Name: quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in c. elegans
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans at JoVE.com

我们确认以下 NIH 赠款：R01AG047101 和 R37AG56510。Driscoll 和 Grant 实验室的成员通过严格的实验和强大的沟通，为所述协议的开发和微调提供了广泛的贡献。

<ol>
	<li>Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+Spread+of+Protein+Aggregates+in+Neurodegenerative+Disease.">Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).</li><li>Davis, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+degradation+of+axonal+mitochondria.">Transcellular degradation of axonal mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).</li><li>Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+Know+No+Boundaries:+Mechanisms+and+Functions+of+Intercellular+Mitochondrial+Transfer.">Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107 (2016).</li><li>Stahl, P. D., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Exosomes+and+Microvesicles+Integrators+of+Homeostasis.">Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis.</a> Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).</li><li>Melentijevic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-elegans+neurons+jettison+protein+aggregates+and+mitochondria+under+neurotoxic+stress.">C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress.</a> Nature. 542 (7641), 367 (2017).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+a+prion+domain+from+cell-to-cell+by+vesicular+transport+in+Caenorhabditis+elegans.">Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 9 (3), 1003351 (2013).</li><li>Tyson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+animal+model+defines+genetic+contributions+for+neuron-to-neuron+transfer+of+alpha-synuclein.">Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain.">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).</li><li>Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+transmission+of+neuronal+huntingtin+aggregates+to+phagocytic+glia+in+the+Drosophila+brain.">Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain.</a> Nature Communications. 6, 6768 (2015).</li><li>Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+wastes+are+extracellularly+disposed+by+excretosomes,+nanotubes+and+exophers+in+mouse+HT22+cells+through+an+autophagic+vesicle+clustering+mechanism.">Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism.</a> bioRxiv. 10 (1), (2019).</li><li>Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia-reoxygenation+regulates+mitochondrial+dynamics+through+the+hypoxia+response+pathway,+SKN-1/Nrf,+and+stomatin-like+protein+STL-1/SLP-2.">Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2.</a> PLoS Genetics. 9 (12), 1004063 (2013).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).</li><li>Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+sensory+cilia+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine.">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li><li>Weicksel, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+small+molecule+that+disrupts+a+key+event+during+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans.">A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms.">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PloS One. 13 (3), 0193989 (2018).</li><li>Toth, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+sprouting+and+synapse+deterioration+in+the+aging+Caenorhabditis+elegans+nervous+system.">Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).</li><li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans.">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).</li><li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1.">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li><li>Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+dsRNA+feeding+libraries+to+generate+robust+loss-of-function+phenotypes.">Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50693 (2013).</li></ol>

以大型外外 层形式 对体内分子机制的聚合和细胞器消除的表征还处于起步阶段。关于指定驱逐货物、在牢房内对这些货物进行两极分化的收集、产生外驱的决定的管制、调解挤出的机械以及外驱生物与邻近牢房中退化机械的相互作用的问题，都仍要加以解决。此外， 管状连接的 体内可视化，可以通过生物材料，包括钙，聚合体，线粒体是有趣和未研究生物学本身的权利。为什么某些细胞比另一些细胞更容易产生外层细胞的问题也未解决，但可以通过本协议中概述的方法开始进行基因解剖。
本协议中详细描述的方法是实现外外层生产可重复评分的方法，注意区分外外层与附近的细胞索马，分析时间捕捉外外pher生产的峰值，并严格控制生长条件，以消除可调节外外层水平的意外应力。大的早期外外层的区别，或"星夜"分散在周围的皮下可以量化作为外外层生产的证据。话虽如此，在基底条件下表达mCherry的神经元通常与产生外显素的特定类型的5-25%的神经元相关。控制引入应力条件可应用于增加外外泌物的产生，以检测高达90%的神经元产生挤出，尤其适用于修饰剂的遗传或药理学屏幕。
在人类神经退行性疾病中，大型聚集体可以从病变神经元转移到邻近的细胞，促进病理传播。外外pher机制可能通过用于在植物中聚合挤出的保守机制发生。定义 体内分子 ，要么提高这个过程的效率（被认为是更有效的蛋白病控制），要么阻止它可能被利用来影响对抗多种神经退行性疾病的新策略的设计。因此，此处描述的协议可用于经典基因突变体筛选、全基因组RNAi屏幕，这些屏幕系统地敲除基因来识别增强剂和抑制剂，或者用于确定这一过程的候选药理修饰剂的药物干预研究。这种方法很简单，虽然有些费力。外层是非常大的，他们可以通过高放大镜的解剖显微镜来观察。尽管如此 ，C.elegans 神经元相对较小，看他们的细胞器或膜需要更高功率的共物图像，是一个缓慢的过程。高吞吐量的选项可能涉及多井板格式的高含量成像方法。
应用标准化方法进行外外层评分应作为神经元组织和消除细胞碎片的过程的协同基因解剖基础。

