우리는 퇴행성 질환 병리학 확산과 관련이 있는 퇴행성 생물학이라는 과정을 통해 뉴런으로부터의 골재 및 세포간 압출의 생체 내 메커니즘을 특성화합니다. 이러한 접근은 압출 된 신경 exophers의 재현 가능한 점수를 달성하기 위해 필요하고 이웃 세포로의 신경 전달을 통해 세포 쓰레기 제거의 기계성 해부를위한 플랫폼을 보여줍니다. 뉴런이 골재를 배출하는 방법의 생체 내 메커니즘을 정의하는 것은 실제로 인간의 신경 퇴행성 조건의 치료에 도움이 새로운 전략의 디자인에 영향을 미칠 수 있습니다.
기저 조건의 경우, 같은 생물학적 나이의 C.Elegans가 섭씨 20도의 일정한 온도에서 보관됩니다. 세포 내 역학및 엑소페네시스의 특성에 대한 실시간 이미징을 위해 최대 20마리의 동물을 유리 현미경 슬라이드에 아가로스 패드에 놓고 동물을 고정시하십시오. 마비된 벌레 위에 덮개 미끄러짐을 조심스럽게 놓고 슬라이드를 공초점 형광 현미경의 단계에 놓습니다.
10~40배의 목표를 사용하여 브라이트필드에서 원하는 Z 평면을 식별하여 웜의 위치, 머리 꼬리 방향 및 외음부 위치를 기록하며, 이는 나중에 뉴런 및 엑시퍼 식별을 위한 랜드마크입니다. 동일한 Z 평면에 머무르고, 선택한 사이토솔릭 리포터의 경우 10~40배의 광야 형광으로 전환하고, Z축 내를 스크롤하여 동물의 깊이와 초점 평면에서형광발현을 관찰한다. 머리는 형광 신경 고리를 가질 것이고, 더 뾰족한 꼬리에는 1~ 2개의 눈에 보이는 후방 측면 터치 뉴런 소마가 포함됩니다.
63x 렌즈를 사용하여 더 높은 배율은 신경 반지, 신경 과정 및 소마 바디를 확인하는 것을 도울 수 있습니다. 그것은 먼저 동물 과 측면 신경 과정의 머리에 있는 신경 반지를 식별 하는 데 도움이. 이렇게하려면 웜의 머리에서 시작하여 천천히 Z 축을 스크롤하여 신경 과정이 부착된 신경 고리의 평면을 식별합니다.
신경 고리가 확인되면, 형광 보기에서 소마가 명백할 외음부를 향한 후부 방향으로 측면으로 부착 된 뉴런 과정을 따릅니다. 둥근 소마 몸 또는 신체가 집중되면 근처의 모든 뉴런을 식별하는 것이 중요합니다. 터치 뉴런 식별을 위해, 먼저 ALML, ALMR 및 AVM 소마를 찾아, 이는 가장 밝은 신호와 과정의 끝에 둥근 세포 체체에 의해 표시되어야한다.
초점 중가장 신경 세포 소종이 발견되면, AVM 세포를 사용, 복부 세포, 방향을 할당하는 데 도움이. AVM 뉴런이 ALM과 동일한 평면에 있는 경우, 동물은 측면에 휴식 하 고 측면 뉴런은 ALMR. AVM 뉴런이 문제의 ALM과 동일한 평면에 있지 않으면 초점 평면에 가장 가까운 터치 뉴런은 ALML 뉴런입니다.
또한 도움이 PVM 뉴런을 식별하는 것입니다, 이는 꼬리 근처에위치한 복부 터치 뉴런입니다. PVM의 초점 평면은 전방 터치 뉴런이 ALML 또는 ALMR인지 여부를 나타냅니다. 문제의 ALM이 PVM과 동일한 평면에 있는 경우 관찰된 터치 뉴런은 ALML 뉴런입니다.
가장 초점 ALM이 확인되고 할당 된 후, 관심 영역 근처와 Z 비행기의 모든 에서 다른 soma 신체의 위치를 결정하는 것이 중요합니다, exophers에 대한 그들을 착각하지 않기로. 관심의 터치 뉴런이 발견되면, ALMR 또는 ALML, 큰 돌출 외출 도메인에 대한 뉴런을 검사, 싹 exopher로 간주 될 정도로 큰, 이는 적어도 1 5 분의 1 의 크기는 유래 소마의 크기. 싹이나 외향적 도메인이 관찰되지 않으면, 세포 소마를 추가로 검사하여 소마 체에서 방출되는 부착된 얇은 필라멘트를 검사합니다.
부착된 exophers는 유래 소마와 유사한 Z 평면에 더 가깝게 위치하는 경향이 있습니다. 부착되지 않은 외향성 제거를 식별하려면 소마보다 종종 밝은 농축 된 추방 형광 단백질을 찾습니다. 여기에 묘사되었지만, 하나의 큰 exopher가있다.
단일 소마에서 유래하는 형광 엔티티가 하나 이상 있을 수 있다. 다른 초점 비행기와 기원소마가 발견 된 먼 측면 지역에서 부착되지 않은 exophers을 찾습니다. 엑소퍼는 전형적으로 신경 과정에서 후방 방향으로 소마에서 멀리 돌출.
뉴런 소마로 위치및 식별되지 않은 큰 구형 물체를 확인합니다. 엑소퍼는 일반적으로 비원 구조이지만 시간이 지남에 따라 저하되어 더 불규칙한 모양을 획득할 수 있습니다. 별이 빛나는 야간 이벤트의 존재와 여러 exopher 이벤트의 인스턴스를 검색합니다.
엑소퍼에 대한 오해와 비행기 외 소마를 피하기 위해, 관찰의 시작 부분에 모든 근처의 소마, 심지어 초점이 없는 소마를 식별하는 것이 중요합니다. 연장 또는 뾰족한 소마를 관찰할 수 있지만 명확한 수축 부위가 없는 확장은 exopher로 점수를 매겨서는 안됩니다. exopher 이벤트 정량화에서 소마의 5 분의 1 크기를 달성하지 않는 작은 해결 된 싹을 거부합니다.
성숙한 neurites나이가 들면서 극적으로 확장될 수 있고 형광 단백질은 그러한 구조의 단부 끝으로 이동할 수 있지만, 신경질적인 성장을 exophers로 계산하지 마십시오. 엑소셔가 아닌 형광실을 식별하려면 광야 형광 하에서 별이 빛나는 야간 성전사 로 오인 될 수있는 자동 형광을 배제하십시오. 배아 형광 신호를 제외하려면 형광과 밝은 필드 조명 사이를 전환하고 자궁 내의 계란과 신호의 연관성을 확인하십시오.
이 표는 엑소셔 생산을 모니터링하는 데 사용 된 다른 터치 뉴런 표현 형광 기자의 요약을 제공합니다. 외향적으로 압출된 것으로 알려진 화물에는 Q128, 인간 헌팅턴 확장 폴리글루타민 반복의 융합, 리소좀 GFP가 리소말 관련 멤브레인 단백질로 태그된 리소좀 GFP, 매트릭스-현지화된 GFP로 태그된 미토콘드리아 등의 골재가 포함된다. 세포질 GFP는 강하게 추방되지 않으며, GFP가 약하게 exophers를 시각화하는 데 사용할 수 있지만, 소마에 우선적으로 유지됩니다.
일반적으로, 기초 조건하에서 ALMR 뉴런 표현 mCherry에 의한 exopher 생산은 성인의 첫날에 시작되고 성인 의 주요 exopher 생산 기간 내에서 검사된 AlM의 약 5~25%에 구역수색됩니다. 특정 스트레스와 유전 적 혼란은 ALMR 뉴런 내에서 exopher 생산을 크게 증가시킬 수 있습니다. 관심의 뉴런과 주변 지역을 발굴하기 전에 근처의 모든 뉴런을 찾는 것이 중요합니다.
exophers를 수동으로 식별하는 데 익숙해지면 고함량 이미징을 사용하여 대규모 스크리닝을 위한 향상된 처리량 방법을 사용하여 전체 게놈 분석 및 기계성 외발성 해부를 사용할 수 있습니다.
