7.1K Views
•
09:06 min
•
September 18th, 2020
DOI :
September 18th, 2020
•0:04
Introduction
0:47
Exopher Detection
2:11
Touch Neuron Identification
4:26
Exopher Identification and Scoring
6:43
Non-Exopher Identification
7:13
Results: Representative Exopher Production
8:26
Conclusion
Transcript
Vi karakteriserer in vivomekanismer for aggregert og organelle ekstrudering fra nevroner via en prosess som kalles eksofergenese, dårlig forstått biologi som sannsynligvis er relevant for nevrodegenerativ sykdomspatologi spredning. Disse tilnærmingene er nødvendige for å oppnå reproduserbar scoring av ekstruderte nevronale eksokrovialer og demonstrere en plattform for mekanistisk disseksjon av cellulær søppeleliminering via nevronal overføring til nærliggende celler. Definere in vivo mekanismer for hvordan nevroner kaste ut aggregater kan faktisk påvirke utformingen av nye strategier for å hjelpe til med behandling av menneskelige nevrodegenerative forhold.
For basale forhold, hus C.Elegans av samme biologiske alder ved en konstant temperatur på 20 grader Celsius. For levende avbildning av den intracellulære dynamikken og egenskapene til eksofergenese, plasser opptil 20 dyr på en agarospute på et glassmikroskopsklie, og immobilisere dyrene. Plasser forsiktig et deksel slip over de lamme ormene og plasser lysbildet på scenen av et konfokal fluorescensmikroskop.
Bruk et 10 til 40x mål for å identifisere ønsket Z-plan i Brightfield, ta notater av plasseringen av ormen, hodehaleorienteringen og vulvaplasseringen, som er landemerker for senere nevronal og exopher identifikasjon. Bor i samme Z plan, bytt til widefield fluorescens visning på 10 til 40x for den valgte cytosoliske reporter, og bla innenfor Z-aksen for å observere dybden av dyret og fluorescens uttrykk i fokalplanet. Hodet vil ha en fluorescerende nervering, og den mer spisse halen vil inneholde en til to synlige bakre laterale berøring neuron somas.
Høyere forstørrelse med en 63x linse kan bidra til å identifisere nerveringen, nevronale prosesser og somalegemer. Det er først nyttig å identifisere nerveringen som ligger i dyrets hode og laterale nevronale prosesser. For å gjøre dette, start på ormens hode og rull sakte gjennom Z-aksen for å identifisere planet av nerveringen der de nevronale prosessene er festet.
Når nerveringen er identifisert, følger fluorescensvisningen den vedlagte nevronale prosessen sideveis i bakre retning mot vulva, hvor soma vil være tydelig. Når den runde soma kroppen eller kroppene er i fokus, er det viktig å identifisere alle nevronene i nærheten. For berøring neuron identifikasjon, først finne ALML, ALMR, og AVM soma, som bør være de lyseste signaler og preget av en rund celle kropp på slutten av prosessen.
Når den mest in-focus neuronal soma har blitt plassert, bruk AVM-cellen, en ventral celle, for å hjelpe til med å tildele orienteringen. Hvis AVM-nevronen er i samme plan som ALM, hviler dyret på siden og lateralnevronen er ALMR. Hvis AVM-nevronen ikke er i samme plan som det aktuelle ALM, er det nærmeste berøringsneuronet til fokalplanet ALML-nevronen.
Også nyttig er å identifisere PVM neuron, som er en ventral touch neuron ligger nær halen. Fokusplanet til PVM vil indikere om den fremre berøringsneurnen er ALML eller ALMR. Hvis den aktuelle ALM er i samme plan som PVM, er den observerte berøringsneuron alml-nevronen.
Etter at den mest in-focus ALM har blitt identifisert og tildelt, er det viktig å bestemme posisjonene til de andre soma organer nær interesseområdet og i alle Z-flyene, som å ikke forveksle dem for exophers. Når berøringsnevronen av interesse har blitt plassert, almr eller ALML, inspisere neuron for store utstående exopher domener, stor nok til å bli betraktet som en knopp exopher, som er minst en femtedel av størrelsen på den opprinnelige soma. Hvis ingen knopp eller exopher domene observeres, må du ytterligere inspisere den nevronale soma for en vedlagt tynn filament som kommer fra soma kroppen.