聚合和功能失调的线粒体的神经毒性挑战长期以来一直被认为是细胞内在的，但最近很明显，源自一个神经元的误折叠的人类疾病蛋白质也可以传播到邻近的细胞，促进病理学1。同样，哺乳动物线粒体可以被送出其原始生产的细胞，用于变性降解2 或拯救受挑战相邻细胞3中的线粒体种群。一般观察到各种大小的囊泡将细胞物质转移到邻近的细胞或流体周围4。一些挤出的囊泡接近平均神经元母体的大小（平均接触神经元索玛 = 6 μm），可以容纳大型聚合体和细胞器。
一个可以携带蛋白质聚合物和细胞器的大囊泡挤压的显著例子出现在C.elegans触摸受体神经元中，这些神经元表示一个高拷贝数报告器构造编码一种有毒聚集易发、抗降解的mCherry5。来自触摸神经元的挤出，称为外向，平均直径为±4μm，选择性地包括mCherry或其他聚合体，并直接传递到相邻的皮下，通常围绕触摸受体神经元。皮下试图以碱体为基础的降解，但一些不可消化的内容，如mCherry聚合物，可以重新挤出到动物的液体填充伪细胞，从中，mCherry可以通过远程清除细胞称为共糖细胞长期储存（图1，图2）5。5
大型挤出外层囊泡离开细胞被触摸受体血浆膜包围，可以含有聚合的人类疾病蛋白质、线粒体和利索索姆。外外层生产的过程似乎涉及对潜在有毒物种的分类（例如，容易聚集的表达mCherry与可溶性、无攻击性的蛋白质（如GP）分离，这些蛋白质大多留在神经元索马中）。这样，定向驱逐威胁实体是由神经元5完成的。一种蛋白质组虫的挑战，如自噬敲击引起的应激，MG132中显蛋白体抑制，或人类疾病蛋白质的转基因表达，如亨廷顿舞蹈症相关扩大多糖胺Q128或阿尔茨海默氏症牵连片段 A+1-42，可以增加产生外向球的神经元的数量。
由于外外phers最近才被记录，关于它们的生物学已知情况值得描述。外层在 C.elegans触摸受体神经元中被发现，并且是研究 最良好的。有六 个C.elegans 机械感官触摸神经元，有细胞体分布在身体周围（图3A），被称为微管细胞，因为它们的超结构特征独特的15个原丝微管。触摸受体神经元为前前AVM（前前前前前前微管神经元）、ALMR和ALML（右前侧微管神经元）和后部PVM（后侧前前前侧微管神经元）和尾部PLMR和PLML（右后侧显微管神经元）。有趣的是，六个触摸受体神经元产生不同的速率外向，尽管表达相同的攻击性转基因（图3C）。在六个机械感官触摸受体神经元中，ALMR神经元比其它触摸神经元更频繁地经历外向生成。因此，从触摸神经元中对外层数字的定量通常是通过聚焦ALMR建立的。
外向发生是一个动态过程，通常从神经元细胞质肿胀开始（图1A-B）。细胞内，细胞器或蛋白质聚集物被收集到神经元的一侧，最常见的是ALMR神经元的后端（远离投射的神经），形成一个前外向域（PED）（图1B）。当 PED 开始向外投射时观察到早期突起，形成可识别的突出芽。当前外驱域的最宽直径比索马外传颈部收缩的直径大约1/3时，定义晚芽（图1C）。外外层可以从索马向几乎任何方向喷射，但大多数外显子从细胞体后部退出，并留在与原体大致相同的焦点平面中。
外外pher可以远离原发的索玛，因为芽的脖子变窄成细丝。外层可以通过这种灯丝保持附着在索玛上（图1D，箭头），以后可以分离。钙、骨和线粒体的细胞含量可以通过这种灯丝转移到附着的外层5中，尽管大部分挤出材料被巨大的萌芽事件放入外层隔间。当没有明显的连接管或细丝和外显子与发送的索马完全分离时，外显子被认为是成熟的（图1E）。
C. elegans 产生的外向器触摸神经元会立即遇到皮下，即触摸神经元周围的组织。最常见的情况是，外皮囊泡似乎在皮下后向尾部运动，在外皮物含量出现降解目标之前，它们可能离母细胞相当远（例如，距离母细胞的距离可以约100μm（图1F）。荧光外层囊泡在皮下分解成许多较小的囊泡，外观称为"星夜"（图1G和图2）。在"星夜"阶段，与原始的单独外显器相比，可以观察到分散在皮下同步的荧光材料分散到许多较小的荧光点中。星夜可以在低放大倍率下看起来更刺耳，放大率更高，可以看起来在皮下放大和/或网络化。星夜的荧光信号通常比外音和神经元表达的荧光更暗（图2B-C）。mCherry 的分散到许多双核囊泡被认为涉及噬菌体成熟和与皮下细胞的内索体/乳糖细胞的融合。一些外皮物质很可能在皮下体利索索马网络中降解，但抗降解的残余物种（如mCherry集料）被从皮下物质中扔进伪细胞，这是一种液体舱，可以含有细胞碎片。荧光材料后来被称为细胞核糖的远程清除细胞（图2C）所利用，这种细胞可以浓缩、储存并再次尝试降解mCherry。
聚合挤压和转移现象似乎在植物之间得到保存，,在基因模型中，如C.elegans5、6、7,6和D.黑色素78，9,9以及多个哺乳动物模型中都报告了。据报道，哺乳动物细胞10的外向状挤出，这一观察表明，保存的机制可能是聚合和细胞器驱逐的根据。因此，外向器生产可能是细胞碎片管理的一种保存机制，构成神经元蛋白位和线粒体质量控制的一个基本但以前未被识别的分支，当不平衡时，可能积极促进神经退行性疾病。识别碎片识别和分拣所涉及的分子，将物质运送到一个独特的亚细胞区域，挤压，形成/剪刀状的管状连接连接的索马和晚期外外层，并识别大挤出的囊泡，供邻近细胞远程降解。线虫和苍蝇模型的研究对于确定聚合和细胞器收集和转移的机制至关重要，利用这些模型提供的无偏遗传方法和强大的细胞生物工具来识别生理环境中的参与分子。
在外层生物学中操作的破译机制的关键第一步涉及定义在体内外 外层定量可 重复的协议。 C. elegans 模型 为此类工作提供了特殊优势，因为身体是透明的，当外显体含有荧光标记的蛋白质或细胞器时，可以很容易地观察到。据报道，外显细胞是由 C.elegans 多巴胺神经元PDE和CEP，ASE和ASER感觉神经元，和染料填充的安非他明神经元5生成。由于触摸受体神经元产生的外显子是最佳特征，因此这里的重点是使用触摸神经元进行外外层分析。然而，基本方法可以应用于测量来自任何细胞的外层产生。对 C.elegans 接触受体神经元产生的外向进行检测和定量的规程，从基因上表达mCherry蛋白，并概述可监测的货物和评分时的时间限制。本文定义了体内外 外层识别 的方法，以及调节外外外外层生产的环境和遗传条件的定量方法。议定书强调对恒定的非应力条件给予关键关注，以便确定基线外外层生产，并进行比较基因型。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:604px;" width="603">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">95B Scientific CMOS camera</td>
			<td style="width:108px;">Photometrics Prime</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">1,000 &#956;L low retention tips</td>
			<td style="width:108px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">10 mL serological pipette</td>
			<td style="width:108px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:128px;">CC214</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">10 &#956;L low retention tips</td>
			<td style="width:108px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:128px;">70.1130.105</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">13% sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:108px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:128px;">AC219255000</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">05-539-12</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td style="width:108px;">Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:128px;">FLA4036</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">25 mL serological pipette</td>
			<td style="width:108px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:128px;">CC216</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">300 &#956;L low retention tips</td>
			<td style="width:108px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:128px;">70.765.105</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">50 mL serological pipette</td>
			<td style="width:108px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:128px;">CC117</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td style="width:108px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:128px;">L16497.ME</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">9 cm sterile Petri dishes</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">11309283</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">absolute ethanol</td>
			<td style="width:108px;">Vwr</td>
