Vår protokoll er betydelig fordi den gjør det mulig for forskere som jobber med ikke-modell sopp muligheten til å etablere banebrytende genomredigeringsteknologier i sine laboratorier. Siden den ikke er avhengig av eksisterende teknikker, for eksempel uttrykkssystemer, har denne protokollen fordelen av å være enklere å etablere i ikke-modellsystemer. Denne metoden kan brukes på tvers av forskjellige sopparter og kan brukes til å belyse funksjoner av gener som er involvert i veiparring, vekst og patogenitet.
Så når du utfører denne prosedyren, må man være sikker på å ha nok sammenhengende dager for å konkurrere protokollen, da det bare er noen få punkter i eksperimentet der den kan settes på pause. For å høste konidia, filtrer væskekulturen gjennom et lag med steril laboratorieklut i 50 milliliter sentrifugerør for sentrifugering. Resuspend conidia pellet i fem milliliter vann og vise en 10 mikroliter aliquot av conidia løsningen under et lett mikroskop ved en 40X forstørrelse for å bekrefte at bare conidia har blitt gjenopprettet.
Deretter legger du til 200 milliliter fersk 1% maltekstraktbuljong til en 500 milliliter kolbe og overfører hele volumet av conidia til kolben. Deretter inkubere væskekulturen i opptil 12 timer i en 25 graders Celsius risting inkubator ved 120 omdreininger per minutt. For å høste germlings, overføre kulturen til 50 milliliter sentrifuge rør for sentrifugering og resuspend germlings i opptil 10 milliliter av en molar sorbitol.
Tilsett en milliliter germling løsning til ulike konsentrasjoner av enzymoppløsning og inkubere sporeenzymoppløsningen i to til tre timer i risting inkubatoren ved 80 omdreininger per minutt. For å høste protoplastene, filtrer enzymoppløsningen gjennom et lag med steril laboratorieklut og samle protoplastene ved sentrifugering. Deretter forsiktig resuspend protoplast pellet i 200 mikroliter av STC buffer og sjekk en 10 mikroliter aliquot av løsningen under et mikroskop for å bekrefte at bare protoplaster er gjenopprettet.
For å starte transformasjonen, kombinere omtrent fem ganger 10 til de seks protoplastene med et enkelt volum ribonucleoprotein løsning og omtrent seks mikrogram av donor DNA fragment. Deretter bruker du en pipette til å dryppe langsomt og jevnt en milliliter nylaget 30% PTC-løsning på protoplastfjæringen for å skape et hydrofobt lag over protoplastene og inkubere løsningen i 20 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, tilsett fem milliliter osmotisk kontrollmedium til protoplastfjæringen, pipettering sakte og forsiktig for å blande oppløsningen grundig.
Etter blanding inkuber protoplastløsningen i ristingsinkubatoren ved 80 omdreininger per minutt over natten. Neste morgen, dele løsningen mellom fem 60 millimeter kultur plater. Tilsett 10 milliliter osmotisk kontrollmedium agar supplert med 30 mikrogram per milliliter Hygromycin B til hver plate og roter sakte hver plate for å blande.
La det første laget av agar sette før du legger til 10 milliliter osmotisk kontroll medium agar supplert med 40 mikrogram per milliliter Hygromycin B to hver plate. Etter å ha tillatt det andre laget av agar å sette, inkubere kulturene ved 25 grader Celsius til enkelt isolater kan observeres vokser gjennom begge lag av agar. For å gjenopprette de vellykket forvandlede isolatene, overfør de individuelle vekst-kompatible isolatene til friske maltekstrakt agarplater supplert med 50 mikrogram per milliliter Hygromycin B.To vurdere effekten av den målrettede genforstyrrelsen på soppens heterothaliske evner, co-inokulere fersk maltekstrakt agarmedium med en mutert belastning samt en stamme av den motsatte parringstypen.
Når du arbeider med H.omanensis, dekk, men ikke forsegle platene. Plasser platene ved romtemperatur i syv dager. På slutten av inkubasjonen vurderer visuelt for produksjon av seksuelle strukturer.
For å teste de homothallic egenskapene til mutantstammen, inokulerer fersk maltekstrakt agarmedium med mutantstamme av interesse og inkubere platen ved romtemperatur i en uke som demonstrert. For å vurdere effekten av forstyrrelsen på veksten av soppen som studeres, sett baksiden av en stor steril pipettespiss inn i de aktivt voksende kantene av kulturen til hver mutant og villtype stamme av interesse for å skape mycelial-dekket agarplugger og inokulere friske maltekstrakt agar medium. Minst tre replikerer bør gjøres per kulturtype.
Etter tre dager med vekst ved 20 grader Celsius, måle veksten i hver plate på to vinkelrett diameter. Conidia brukes som startmateriale for protokollen får lov til å spire og vokse til de blir unge germlings. Legg merke til at modne mycelial tråder som disse er for modne for nedbrytning og bør ikke brukes.
Når cellene ikke lenger har cellevegger, blir de svært følsomme for mekanisk forstyrrelse og frigjør runde protoplaster som kan høstes for transformasjon. Suksessen til protokollen kan bekreftes ved en fenotypisk analyse av mutantstammene. For denne muterte MAT 127-isolaten ble den vegetative radiale veksten betydelig redusert, noe som tyder på en pleiotropisk effekt for det nye parringsgenet.
Videre var mutant isolat ikke i stand til å fullføre en seksuell syklus som produserer bare umodne seksuelle strukturer som ikke produserte seksuelle sporer sammenlignet med villtypeisolat som fullførte hele den seksuelle syklusen innen få dager etter inkubasjon. RNA er veldig følsom og forringes veldig enkelt. Derfor er et rent arbeidsmiljø og arbeid raskt på is begge avgjørende for suksessen til dette eksperimentet.
Når mutert isolat har blitt generert, kan de bli utsatt for fenotypisk eller RNA-seq analyse som passer for genet som karakteriseres.