Kvantitative metoder til scoring in vivo Neuronal Aggregat og Organelle Extrusion i Store Exopher Vesikler i C. elegans

Vi karakteriserer in vivo mekanismer aggregat og organelle ekstrudering fra neuroner via en proces kaldet exophergenesis, dårligt forstået biologi, der er sandsynligvis relevant for neurodegenerative sygdom patologi spredning. Disse tilgange er nødvendige for at opnå reproducerbar scoring af ekstruderede neuronale exophers og demonstrere en platform for den mekanistiske dissektion af cellulære trash elimination via neuronal overførsel til tilstødende celler. Definition af in vivo mekanismer, hvordan neuroner skubbe aggregater kan faktisk påvirke udformningen af nye strategier til støtte i behandlingen af menneskelige neurodegenerative betingelser.

For basale forhold, hus C.Elegans af samme biologiske alder ved en konstant temperatur på 20 grader Celsius. For levende billeddannelse af den intracellulære dynamik og karakteristika exophergenesis, placere op til 20 dyr på en agaros pad på et glas mikroskop dias, og immobilisere dyrene. Placer forsigtigt en dæksel slip over lammede orme og placere dias på scenen af en konfokal fluorescens mikroskop.

Brug en 10 til 40x målsætning til at identificere det ønskede Z-fly i Brightfield, idet du tager noter af placeringen af ormen, hovedhalensorientering og vulvaplaceringen, som er landemærker til senere neuronal og exopher identifikation. Opholder sig i samme Z fly, skifte til widefield fluorescens visning på 10 til 40x for den valgte cykliske reporter, og rul inden for Z aksen for at observere dybden af dyret og fluorescens udtryk i fokal flyet. Hovedet vil have en fluorescerende nervering, og den mere spidse hale vil indeholde en til to synlige posterior lateral touch neuron somas.

Højere forstørrelse med en 63x linse kan bidrage til at identificere nervering, neuronal processer, og soma organer. Det er først nyttigt at identificere nerveringen placeret i hovedet af dyret og laterale neuronal processer. For at gøre dette, starte i spidsen af ormen og langsomt rulle gennem Z aksen til at identificere flyet af nerveringen, hvor de neuronale processer er fastgjort.

Når nerveringen er blevet identificeret, i fluorescens opfattelse følge vedlagte neuronal proces side om side i den bageste retning mod vulva, hvor soma vil være synlige. Når den runde soma krop eller organer er i fokus, er det vigtigt at identificere alle de neuroner i nærheden. For touch neuron identifikation, først finde ALML, ALMR, og AVM soma, som bør være de lyseste signaler og præget af en rund celle krop i slutningen af processen.

Når den mest in-focus neuronal soma er blevet placeret, skal du bruge AVM-cellen, en ventral celle, til at hjælpe med at tildele orientering. Hvis AVM neuron er i samme plan som ALM, så dyret hviler på sin side og den laterale neuron er ALMR. Hvis AVM neuron ikke er i samme plan som ALM pågældende, den nærmeste touch neuron til brændpunktet flyet er ALML neuron.

Også nyttigt er at identificere PVM neuron, som er en ventral touch neuron placeret nær halen. Fokusplanet for PVM vil angive, om den forreste berøringsneuroner er ALML eller ALMR. Hvis ALM pågældende er i samme plan som PVM, så den observerede touch neuron er ALML neuron.

Efter den mest in-focus ALM er blevet identificeret og tildelt, er det vigtigt at bestemme placeringen af de andre soma organer nær det område af interesse og i alle Z fly, for ikke at forveksle dem for exophers. Når touch neuron af interesse er blevet placeret, ALMR eller ALML, inspicere neuron for store fremspringende exopher domæner, stor nok til at blive betragtet som en opløbet, som er mindst en femtedel af størrelsen af oprindelsen soma. Hvis ingen knop eller exopher domæne er observeret, yderligere inspicere neuronal soma for en vedhæftet tynd glødetråd stammer fra soma kroppen.

Vedhæftede exophers tendens til at være placeret tættere på oprindelse soma og i en lignende Z plan. For at identificere en løsgænger, kigge efter koncentreret udvist fluorescerende proteiner, som ofte er lysere end soma. Selvom afbildet her, er der en stor exopher.

Der kan være mere end én fluorescerende enhed, der stammer fra en enkelt soma. Kig efter løsgængere i forskellige fokalefly og i den fjerne laterale region, hvorfra den oprindelige soma blev fundet. Exophers typisk stikker væk fra soma i en posterior retning fra neuronal proces.

Kontroller for store sfæriske objekter, der ikke er placeret og identificeret som neuronal somas. Selv om exophers er typisk sphyrical strukturer, de kan blive nedbrudt over tid, erhverve en mere uregelmæssig form. Søg efter tilstedeværelsen af stjerneklare nat begivenheder og for forekomster af flere exopher begivenheder.

For at undgå at tage fejl og ud-af-flyet soma for en exopher, er det afgørende at identificere alle nærliggende soma organer, selv out-of-fokus somas i starten af observationen. En udvidet eller spids soma kan observeres, men en forlængelse uden en klar konstriktion site bør ikke scores som en exopher. Afvis små løste knopper, der ikke når en femtedel af størrelsen af soma i exopher begivenhed kvantificering.

Selv om modne neuritter kan strække sig dramatisk med alderen, og fluorescerende proteiner kan migrere ind i den distale ende af sådanne strukturer, tæller ikke neurite udvækster som exophers. For at identificere fluorescerende enheder, der ikke er exophers, skal du sørge for at udelukke enhver autofluorescens, som kan forveksles med stjerneklar nat vesicular vragrester under widefield fluorescens. For at udelukke embryonale fluorescerende signaler, skifte mellem fluorescens og brightfield belysning, og kontrollere for foreningen af signalet med æg i livmoderen.

Denne tabel giver et resumé af forskellige touch neuron udtrykt fluorescerende journalister, der er blevet brugt til at overvåge exopher produktion. Laster, der er kendt for at være ekstruderet i exophers omfatter aggregater såsom Q128, en fusion af humane Huntington ekspanderet polyglutamin gentagelser, lysosomer GFP mærket med lysosomal associeret membran protein, og mitokondrier mærket med matrix-lokaliseret GFP. Cytoplasmic GFP er ikke stærkt bortvist, og er fortrinsvis bevaret i soma, selv om GFP kan bruges til svagt visualisere exophers.

Generelt, exopher produktion af ALMR neuron-udtryk mCherry under basale forhold begynder på dag ét af voksenalderen og spænder fra omkring fem til 25% af ALMRs undersøgt inden for de vigtigste exopher produktion tidsramme af voksne dag et til tre. Særlige belastninger og genetiske liggende kan i høj grad øge exopher produktion inden for ALMR neuroner. Det er afgørende at finde alle de nærliggende neuroner før inspektion af neuron af interesse og det omkringliggende område for exopher domæner, intakte exophers, eller stjerneklar nat begivenheder.

Når du er fortrolig med manuelt at identificere exophers, forbedret gennemløb metoder til storstilet screening ved hjælp af højt indhold billeddannelse kan anvendes, så hele genom analyse og mekanistisk exophergenesis dissektion.