			<td style="width:128px;">20821.33</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Agar</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">A1296</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">C. elegans strain wild type</td>
			<td style="width:108px;">Supplied by CGC</td>
			<td style="width:128px;">N2</td>
			<td style="width:177px;">C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">C3881</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">cholesterol</td>
			<td style="width:108px;">Acros</td>
			<td style="width:128px;">110190250</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">dibasic sodium phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">S3264</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">E. coli strain OP50</td>
			<td style="width:108px;">Supplied by CGC</td>
			<td style="width:128px;">Op50</td>
			<td style="width:177px;">E coli strain</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">FBS10 Standard microscope</td>
			<td style="width:108px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:128px;">KSC 410-1-100-1</td>
			<td style="width:177px;">FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">glass pipette 270 mm</td>
			<td style="width:108px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">FB50255</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td style="width:108px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:128px;">75004515</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Inoculating Spreaders</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">11821741</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">LB medium capsules</td>
			<td style="width:108px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:128px;">3002-031</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">LDI &#8211; Laser Diode Illuminator</td>
			<td style="width:108px;">89 North</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">levamisole</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">16595-80-5</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">M4 multipette</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:128px;">4982000012</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">magnesium sulphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">M7506</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">P0662</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td style="width:108px;">Infors HT</td>
			<td style="width:128px;">INFO28573</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">3120-1000</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">P10 pipette</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf Research Plus</td>
			<td style="width:128px;">3123000020</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">P1000 pipette</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf Research Plus</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">P200 pipette</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf Research Plus</td>
			<td style="width:128px;">3123000055</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">pipeteboy 2</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:128px;">612-0927</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Polystyrene microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">MFCD00131491</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td style="width:108px;">Sorvall</td>
			<td style="width:128px;">9900884</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Reusable ringed cytology slides</td>
			<td style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">22037242</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">GFP expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">13422</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:128px;">S/4880/53</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td style="width:108px;">Priorclave</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Triton-X</td>
			<td style="width:108px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:128px;">28313</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Tween 20</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">9005-64-5</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit</td>
			<td style="width:108px;">CrestOptics</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">mCherry expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">Q128 expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">mitoROGFP expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">autophagy marker expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZEISS Axio Vert.A1</td>
			<td style="width:108px;">Zeiss</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in c. elegans

错误折叠的蛋白质和线粒体功能障碍的毒性是促进年龄相关的功能神经元衰退和跨物种神经退行性疾病的关键因素。虽然这些神经毒性挑战长期以来一直被认为是细胞内在的，现在有相当多的证据表明，源自一个神经元的误折叠的人类疾病蛋白质可能出现在邻近细胞中，这种现象被提出来促进人类神经退行性疾病的病理学传播。
C. elegans 表示聚合蛋白质的成年神经元可以挤出大（±4 μm）膜包围的囊泡，其中可包括聚合蛋白、线粒体和卵母体。这些大囊泡被称为"外层"，不同于外体（其体积约100倍，具有不同的生物发生）。将细胞碎片抛出外层可能由一种保存机制发生，该机制构成神经元蛋白位突虫病和线粒体质量控制的一个基本但以前未被识别的分支，与聚合在人类神经退行性疾病中传播的过程相关。
虽然外显子主要在接触神经元中表达高拷贝转基因mCherry的动物中进行了研究，但这些协议在研究使用荧光标记的细胞器或不同神经元类别中感兴趣的其他蛋白质的外生基因时同样有用。
这里描述的是 C.elegans 外外层的物理特征，其检测策略，识别标准，定量的最佳时间，以及动物生长协议，控制压力，可以调节外层生产水平。此处概述的协议细节应有助于建立跨实验室外外层定量分析的标准。本文件旨在为实验室提供该领域的资源，以寻求分析产生外外层和外外pher的分子机制，以及外外pher由邻近和远距离细胞作出反应的机制。