Vedlagte eksfosere har en tendens til å være plassert nærmere den opprinnelige soma og i et lignende Z-plan. For å identifisere en ufestet exopher, se etter konsentrert utviste fluorescerende proteiner, som ofte er lysere enn soma. Selv om det er avbildet her, er det en stor eksopher.
Det kan være mer enn én fluorescerende enhet som stammer fra en enkelt soma. Se etter ufestede eksfosere i forskjellige fokale fly og i den fjerne laterale regionen hvor den opprinnelige soma ble funnet. Eksofærene stikker vanligvis ut fra soma i en bakre retning fra nevronalprosessen.
Se etter store sfæriske objekter som ikke er plassert og identifisert som nevronale somas. Selv om eksfosere vanligvis er sphyrical strukturer, de kan bli degradert over tid, anskaffe en mer uregelmessig form. Søk etter tilstedeværelsen av stjerneklare natthendelser og for forekomster av flere exopher hendelser.
For å unngå mistaking og ut-av-fly soma for en exopher, er det viktig å identifisere alle nærliggende soma organer, selv ut-av-fokus somas i begynnelsen av observasjonen. En utvidet eller spiss soma kan observeres, men en forlengelse uten et klart innsnevringssted bør ikke scores som en exopher. Avvis små løste knopper som ikke oppnår en femtedel av størrelsen på soma i exopher hendelse kvantifisering.
Selv om modne neuritter kan strekke seg dramatisk med alderen, og fluorescerende proteiner kan migrere inn i den distale enden av slike strukturer, teller ikke neuritt utvekster som exophers. For å identifisere fluorescerende enheter som ikke er exophers, sørg for å utelukke noen autofluorescens, som kan forveksles med stjerneklar natt vesicular rusk under widefield fluorescens. For å utelukke embryonale fluorescerende signaler, bytt mellom fluorescens og brightfield belysning, og se etter assosiasjon av signalet med egg i livmoren.
Denne tabellen gir et sammendrag av forskjellige berøringsneuron uttrykte fluorescerende reportere som har blitt brukt til å overvåke exopher produksjon. Laster som er kjent for å bli ekstrudert i eksofag inkluderer aggregater som Q128, en blanding av human Huntington utvidet polyglutamin repetisjoner, lysosomer GFP merket med lysosomal assosiert membranprotein, og mitokondrier merket med matrise-lokalisert GFP. Cytoplasmatisk GFP er ikke sterkt utvist, og er fortrinnsvis beholdt i soma, selv om GFP kan brukes til å visueltisere eksofile.
Generelt begynner exopher produksjon av ALMR neuron-uttrykkende mCherry under basale forhold på dag en av voksen alder og varierer fra ca fem til 25% av ALMRs undersøkt innenfor den viktigste exopher produksjons tidsramme av voksen dag en til tre. Spesielle påkjenninger og genetiske perturbasjoner kan i stor grad øke exopher produksjonen i ALMR nevroner. Det er avgjørende å finne alle de nærliggende nevronene før du inspiserer nevronen av interesse og det omkringliggende området for exopher domener, intakte exophers, eller stjerneklare natt hendelser.
Når du er komfortabel med å identifisere eksotyper manuelt, kan forbedrede gjennomstrømningsmetoder for storskala screening ved hjelp av høyinnholdsavbildning brukes, slik at hele genomanalyse og mekanistisk eksofergenese disseksjon.
Denne protokollen beskriver tilnærminger for deteksjon og kvantisering av store aggregater og/eller organelleprofiler (~4 μm) produsert av C. elegans celler i form av membranbundne eksfoster. Vi beskriver stammer, vekstforhold, scoringskriterier, timing og mikroskopihensyn som trengs for å lette disseksjon av denne utvisningsmekanismen for rusk.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved