7.1K Views
•
09:06 min
•
September 18th, 2020
DOI :
September 18th, 2020
•0:04
Introduction
0:47
Exopher Detection
2:11
Touch Neuron Identification
4:26
Exopher Identification and Scoring
6:43
Non-Exopher Identification
7:13
Results: Representative Exopher Production
8:26
Conclusion
Transcript
We karakteriseren de in vivo mechanismen van aggregaat en organelle extrusie van neuronen via een proces genaamd exophergenesis, slecht begrepen biologie die waarschijnlijk relevant is voor neurodegeneratieve ziekte pathologie verspreid. Deze benaderingen zijn noodzakelijk voor het bereiken van reproduceerbare scoren van geëxtrudeerde neuronale exophers en tonen een platform voor de mechanistische dissectie van cellulaire afval eliminatie via neuronale overdracht naar naburige cellen. Het definiëren van de in vivo mechanismen van hoe neuronen uitwerpen aggregaten daadwerkelijk kan invloed hebben op het ontwerp van nieuwe strategieën om te helpen bij de behandeling van menselijke neurodegeneratieve aandoeningen.
Voor basale omstandigheden, huis C.Elegans van dezelfde biologische leeftijd bij een constante temperatuur van 20 graden Celsius. Voor levende beeldvorming van de intracellulaire dynamiek en kenmerken van exophergenese, plaats tot 20 dieren op een agarospad op een glazen microscoopplaat en immobiliseer de dieren. Plaats voorzichtig een afdekking slip over de verlamde wormen en plaats de dia op het podium van een confocale fluorescentie microscoop.
Gebruik een 10 tot 40x doelstelling om het gewenste Z-vlak in Brightfield te identificeren, waarbij aantekeningen worden gemaakt van de positionering van de worm, de kop staartoriëntatie en de vulva-locatie, die oriëntatiepunten zijn voor latere neuronale en exopher-identificatie. Verblijf in hetzelfde Z-vlak, overschakelen naar widefield fluorescentie bekijken op 10 tot 40x voor de gekozen cytosolic verslaggever, en scroll binnen de Z-as om de diepte van het dier en de fluorescentie expressie in het brandpuntsvlak te observeren. De kop zal een fluorescerende zenuwring hebben, en de meer puntige staart zal een tot twee zichtbare achterste zijwaartse aanraking neuron somas bevatten.
Hogere vergroting met een 63x lens kan helpen om de zenuwring, neuronale processen, en soma lichamen te identificeren. Het is eerst nuttig om de zenuwring in het hoofd van het dier en laterale neuronale processen te identificeren. Om dit te doen, beginnen bij het hoofd van de worm en langzaam scrollen door de Z-as om het vlak van de zenuwring waar de neuronale processen zijn bevestigd te identificeren.
Zodra de zenuwring is geïdentificeerd, in fluorescentie weergave volgen de bijgevoegde neuronale proces lateraal in de achterste richting in de richting van de vulva, waar de soma zal duidelijk zijn. Zodra de ronde soma lichaam of lichamen zijn in focus, is het belangrijk om alle neuronen in de buurt te identificeren. Voor touch neuron identificatie, eerst vinden de ALML, ALMR, en AVM soma, die moet de helderste signalen en gemarkeerd door een ronde cel lichaam aan het einde van het proces.
Zodra de meest in-focus neuronale soma is gelokaliseerd, gebruik maken van de AVM-cel, een ventrale cel, om te helpen toewijzen van de oriëntatie. Als het AVM-neuron zich in hetzelfde vlak bevindt als de ALM, rust het dier op zijn kant en het laterale neuron is de ALMR. Als de AVM neuron is niet in hetzelfde vlak als de ALM in kwestie, de dichtstbijzijnde touch neuron aan het brandpuntsvlak is de ALML neuron.
Ook nuttig is het identificeren van de PVM neuron, dat is een ventrale touch neuron gelegen in de buurt van de staart. Het focusvlak van de PVM geeft aan of het voorste aanraakneuron de ALML of ALMR is. Als de ALM in kwestie zich in hetzelfde vlak bevindt als de PVM, dan is het waargenomen aanraakneuron het ALML-neuron.
Na de meest in-focus ALM is geïdentificeerd en toegewezen, is het belangrijk om de posities van de andere soma lichamen in de buurt van het gebied van belang en in alle Z-vliegtuigen te bepalen, om ze niet te verwarren met exophers. Zodra de aanraking neuron van belang is gevestigd, de ALMR of ALML, inspecteren het neuron voor grote uitstekende exopher domeinen, groot genoeg om te worden beschouwd als een knop exopher, dat is ten minste een vijfde van de grootte van de oorsprong soma. Als er geen knop of exopher domein wordt waargenomen, verder inspecteren van de neuronale soma voor een bijgevoegde dunne gloeidraad afkomstig van het soma lichaam.