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans at JoVE.com

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

该协议描述了检测和定量由 C.elegans细胞以膜结合 外外层形式产生的大型聚集和/或细胞器挤出（±4 μm）的方法。我们描述了菌株、生长条件、评分标准、时间和显微镜注意事项，以便于解剖这种碎片驱逐机制。

C. elegans 中大型外层囊中体内神经聚合和有机体挤出评分的定量方法

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

我们通过一种称为外向发生、理解不实的生物学的过程来描述神经元聚集和细胞器挤出的体内机制，该过程可能与神经退行性疾病病理传播有关。这些方法对于实现挤出神经元外显体可重复评分是必要的，并演示了通过神经元转移到邻近细胞来分解细胞垃圾的机械解剖平台。定义神经元喷射聚集体的神经内机制实际上可能会影响新策略的设计，以帮助治疗人类神经退行性疾病。对于基底条件，同生年龄的C.Elegans在20摄氏度的恒温下。要对细胞内动力学和外外发生特征进行实时成像，请将多达 20 种动物放在玻璃显微镜幻灯片上的 agaros 垫上，并固定动物。小心地将盖子滑过瘫痪的蠕虫，然后将幻灯片放在共和荧光显微镜的舞台上。使用 10 到 40 倍的目标的 10 到 40 倍目标来识别 Brightfield 中所需的 Z 平面，记录蠕虫的定位、头部尾部方向和外阴位置，这些是以后神经元和外音识别的地标。保持在同一个 Z 平面上，切换到所选细胞合成器的宽场荧光观察 10 到 40 倍，并在 Z 轴内滚动，以观察动物的深度和焦点平面中的荧光表达。头部将有一个荧光神经环，更尖的尾巴将包含一到两个可见的后侧触摸神经元索马斯。使用 63 倍镜头的放大率更高，有助于识别神经环、神经元过程和索玛身体。它首先有助于识别位于动物头部的神经环和横向神经元过程。为此，从蠕虫的头部开始，然后缓慢滚动 Z 轴，以识别连接神经元过程的神经环的平面。一旦神经环被识别，在荧光视图中，沿着附加的神经元过程横向朝后向外阴，在那里索玛将明显。一旦圆形的索玛身体或身体聚焦，重要的是要识别附近的所有神经元。对于触摸神经元识别，首先找到ALML、ALMR和AVM soma，这应该是最亮的信号，并在过程结束时由圆形细胞体标记。一旦找到最聚焦的神经元母体，使用AVM细胞，一个腹细胞，以帮助分配方向。如果 AVM 神经元与 ALM 位于同一平面上，则动物在其一侧休息，侧向神经元为 ALMR。如果 AVM 神经元与该问题 ALM 不在同一平面上，则最接近焦点平面的触摸神经元是 ALML 神经元。也是有帮助的是识别PVM神经元，这是一个位于尾巴附近的腹体触摸神经元。PVM 的焦点平面将指示前触摸神经元是 ALML 还是 ALMR。如果所对ALM与PVM位于同一平面上，则观察到的接触神经元为ALML神经元。在确定和分配了最聚焦的 ALM 之后，确定感兴趣区域附近和所有 Z 平面的其他索马实体的位置非常重要，以便不要将它们误认为是外向体。一旦感兴趣的触摸神经元被找到，ALMR或ALML，检查神经元大突出外层域，大到足以被视为芽外显子，这是至少五分之一的大小的原始索玛。如果没有观察到芽或外显域，进一步检查神经元母体，从索玛身体发出的附着薄丝。附着的外层往往位于离原发索马更近的地方，并且位于类似的 Z 平面上。要识别一个未连接的外显子，寻找浓缩的排出荧光蛋白，这些蛋白通常比索马更亮。虽然在这里描述，有一个大的外层。可能有多个荧光实体源自单个 soma。在不同的焦平面和从发现原始索玛的遥远横向区域寻找未连接的外向。外外层通常从神经元过程的后向向从索玛伸出。检查未定位并标识为神经元索马斯的大型球形物体。