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June 9th, 2020
DOI :
June 9th, 2020
•0:04
Introduction
1:04
Protoplast Extraction
2:41
Protoplast and PEG-Assisted Transformation and Transformant Recovery
4:27
Phenotypic Mutant Strain Analysis
5:42
Results: Representative Protoplast Extraction and Isolate Phenotype Analysis
6:45
Conclusion
Transcript
हमारा प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह गैर मॉडल कवक पर काम कर रहे शोधकर्ताओं को अपनी प्रयोगशालाओं में अत्याधुनिक जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों की स्थापना का अवसर देता है । चूंकि यह अभिव्यक्ति प्रणालियों जैसी मौजूदा तकनीकों पर भरोसा नहीं करता है, इसलिए इस प्रोटोकॉल को गैर-मॉडल प्रणालियों में स्थापित करना आसान होने का लाभ है। इस विधि का उपयोग विभिन्न कवक प्रजातियों में किया जा सकता है और इसका उपयोग मार्ग संभोग, विकास और रोगजनकता में शामिल जीन के कार्यों को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।
इसलिए इस प्रक्रिया को करते समय, प्रोटोकॉल का मुकाबला करने के लिए लगातार पर्याप्त दिन होना निश्चित होना चाहिए क्योंकि प्रयोग में केवल कुछ बिंदु हैं जिन पर इसे रोका जा सकता है। कोनिडिया को फसल करने के लिए, अपकेंद्री के लिए 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों में बाँझ प्रयोगशाला कपड़े की एक परत के माध्यम से तरल संस्कृति को फ़िल्टर करें। पांच मिलीलीटर पानी में कोनिडिया गोली को फिर से खर्च करें और 40X आवर्धन पर एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत कोनिडिया समाधान के 10 माइक्रोलीटर एलिकोट देखें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि केवल कोनिडिया बरामद किया गया है ।
इसके बाद, 500 मिलीलीटर फ्लास्क में ताजा 1% माल्ट एक्सट्रैक्ट शोरबा के 200 मिलीलीटर जोड़ें और कोनिडिया की पूरी मात्रा को फ्लास्क में स्थानांतरित करें। फिर तरल संस्कृति को 120 क्रांतियों प्रति मिनट पर इनक्यूबेटर मिलाते हुए 25 डिग्री सेल्सियस में 12 घंटे तक इनक्यूबेट करें। जर्मलिंग को फसल करने के लिए, संस्कृति को अपकेंद्रित्र के लिए 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और एक मोलर सोर्बिटोल के 10 मिलीलीटर तक में जर्मलिंग को फिर से खर्च करें।
एंजाइम समाधान की विभिन्न सांद्रता के लिए अंकुरित समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें और प्रति मिनट 80 क्रांतियों पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में दो से तीन घंटे के लिए बीजाणु एंजाइम समाधान को इनक्यूबेट करें। प्रोटोप्लास्ट को फसल करने के लिए, बाँझ प्रयोगशाला कपड़े की एक परत के माध्यम से एंजाइम समाधान को फ़िल्टर करें और अपकेंद्रित्र द्वारा प्रोटोप्लास्ट एकत्र करें। फिर ध्यान से एसटीसी बफर के 200 माइक्रोलीटर में प्रोटोप्लास्ट गोली को फिर से रीसस्ट करें और एक माइक्रोस्कोप के नीचे समाधान के 10 माइक्रोलीटर एलिकोट की जांच करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि केवल प्रोटोप्लास्ट बरामद किए गए हैं।
परिवर्तन शुरू करने के लिए, राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन समाधान की एक मात्रा और दाता डीएनए टुकड़े के लगभग छह माइक्रोग्राम के साथ छह प्रोटोप्लास्ट के लिए लगभग पांच गुना 10 गठबंधन करें। इसके बाद, प्रोटोप्लास्ट पर हाइड्रोफोबिक परत बनाने और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए समाधान को इनक्यूबेट करने के लिए प्रोटोप्लास्ट निलंबन पर हौसले से तैयार 30% पीटीसी समाधान के एक मिलीलीटर को धीरे-धीरे और समान रूप से ड्रिप करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। इनक्यूबेशन के अंत में, प्रोटोप्लास्ट निलंबन में ऑस्मोटिक नियंत्रण माध्यम के पांच मिलीलीटर जोड़ें, धीरे-धीरे और धीरे-धीरे समाधान को अच्छी तरह से मिलाने के लिए पिपिंग करें।
मिश्रण के बाद, रात भर प्रति मिनट 80 क्रांतियों पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में प्रोटोप्लास्ट समाधान को इनक्यूबेट करें। अगली सुबह, समाधान को पांच 60 मिलीमीटर संस्कृति प्लेटों के बीच विभाजित करें। प्रत्येक प्लेट में हाइग्रोमाइसिन बी के 30 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ 10 मिलीलीटर ऑस्मोटिक कंट्रोल मीडियम एगर पूरक जोड़ें और धीरे-धीरे प्रत्येक प्लेट को मिलाने के लिए घुमाएं।
एगर की पहली परत को 10 मिलीलीटर ऑस्मोटिक कंट्रोल मीडियम एगर को जोड़ने से पहले सेट करने की अनुमति दें, जो हाइग्रोमाइसिन बी दो प्रत्येक प्लेट के 40 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक है। आगर की दूसरी परत को सेट करने की अनुमति देने के बाद, संस्कृतियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि एकल आइसोलेट को आगर की दोनों परतों के माध्यम से बढ़ते हुए देखा जा सकता है। सफलतापूर्वक रूपांतरित आइसोलेट्स को ठीक करने के लिए, हाइग्रोमाइसिन के 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक ताजा माल्ट निकालने के लिए व्यक्तिगत विकास-सक्षम आइसोलेट्स को स्थानांतरित करें B.To कवक की हेट्रोथलिक क्षमताओं पर लक्षित जीन व्यवधान के प्रभावों का आकलन करें, सह-टीका फ्रेश माल्ट निकालने एगर माध्यम के साथ एक उत्परिवर्ती तनाव के साथ-साथ विपरीत संभोग प्रकार का तनाव।
H.omanensis के साथ काम करते समय, कवर लेकिन प्लेटों को सील नहीं है। प्लेटों को सात दिनों तक कमरे के तापमान पर रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, नेत्रहीन यौन संरचनाओं के उत्पादन के लिए आकलन करते हैं।
उत्परिवर्ती तनाव की होमोथैलिक क्षमताओं का परीक्षण करने के लिए, ब्याज के उत्परिवर्ती तनाव के साथ ताजा माल्ट निकालने आगर माध्यम टीका और प्रदर्शन के रूप में एक सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट । कवक की विकास दर पर व्यवधान के प्रभावों का आकलन करने के लिए, अध्ययन किया जा रहा है, प्रत्येक उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के ब्याज की संस्कृति के सक्रिय रूप से बढ़ते किनारों में एक बड़े बाँझ पिपेट टिप की पीठ डालें ताकि माइसेल-कवर एगर प्लग बनाए जा सके और ताजा माल्ट निकालने आगर माध्यम को टीका लगाया जा सके। संस्कृति प्रकार के अनुसार कम से कम तीन प्रतिकृतियां की जानी चाहिए।
20 डिग्री सेल्सियस पर विकास के तीन दिनों के बाद, दो लंबवत व्यास पर प्रत्येक थाली में वृद्धि को मापने । प्रोटोकॉल के लिए शुरुआती सामग्री के रूप में उपयोग किए जाने वाले कोनिडिया को अंकुरित होने और बढ़ने की अनुमति है जब तक कि वे युवा अंकुरित नहीं हो जाते। ध्यान दें कि परिपक्व माइसेलियल किस्में जैसे कि ये गिरावट के लिए बहुत परिपक्व हैं और इसका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।
जब कोशिकाओं में अब सेल दीवारें नहीं होती हैं, तो वे यांत्रिक व्यवधान के प्रति बहुत संवेदनशील हो जाते हैं और गोल प्रोटोप्लास्ट जारी करते हैं जिन्हें परिवर्तन के लिए काटा जा सकता है। उत्परिवर्ती उपभेदों के फेनोटाइपिक विश्लेषण पर प्रोटोकॉल की सफलता की पुष्टि की जा सकती है। इस उत्परिवर्ती मैट 127 अलग-थलग करने के लिए, वनस्पति रेडियल विकास दर को काफी कम कर दिया गया था, जो उपन्यास संभोग जीन के लिए एक प्लियोट्रोपिक प्रभाव का सुझाव देता है।
इसके अलावा, उत्परिवर्ती आइसोलेशन केवल अपरिपक्व यौन संरचनाओं का उत्पादन करने वाले यौन चक्र को पूरा करने में असमर्थ था जो जंगली प्रकार के अलग-थलग होने की तुलना में यौन बीजाणुओं का उत्पादन नहीं करता था जिसने इनक्यूबेशन के कुछ दिनों के भीतर पूरे यौन चक्र को पूरा किया। आरएनए बहुत संवेदनशील है और बहुत आसानी से नीचा दिखाता है। इसलिए, एक स्वच्छ काम वातावरण और बर्फ पर जल्दी से काम करना दोनों इस प्रयोग की सफलता के लिए आवश्यक हैं ।
एक बार उत्परिवर्ती अलग सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया है, वे जीन की विशेषता के लिए उपयुक्त के रूप में phenotypic या आरएनए-seq विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है ।
CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली एक आसान करने के लिए उपयोग जीनोम संपादक है कि मॉडल और गैर मॉडल प्रजातियों में इस्तेमाल किया गया है । यहां हम इस प्रणाली का एक प्रोटीन-आधारित संस्करण प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग एक गैर-मॉडल फिलामेंटस असोमीसिटस कवक के संभोग जीन में समय से पहले स्टॉप कोडन पेश करने के लिए किया गया था।
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