我々は、神経変性疾患病理の広がりに関連する可能性が高い、興奮性、理解の不十分な生物学と呼ばれるプロセスを介してニューロンからの骨および小器官押出のインビボメカニズムを特徴付ける。これらのアプローチは、押し出された神経細胞のエキソファーの再現可能なスコアリングを達成するために必要であり、近隣細胞へのニューロン伝達を介した細胞ゴミ除去の機械化解剖のためのプラットフォームを実証する。ニューロンが凝集体を排出する方法のin vivoメカニズムを定義することは、実際にヒト神経変性状態の治療を助ける新しい戦略の設計に影響を与える可能性があります。
基礎条件の場合、摂氏20度の一定温度で同じ生物学的年齢の家C.エレガンス。細胞内ダイナミクスの生画像化と外発性の特性については、最大20匹の動物をガラス顕微鏡スライド上のアガロスパッドに置き、動物を固定化します。麻痺したワームの上にカバースリップを慎重に置き、スライドを共焦点蛍光顕微鏡のステージに置きます。
10 ~40x の目的を使用して、Brightfield で目的の Z 平面を特定し、ワームの位置、頭部の尾方向、および後の神経および外膜の識別のランドマークである外陰部の位置をメモします。同じZ面に留まり、選択した細胞質レポーターに対して10〜40倍の広視野蛍光観察に切り替え、Z軸内をスクロールして動物の深さと焦点面の蛍光発現を観察する。頭部には蛍光神経環があり、より尖った尾には1〜2個の目に見える後方タッチニューロンソマが含まれる。
63xレンズでより高い倍率は、神経環、神経細胞のプロセス、および相馬体を識別するのに役立ちます。動物の頭部および横神経プロセスに位置する神経環を特定することは最初に有用である。これを行うには、ワームの先頭から開始し、ゆっくりとZ軸をスクロールして、神経プロセスが取り付けられている神経リングの平面を識別します。
神経環が同定されると、蛍光図では、付着したニューロンプロセスを後方から外陰部に向かって横方向に進み、そこで相腫が明らかとなる。丸い体や体に焦点を当てたら、近くにあるすべてのニューロンを特定することが重要です。タッチニューロンの同定のために、最初にALML、ALMR、およびAVM相腫を見つけ、最も明るい信号で、プロセスの最後に丸い細胞体によってマークする必要があります。
最も焦点が合っていない神経細胞ソーマが見つかったら、腹側細胞であるAVM細胞を使用して、方向を割り当てるのに役立ちます。AVMニューロンがALMと同じ平面にある場合、動物はその側で休んでおり、横ニューロンはALMRです。AVMニューロンが問題のALMと同じ平面にない場合、焦点面に最も近いタッチニューロンはALMLニューロンである。
また、尾部付近に位置する腹側タッチニューロンであるPVMニューロンを同定するのにも有用である。PVMのフォーカス面は、前タッチニューロンがALMLかALMRかを示す。問題のALMがPVMと同じ平面にある場合、観察されたタッチニューロンはALMLニューロンである。
最も焦点が合ったALMが同定され、割り当てられた後、エキソファーと間違えないために、関心領域の近くおよびすべてのZ平面の他の相馬体の位置を決定することが重要です。目的のタッチニューロンが見つかったら、ALMRまたはALMLは、ニューロンが大きく突き出た外発ドメインについて検査し、芽出動と見なされるのに十分な大きさであり、これは元の相馬の少なくとも5分の1の大きさである。芽またはエキソファードメインが観察されない場合は、さらに、身体から発せられる付着した薄いフィラメントについて神経細胞ソーマを検査する。
アタッチされたエキソファーは、元のソーマに近く、同様のZ平面に位置する傾向があります。取り付けられていないエソファーを同定するには、相馬よりも明るい蛍光タンパク質を濃縮して探します。ここに描かれているが、1つの大きなエポファーがある。
単一の相腫に由来する蛍光体が複数存在する場合があります。異なる焦点面と、元の相馬が見つかった遠くの横領域で、未接続のエソファーを探します。エキソファーは通常、ニューロンプロセスから後方向に相腫から遠ざかっている。
大きな球状オブジェクトが位置付けされず、ニューロンソマとして識別されていないかどうかを確認します。エコファーは通常、生理学的構造であるが、時間の経過とともに劣化し、より不規則な形状を得る可能性がある。星空の夜のイベントの存在と複数のエキソファー イベントの例を検索します。
外発性相馬を外発させないようにするには、観測開始時に焦点が合っていないソマでさえ、近くの相馬体をすべて特定することが重要です。拡張または尖った相腫は観察することができるが、明確な狭窄部位のない延長は、エポファーとして採点されるべきではない。エソファーイベント定量化でソーマの5分の1の大きさを達成していない小さな解決された芽を拒否します。
成熟した神経突起は年齢とともに劇的に拡張することができ、蛍光タンパク質はそのような構造の遠位端に移行する可能性がありますが、エキソファーとしてノイライトの伸びを数えないでください。エソファーではない蛍光体を同定するには、広視野蛍光の下で星空の夜の大きな破片と間違えられる可能性のある自己蛍光を必ず除外してください。胚性蛍光シグナルを除外するには、蛍光と明視野照明を切り替え、子宮内の卵とのシグナルの関連を確認します。
この表は、エキソファーの産生を監視するために使用されてきた蛍光レポーターを発現する異なるタッチニューロンの概要を示す。エキソファーで押し出されることが知られているカルゴには、Q128、ヒトハンチントン拡張ポリグルタミン反復の融合、リソソーム関連膜タンパク質でタグ付けされたリソソームGFP、マトリックスに局在するGFPでタグ付けされたミトコンドリアなどの凝集体が含まれる。細胞質GFPは強く排出されず、優れた体腫に保持されるが、GFPはエキソファーを弱く可視化するために使用することができる。
一般に、基礎条件下でのALMRニューロン発現mCherryによるエキソファー産生は成人期の1日目に始まり、成人1日目から3日目の主要なエキソファー産生時間枠内で調べられたAlMRの約5〜25%の範囲である。特定のストレスおよび遺伝的摂動はALMRニューロン内のエキソファー産生を大きく増加させることができる。エキソファードメイン、無傷のエソファ、または星空の夜のイベントのために関心のあるニューロンとその周辺領域を検査する前に、近くのニューロンのすべてを見つけることが重要です。
手動でエキソファーを同定する場合、高含有イメージングを用いた大規模スクリーニングのスループット手法を強化し、全ゲノム解析や機械化的な外発性解剖を可能にします。