虽然外层通常是物理结构，但随着时间的推移，它们可能会退化，形成更不规则的形状。搜索星空夜事件的存在以及多个外在事件的实例。为了避免误认为和出平面的索马为外在，这是至关重要的识别所有附近的索马身体，甚至在观察开始时的对焦索马。可以观察到扩展或尖的 soma，但没有明确收缩站点的扩展不应作为外在器进行评分。拒绝在外向事件定量中未达到索玛大小的小已解析芽。虽然成熟的中性可以随着年龄的增长而急剧延长，荧光蛋白可以迁移到这种结构的端端，但不要将神经素生长算作外显子。要识别非外流器的荧光实体，请务必排除任何自荧光，这些自荧光可能被误认为是宽场荧光下的星夜车碎片。要排除胚胎荧光信号，请在荧光和亮场照明之间切换，并检查信号与子宫内的卵子是否关联。此表提供了用于监测外层生产的不同触摸神经元表示荧光报告器的摘要。已知在外层中挤出的货物包括聚合物，如Q128、人类亨廷顿扩张性多糖胺重复的融合、用利索体相关膜蛋白标记的LysosomeGP，以及标有基质局部GP的线粒体。细胞质GP不会强烈排出，并优先保留在索马，虽然GP可以用来弱可视化外显子。一般来说，ALMR神经元表达mCherry在基础条件下的外向生产开始于成年的第一天，在成人第一天至第三天的主要外外层生产时间范围内检查的ALMR的范围从5%到25%不等。特殊的应力和遗传扰动可以大大增加ALMR神经元内的外外层产生。在检查感兴趣的神经元和周围区域的外外层域、完整的外显子或星空夜事件之前，找到所有附近的神经元至关重要。当您熟悉手动识别外外层时，可以使用增强的吞吐量方法使用高含量成像进行大规模筛查，从而允许进行全基因组分析和机械外外发生解剖。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

小鼠视网膜神经节细胞的转染在体内电穿孔

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

科研

神经科学

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

在 C 在体内激光干切断线虫

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

使用超声波血脑屏障破坏和锰增强MRI的脑功能成像

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

双突触诱发的星形胶质细胞和神经元的反应，在急性海马脑片电生理记录

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C.在体内神经元钙成像技术线虫

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

谷氨酸和GABA快速微离子导入：一个有用​​的工具，调查突触整合

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

神经元的密集核心囊泡的超分辨率成像

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

诱导星形胶质细胞受体的可塑性由神经元的放电频率操作

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

在永久性幼虫特有的神经重构的C语言活体成像线虫

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

同时<em&gt;体外</em两个由视网膜&gt;功能测试<em&gt;在体内</em&gt;电图系统

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...