Bijgevoegde exophers hebben de neiging om dichter bij de oorsprong soma en in een soortgelijke Z-vlak. Om een ongebonden exopher te identificeren, zoek naar geconcentreerde verdreven fluorescerende eiwitten, die vaak helderder zijn dan de soma. Hoewel hier afgebeeld, is er een grote exopher.
Er kunnen meer dan één fluorescerende entiteit zijn die afkomstig is van een enkele soma. Kijk voor ongebonden exophers in verschillende brandpuntsvlakken en in de verre laterale regio van waar de oorsprong soma werd gevonden. De exophers meestal uitsteken uit de buurt van de soma in een achterste richting van het neuronale proces.
Controleer op grote bolvormige objecten die niet zijn gepositioneerd en geïdentificeerd als neuronale soma's. Hoewel exophers zijn meestal sphyrical structuren, kunnen ze worden afgebroken na verloop van tijd, het verwerven van een meer onregelmatige vorm. Zoek naar de aanwezigheid van sterrenhemelnachtgebeurtenissen en bijvoorbeeld naar meerdere exopher-gebeurtenissen.
Om te voorkomen dat er sprake is van een misname en out-of-plane-soma voor een exopher, is het van cruciaal belang om alle nabijgelegen soma-lichamen te identificeren, zelfs onscherpe soma's aan het begin van de observatie. Een uitgebreide of puntige soma kan worden waargenomen, maar een uitbreiding zonder een duidelijke vernauwingsplaats mag niet als exopher worden gescoord. Verwerp kleine opgeloste knoppen die niet bereiken een vijfde van de grootte van de soma in exopher gebeurtenis kwantificering.
Hoewel volwassen neurites kunnen dramatisch uitbreiden met de leeftijd, en fluorescerende eiwitten kunnen migreren naar het distale uiteinde van dergelijke structuren, niet tellen neurite uitwassen als exophers. Om fluorescerende entiteiten te identificeren die geen exophers zijn, moet u elke autofluorescentie uitsluiten, die kan worden verward met sterren nachts vesiculaire puin onder widefield fluorescentie. Om embryonale fluorescerende signalen uit te sluiten, schakelt u tussen fluorescentie en brightfield-verlichting en controleert u op associatie van het signaal met eieren in de baarmoeder.
Deze tabel biedt een samenvatting van verschillende touch neuron uitgedrukt tl-verslaggevers die zijn gebruikt om exopher productie te controleren. Ladingen waarvan bekend is dat ze worden geëxtrudeerd in exophers omvatten aggregaten zoals Q128, een fusie van menselijke Huntington uitgebreide polyglutamine herhalingen, lysosomen GFP gelabeld met lysosomale geassocieerde membraan eiwit, en mitochondriën gelabeld met matrix-gelokaliseerde GFP. Cytoplasmatische GFP wordt niet sterk verdreven en wordt bij voorkeur in de soma bewaard, hoewel GFP kan worden gebruikt om exophers zwak te visualiseren.
In het algemeen begint exopher productie door de ALMR neuron-uitdrukkende mCherry onder basale omstandigheden op dag één van volwassenheid en varieert van ongeveer vijf tot 25% van de ALMRs onderzocht binnen de belangrijkste exopher productie tijdsbestek van volwassen dag een tot drie. Bijzondere spanningen en genetische verstoringen kunnen de exopherproductie binnen ALMR-neuronen sterk verhogen. Het is van cruciaal belang om alle nabijgelegen neuronen te lokaliseren voordat het inspecteren van het neuron van belang en de omgeving voor exopher domeinen, intacte exophers, of sterrenhemel nacht gebeurtenissen.
Wanneer u zich comfortabel voelt met het handmatig identificeren van exophers, kunnen verbeterde doorvoermethoden voor grootschalige screening met behulp van hoge inhoudsbeeldvorming worden gebruikt, waardoor hele genoomanalyse en mechanistische exophergenesis dissectie mogelijk zijn.
Dit protocol beschrijft benaderingen voor detectie en kwantificering van grote geaggregeerde en/of organelle extrusies (~4 μm) geproduceerd door C. elegans cellen in de vorm van membraangebonden exofofen. We beschrijven stammen, groeiomstandigheden, scorecriteria, timing en microscopie overwegingen die nodig zijn om dissectie van dit puin uitzetting mechanisme te vergemakkelijken.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved