleyici10. HCTBorganizatörü , EB nükleoid yoğuşması dahil bir histon benzeri protein kodlar, doğrudan mKate2 (RFP) upstream EB özel muhabir oluşturmak için klonlandı11. hctBprom-mKate2/euoprom-Clover için omurga p2TK2SW27oldu. HctB ve euo organizatörleri Ctr-L2 genomik DNA'sından güçlendirilmiştir. Her organizatör dizisi belirtilen klamydial gen artı ilgili ORF ilk 30 nükleotit (10 amino asit) için öngörülen transkripsiyon başlangıç alanının yukarı ~ 100 baz çiftleri oluşuyordu. Floresan FP varyantları ticari olarak Ctr kodonu optimize gen blokları olarak elde edildi ve her bir klamydial gen ve promotör ilk 30 nükleotit ile çerçeve içinde klonlanmış. IncD terminatör doğrudan mKate2 aşağı klonlanmış oldu. İkinci organizatör-muhabir incD terminatör aşağı yerleştirildi. P2TK2SW2'deki ampisilin direnç geni(bla)pBam4'ten aadA geni (Spectinomycin direnci) ile değiştirildi. Bu son yapı p2TK2 sonuçlandı-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Şekil 1A) Ctr-L27dönüştürülmüştür . Bu RB/EB muhabiri, canlı hücre mikroskopisi kullanılarak tek dahil ler içinde gelişim döngüsünün gözlemlemesine olanak sağlar (Şekil 1B,C).
Organizatör-muhabir yapımımızı kimyasal mutagenez ile birlikte kullanan bir protokol, Ctr serovar L2'nin mutajenleşmiş popülasyonlarından gelişimsel anormallikler sergileyen bireysel klonları izlemek ve izole etmek için bir protokol geliştirildi. Bu protokol, tek tek klamydial inklüetlerin doğrudan izlenmesine, zaman içinde gen ekspresyonunun izlenmesine, değişmiş bir gelişimsel gen ekspresyonu deseni ifade eden klamyal klonların tanımlanmasına ve Klamidya'nın tek tek içermelerden klonal izolasyonuna olanak sağlar.
Bu protokol özellikle klamydial gelişime dahil olan genlerin tanımlanması için oluşturulmuş olsa da, herhangi bir sayıda kimydial genetik yolu sorgulamak için kolayca uyarlanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well polystyrene plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td>Cell culture growth for reinfection of isolates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td>Cell culture growth for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Cell culture growth for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bold line CO2 Unit</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>CO2 UNIT BL</td>
			<td>Stage incubator CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bold line T Unit</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td>
			<td>Stage incubator temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B1005010</td>
			<td>Capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-514/30-25</td>
			<td>Fluoescent filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-641/75-25</td>
			<td>Fluoescent filter cube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydia trachmatis serovar L2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-577</td>
			<td>Chlamydia trachomatis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIP-1 media</td>
			<td>In house</td>
			<td>NA</td>
			<td>Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 &#956;M amino acids, 0.5 
			mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 &#956;M GTP, UTP, and 
			CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cos-7 cells (ATCC)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cell (host cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194527</td>
			<td>Host cell growth inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC205260100</td>
			<td>Mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Plex</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-602</td>
			<td>Supplement for base growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>NA</td>
			<td>Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy 170 S CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO1700100X</td>
			<td>Cell culture incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin 10mg/ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td>Antibiotic for growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CM</td>
			<td>Host cells rinse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Amersham Life Science</td>
			<td>16920</td>
			<td>inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td>pH buffer for growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5179 000.018</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter Notebook</td>
			<td>https://jupyter.org/</td>
			<td>NA</td>
			<td>Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 10-3</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>LB10-3</td>
			<td>Filter wheel controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oko Touch</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>Oko Touch</td>
			<td>Interface to control the Bold line T and CO2 Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior XY stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>H107</td>
			<td>Motorized XY microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrismR Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C2500-R</td>
			<td>Temperature controlled microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Problot Hybridization oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>H1200A</td>
			<td>Rocking Incubator for infection with Chlamydia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Prior</td>
			<td>H30V4</td>
			<td>XYZ microscope stage controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Class 2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>362804</td>
			<td>Cell culture work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no phenol red)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td>Base growth media for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (phenol red)</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td>Base growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm)</td>
			<td>scopeLED</td>
			<td>F140</td>
			<td>Excitation light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-338-550</td>
			<td>Sonicator, resuspending chlamydial pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage incubator</td>
			<td>OKO Labs</td>
			<td>H301-K-FRAME</td>
			<td>Cluster well plate incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG)</td>
			<td>In house</td>
			<td>NA</td>
			<td>Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Cell culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE 300 inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>16724</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THOR LED</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>White light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Dislodges host cells from flask for seeding into plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ZYLA-5.5-USB3</td>
			<td>imaging camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;Manager 2.0gamma</td>
			<td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td>
			<td>NA</td>
			<td>Open sourse automated microscope control software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in chlamydia trachomatis

Hücre içi bakteriyel patojen Klamidya trachomatis iki morfolojik ayrık gelişim formundan oluşan bir gelişim döngüsünden geçer. Replikatif olmayan temel cisim (EB) konaklayıcının enfeksiyonunu başlatır. Bir kez içinde, EB reticulate vücut (RB) içine ayırt eder. RB daha sonra bulaşıcı EB formuna geri ayırt etmeden önce, çoğaltma birden fazla tur uğrar. Hücre türleri arasında geçiş başarısızlığı ya ana konak işgali veya çoğaltma önler gibi bu döngü klamydial sağkalım için gereklidir.
Klamidya'nın zorunlu hücre içi doğasınedeniyle genetik tekniklerde sınırlamalar hücre tipi gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmaların tanımlanmasını engellemiştir. Canlı hücre mikroskobu ile birlikte hücre tipi anahtarlamanın gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak tanıyan yeni bir çift promotör-muhabir plazmid sistemi tasarladık. Hücre tipi gelişimin düzenlenmesinde yer alan genleri belirlemek için, canlı hücre promotör-muhabir sistemi, çift muhabir in kimyasal mutagenezi birleştirerek ileri genetik bir yaklaşım geliştirilmesi için kaldıraçlı, görüntüleme ve altered gelişimsel kinetik ile Klamidya izleme, mutantların klonal izolasyon izledi. Bu ileri genetik iş akışı genetik yollar geniş bir yelpazede içine yönlendirilmiş sorgulama için değiştirilebilir esnek bir araçtır.

Organizatörümüzün-muhabir chlamydial zorlanmamızın direkt EMS mutagenezi, enfektelikte ~%75 azalma ile sonuçlandı. Açıklanan canlı hücre görüntüleme protokolü kullanılarak, ~600 dahil etme 24 saatlik bir süre boyunca görüntülendi ve izlendi. Her iki muhabirin floresan ifade kinetiği özel Python not defteri komut dosyaları kullanılarak görselleştirildi. İzolasyon için aday mutajenize Chlamydia belirlemek için iki görselleştirme yaklaşımı uygulanmıştır. İlk metodoloji (adım ...

Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis at JoVE.com

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Bu protokol, Klamidya trachomatisgelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için yönlendirilmiş ileri genetik yaklaşımda floresan organizatör-muhabirler, canlı hücre mikroskobu ve bireysel dahil çıkarma kullanır.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Bu protokol, klamidyanın değiştirilmiş gelişimsel profillerle üretimi ve izolasyonu için benzersiz bir araç sağlar ve sonuçta gelişim döngüsünü düzenleyen genlerin tanımlanmasına olanak sağlar. Bu yöntemin başlıca avantajları, klamidya hücre tipi gelişimini gerçek zamanlı olarak takip edebilme yeteneği ve klamidyayı izole edebilme yeteneğidir. Bir klamidya trachomatis muhabirini susturmak için, yedinci temel bedenlere yaklaşık üç kez 10.'yu içeren bir klamyan stoğu gördüm.İlgi ve pelet muhabir plazma ile dönüştürülmüş, düşünce santrifüj ile stoklanır. 10 saniye boyunca % 10 güçte sonication kullanın, kazara metabolizma tampon 100 mikrolitre temel organları yeniden askıya almak ve eşit olarak ortaya çıkan temel vücut süspansiyon bölünmüş, iki 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpler arasında. Mutagenez için klamidya aliquots içine taze hazırlanmış EMS metabolizma çözeltisi 50 mikrolitre ve sadece stok mutagenezi için chlamydial aliquot için vaccinic metabolizma tampon 50 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca her iki örnek kuluçka.EMS kullanım sırasında bilinen bir karsinojen eldiven giymek, ve tüm EMS kontamine ekipman ve orta, bir azı lı sodyum hidroksit için 24 saat boyunca ıslatın. Bir toptan kültür kurmak için, görüntüleme ve mutigenize klamidya trachometers izolasyon için. Tohum altı iyi cam alt plakalar, altı kez 10 beşinci maliyet yedi hücreleri, iyi başına tam orta iki mililitre ve tohum 24 iyi polistiren plaka ile 10 beşinci neden iyi başına tam orta bir mililitre yedi hücre.Mutagenized inkar klamidya trachomatis enfekte ile konak hücre kültürü enfekte etmek için, yaklaşık altı kez 10 ile cam dipli plaka beş Wells, mutajenize temel organların. Kuyu başına 1,5 mililitre buz gibi HBSS. ve kalan kuyuya yaklaşık iki kez 10 ile beşinci alay mutajenize ilköğretim organları ile 1.5 iyi başına buz soğuk HBSS mililitre, 37 santigrat derece bir 15 dakikalık kuluçka sonra, sallanan ile, 37 derece Santigrat HBSS heparin mililitre başına bir miligram ile takviye ile enfekte hücreleri yıkayın, hemen bir HBSS durulama takip.tekrar heparin ile hücreleri yıkayın, hemen sonra sadece HBSS ile iki durulama tüm heparin kaldırılır emin olmak için. Son yıkamadan sonra, her kuyuya 37 santigrat derece görüntüleme ortamıdört mililitre ekleyin. Ve 37 santigrat derece deiyonize su ile inter kuyu boşluklarını doldurun sonra 10 saat boyunca hücre kültürü kuluçka plakaları yerleştirin.Kuluçka sonunda mikroskop evresi kuluçka makinesini %5 karbondioksit ve 37 santigrat dereceye ayarladı. Ve altı kuyu cam alt plaka, sahne kuluçka içine yerleştirin. Görüntüleme yazılımında, altı kuyu plakası şablonunu seçmek için yüksek içerik tarama eklentisini kullanın ve otomatik görüntüleme için odaklamayı ayarlamak için otofokus seçeneğini kullanın ve GFB kanalında %4 yoğunlukta 250 milisaniyeye ve RFP kanalında yoğunluğu %18'e ayarlamak için iyi görüş başına 12 alandan oluşan bir görüntüleme konum listesi oluşturun.Yani 24 saat boyunca görüntüleme döngüsünde, 30 dakikalık aralıklarla, gelişim döngüsünün kinetik yakalamak ve inFocus dilimin her iki tarafında sona eren odak aralığı ile birden fazla Z yığınları içerecek şekilde görüntü yakalama ayarlamak için, sonra görüntüleme için göreli Z seçin, edinme penceresinde birden fazla dilim ve görüntü yığını dosyasını kullanın. görüntüleri TIFF yığın dosyaları olarak kaydedilecek şekilde ayarlamak için. Geliştirme profillerini değiştirerek dahil etme parçalarını belirlemek için, EMS ekranındaki alma hücresini, Python not defterini işaretlemeyi kullanarak izleme istatistiklerindeki noktalardan, CSV dosyalarını Panda'nın veri çerçevesine aktarın.Her parça için hem erken hem de geç muhabirler için maksimum ifadeye