Vores protokol er vigtig, fordi den giver forskere, der arbejder på ikke-modelsvampe, mulighed for at etablere avancerede genomredigeringsteknologier i deres laboratorier. Da denne protokol ikke er afhængig af eksisterende teknikker, såsom ekspressionssystemer, har den fordel, at den er lettere at etablere i systemer, der ikke er modeller. Denne metode kan bruges på tværs af forskellige svamp arter og kan bruges til at belyse funktioner af gener, der er involveret i vej parring, vækst, og patogenicitet.
Så når du udfører denne procedure, skal man være sikker på at have nok på hinanden følgende dage for at konkurrere protokollen, da der kun er et par punkter i eksperimentet, hvor det kan sættes på pause. For at høste conidia, filtrere flydende kultur gennem et lag af sterile laboratorieklud i 50 milliliter centrifuge rør til centrifugering. Resuspend conidia pellet i fem milliliter vand og se en 10 mikroliter aliquot af conidia opløsningen under et lysmikroskop ved en 40X forstørrelse for at bekræfte, at kun conidia er blevet inddrevet.
Dernæst tilsættes 200 milliliter frisk 1% maltekstraktbouillon til en 500 milliliterkolbe og overføres hele konidiamængden til kolben. Derefter inkubere den flydende kultur i op til 12 timer i en 25 grader Celsius ryste inkubator på 120 omdrejninger i minuttet. For at høste kimlingerne overføres kulturen til 50 millilitercentrifugerør til centrifugering og resuspenderede kimlingerne i op til 10 milliliter af en molære sorbitol.
Der tilsættes en milliliter kimopløsning til forskellige koncentrationer af enzymopløsning, og sporeenzymopløsningen inkuberes i to til tre timer i rystekubatoren ved 80 omdrejninger i minuttet. For at høste protoplasterne filtreres enzymopløsningen gennem et lag sterilt laboratorieklud og protoplasterne opsamres ved centrifugering. Derefter skal protoplastpillepen resuspenres igen i 200 mikroliter af STC-buffer, og der kontrolleres en 10 mikroliter aliquot af opløsningen under et mikroskop for at bekræfte, at kun protoplast er blevet inddrevet.
For at begynde omdannelsen, kombinere ca fem gange 10 til de seks protoplasts med et enkelt volumen af ribonucleoprotein opløsning og cirka seks mikrogram af donor DNA fragment. Brug derefter en pipette til langsomt og jævnt dryp en milliliter frisklavet 30% PTC opløsning på protoplast suspensionen for at skabe et hydrofobisk lag over protoplasterne og inkubere opløsningen i 20 minutter ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen tilsættes fem milliliter osmotisk kontrolmedium til protoplastaffjedringen, der pipetteres langsomt og forsigtigt for at blande opløsningen grundigt.
Efter blanding inkuberes protoplastopløsningen i rystekubatoren ved 80 omdrejninger i minuttet natten over. Næste morgen skal du dele opløsningen mellem fem 60 millimeter kulturplader. Tilsæt 10 milliliter osmotisk kontrol medium agar suppleret med 30 mikrogram pr. milliliter Hygromycin B til hver plade og drej langsomt hver plade for at blande.
Lad det første lag af agar indstille, før du tilføjer 10 milliliter osmotisk kontrol medium agar suppleret med 40 mikrogram pr. milliliter Hygromycin B to hver plade. Efter at have tilladt det andet lag af agar at indstille, inkubere kulturerne på 25 grader Celsius, indtil enkelt isolater kan observeres vokser gennem begge lag af agar. For at genvinde de vellykkede transformerede isolater skal de enkelte vækstbetonedende isolater overføres til friske maltekstraktgarplader suppleret med 50 mikrogram per milliliter Hygromycin B.To vurdere virkningerne af den målrettede genforstyrrelse på svampens heterothalliske kapacitet, co-inokulate frisk maltekstrakt agarmedium med en mutantstamme samt en stamme af den modsatte parringstype.
Når du arbejder med H.omanensis, dække, men ikke forsegle pladerne. Anst samme tallerkener ved stuetemperatur i syv dage. Ved slutningen af inkubationen, visuelt vurdere for produktionen af seksuelle strukturer.
For at teste den mutante stammes homothalliske egenskaber skal du inokulere frisk maltekstrakt agarmed den mutante interessestamme og inkubere pladen ved stuetemperatur i en uge som påvist. For at vurdere forstyrrelsernes indvirkning på vækstraten for den undersøgte svamp skal du indsætte bagsiden af en stor steril pipettespids i de aktivt voksende kanter af kulturen i hver mutant og vild-type stamme af interesse for at skabe mycelial-dækket agar stik og inoculate frisk malt ekstrakt agar medium. Der skal foretages mindst tre replikater pr. kulturtype.
Efter tre dages vækst ved 20 grader Celsius måles væksten i hver plade på to vinkelrette diametre. Conidia anvendes som udgangsmateriale til protokollen får lov til at spire og vokse, indtil de bliver unge kimner. Bemærk, at modne myceliale tråde som disse er for modne til nedbrydning og bør ikke anvendes.
Når cellerne ikke længere har cellevægge, bliver de meget følsomme over for mekaniske forstyrrelser og frigiver runde protoplaster, der kan høstes til transformation. Protokollens succes kan bekræftes ved en fænotopisk analyse af mutantstammerne. For denne mutant MAT 127 isolat blev den vegetative radiale vækstrate reduceret betydeligt, hvilket tyder på en pleiotropisk effekt for det nye parringsgen.
Desuden var det mutante isolat ude af stand til at fuldføre en seksuel cyklus, der kun producerede umodne seksuelle strukturer, der ikke producerede seksuelle sporer sammenlignet med det vildtlignende isolat, som afsluttede hele den seksuelle cyklus inden for få dage efter inkubationen. RNA er meget følsom og nedbryder meget let. Derfor er et rent arbejdsmiljø og et hurtigt arbejde på is afgørende for dette eksperiments succes.
Når mutant isolat er blevet genereret, kan de blive udsat for fænotopypisk eller RNA-seq analyse som passende for det gen, der karakteriseres.