sahip olmak için zamanı hesaplamak için hesap hücresini kullanın ve yarım max plot hücresindeki bokeh çizim paketini kullanarak hctB baloya karşı iki yarım max ifadeden yarım maksimal ifadeye kadar görselleştirin. Sahte işlenmiş dağılım bulutunun dışında kalan mutant popülasyonundan gelen eklemeleri belirlemek için bokeh etkileşimli parça ID Explorer'ı kullanın. Animasyonlu kan hücresi grafiğinde organizatör ekspresyonu kinetiğindeki değişiklikleri dinamik olarak görselleştirmek için HCTB balosuna karşı EOU balosundaki ifade yoğunlukları.Ardından, ekletme bulucu hücresindeanimasyon grafiğinden anlık görüntü alın. Gelişimsel Newton'ları, ilginin dahil edilmesinden izole etmek için, görüş alanını tanımlanmış bir dahil etme ile bir kuyunun üzerine yerleştirin ve iğneyi faz diferansiyel girişim kontrastı beyaz ışık kanalı ışık kaynağının üzerinden geçirin, iğneyi görselleştirmek için, 595 nanometreyi, uyarma kanalını kullanarak temel gövdeleri ekstraksiyon için görselleştirin. Ve ince ayarı ve mikro manipülatör kullanın, dahil kılcal iğne manevra, iğne ile dahil rüptür, ve kılcal iğne ucu içine temel organları çizmek için mikro enjektör kullanın.Çıkarılan temel cisimleri, kılcal iğneden tek bir kuyuya, 24 kuyu polistiren plakada hazırlananlardan dışarı atın ve bir sonraki ekstraksiyon için yeni bir kılcal iğne kullanın. Her izole yeterli bir genişleme sonra, bir mililitre likit mikropipet ucu ile enfekte monolayer bozmak ve orta hücre enkaz transferi ve yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine klamidya serbest. Pelet santrifüj tarafından hasat klamidya, ve buz soğuk 75 mikrolitre pelet resuspend, sakaroz fosfat glutamat tampon, sonra eşit dahil süspansiyon bölünmüş, üç yeni 1.5 mililitre vidalı kapak mikro santrifüj tüpler arasında, ve eksi 80 santigrat okumak için tüpleri saklayın.Mutajen ISED görüntüleme için bir konak hücre kültürü kurmak için tohum izole 1.6 kez 10 ile dördüncü maliyet yedi hücreleri, kuyu başına tam orta 100 mikrolitre. Konak hücre monolayer bilgili mutant klonlar ve buz üzerinde yabani tip klamidya stokları çözülme ulaştıktan sonra ve gerçekleştirmek için izole başına bir sütun kullanın, her mutant izole iki kat seri seyreltme. Enfekte, yabani tip klamidya ile kalan sütun, yaklaşık 0,5 enfeksiyon çokluğu, ve kuluçka sonunda 10 saat boyunca hücre kültürü kuluçka bir plaka yerleştirin, az bir enfeksiyon çokluğu karşılık gelen mutant izole başına üç kuyu seçin, ve bir görüntüleme konum listesi oluşturmak.her kuyu için iki görüş alanından oluşur. Bu scatterplot, EOU ve hctB organizatörleri bireysel chlamydial izole gelen yarım maksimal ifade zamanı, eou organizatörü ve daha uzun kez dört hctB maksimal ifade için daha kısa kez üretilen olarak izolasyon için seçildi klonlar görülebilir. Değiştirilmiş kinetik içeren eklemeler, iki promotörün dinamik gen ekspresyonunun görselleştirilmesine, iki promotörün dinamik gen ekspresyonuna dayalı olarak tanımlanabilir ve ilgi nin dahil edildiğinin yerini belirlemek için animasyonlu grafiğin anlık görüntüsü kullanılabilir.Bu temsili görselleştirmelerde, 10'u diferansiyel kinetik sergilenen izolasyon için toplam 24 dahil lik tespit edilmiştir, üç farklı fenotipik kategoride yeniden test edildikten sonra, sekiz izole, yaklaşık 24 saat sonrası enfeksiyon sonrası azalmış EOU promotör ekspresyonu sergilenmiştir. A3667 klon tarafından gösterildiği gibi, B3858 izole, ayrıca azalmış bir EOU promotör ifadesi sergiledi, yaklaşık 24 saat sonrası enfeksiyon. Ama hctB promotör ekspresyonunda genel bir artış, B3662 izole ise, EOU organizatörü floresan artan düzeyde ifade her iki promotörler ifade ani bir kayıp izledi.Mutant B3662 için canlı hücre mikrograflarının analizi, konak hücre lisisinin bu mutantla enfekte olmuş hücrelerde, yabani tip enfekte hücrelerden çok daha erken meydana geldiğini ortaya koymaktadır. Hücre tipi gelişimi eksik klamidya kurtarma, bu hücreler konak reinfect olamaz gibi, mümkün olmayabilir. Genom geniş ilişki çalışmaları izolasyondan sonra, gelişimsel genleri tanımlamak için, istatistiksel korelasyon yoluyla, alternatif organizatör muhabirlerin dahil edilmesi yle birlikte kullanılabilir.Bu yöntem, çok sayıda genetik yolların araştırılması, genetik devre mekanizmalarının diseksiyon içine, ve diğer hücre içi patojenler genişletilebilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...