Name: quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in c. elegans
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans at JoVE.com

Aşağıdaki NIH hibelerini kabul ediyoruz: R01AG047101 ve R37AG56510. Driscoll ve Grant laboratuvarlarının üyeleri, sıkı deneyler ve güçlü iletişim le tanımlanan protokollerin geliştirilmesine ve ince ayarlanmasına büyük katkıda bulunmuştur.

<ol>
	<li>Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+Spread+of+Protein+Aggregates+in+Neurodegenerative+Disease.">Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).</li><li>Davis, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+degradation+of+axonal+mitochondria.">Transcellular degradation of axonal mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).</li><li>Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+Know+No+Boundaries:+Mechanisms+and+Functions+of+Intercellular+Mitochondrial+Transfer.">Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107 (2016).</li><li>Stahl, P. D., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Exosomes+and+Microvesicles+Integrators+of+Homeostasis.">Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis.</a> Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).</li><li>Melentijevic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-elegans+neurons+jettison+protein+aggregates+and+mitochondria+under+neurotoxic+stress.">C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress.</a> Nature. 542 (7641), 367 (2017).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+a+prion+domain+from+cell-to-cell+by+vesicular+transport+in+Caenorhabditis+elegans.">Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 9 (3), 1003351 (2013).</li><li>Tyson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+animal+model+defines+genetic+contributions+for+neuron-to-neuron+transfer+of+alpha-synuclein.">Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain.">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).</li><li>Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+transmission+of+neuronal+huntingtin+aggregates+to+phagocytic+glia+in+the+Drosophila+brain.">Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain.</a> Nature Communications. 6, 6768 (2015).</li><li>Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+wastes+are+extracellularly+disposed+by+excretosomes,+nanotubes+and+exophers+in+mouse+HT22+cells+through+an+autophagic+vesicle+clustering+mechanism.">Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism.</a> bioRxiv. 10 (1), (2019).</li><li>Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia-reoxygenation+regulates+mitochondrial+dynamics+through+the+hypoxia+response+pathway,+SKN-1/Nrf,+and+stomatin-like+protein+STL-1/SLP-2.">Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2.</a> PLoS Genetics. 9 (12), 1004063 (2013).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-sensitive+green+fluorescent+protein:+probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review.">Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).</li><li>Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+sensory+cilia+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine.">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li><li>Weicksel, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+small+molecule+that+disrupts+a+key+event+during+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans.">A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms.">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PloS One. 13 (3), 0193989 (2018).</li><li>Toth, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+sprouting+and+synapse+deterioration+in+the+aging+Caenorhabditis+elegans+nervous+system.">Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).</li><li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans.">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).</li><li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1.">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li><li>Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+dsRNA+feeding+libraries+to+generate+robust+loss-of-function+phenotypes.">Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50693 (2013).</li></ol>

Agrega ve organel eliminasyonunun in vivo moleküler mekanizmalarının büyük eksophers şeklinde karakterizasyonu emekleme dönemindedir. Sınırdışı için yüklerin atanması, hücre içindeki bu yüklerin polarize toplaması, eksopher oluşturma kararının düzenlenmesi, ekstrüzyonlara aracılık eden makinelerin düzenlenmesi ve ekstrüzyonların komşu hücredeki bozunan makinelerle etkileşimi ile ilgili sorular ele alınmaya devam etmektedir. Ayrıca, kalsiyum, agrega ve mitokondri içeren biyolojik maddeleri geçirebilen boru bağlantılarının in vivo görselleştirilmesi ilginçtir ve kendi başına yeterince incelenmiştir. Bazı hücrelerin neden eksopher üretimine diğerlerinden daha yatkın olduğu sorusu da çözülmese de, bu protokolde belirtilen yaklaşımlarla genetik olarak incelenmeye başlanabilir.
Bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan eksopher üretiminin tekrarlanabilir skorlama elde etmek için yaklaşımlar, yakındaki hücre somas gelen eksophers ayırt dikkat ile, eksopher üretiminin doruk yakalamak için analizzamanlaması, ve ekofher düzeylerini modüle etmek istenmeyen stresleri ortadan kaldırmak için büyüme koşullarının sıkı kontrolü. Büyük erken dışa dönük lük ya da çevredeki hipodermisin "yıldızlı gece" dağılımı, eksopher üretiminin kanıtı olarak ölçülebilir. Bu söyleniyor, bazal koşullar altında mCherry ifade nöronlar en sık bir eksopher üreten belirli bir tip nöronların% 5-25 ile ilişkilidir. Ekstrüzyon üreten nöronların %90'ı kadar yüksek olan ve özellikle modifiye ediciler için genetik veya farmakolojik ekranlar için yararlı olan eksopher üretimini artırmak için stres koşullarının kontrollü olarak getirilmesi uygulanabilir.
İnsan nörodejeneratif hastalık, büyük agregalar patoloji yayılmasını teşvik etmek için komşu hücrelere hastalıklı nöronlar aktarabilirsiniz. Eksopher mekanizması phyla boyunca agrega ekstrüzyon için kullanılan korunmuş bir mekanizma ile transpire olabilir. Ya bu sürecin verimliliğini artırmak in vivo molekülleri tanımlanması (daha etkili proteostaz kontrolü olarak kabul edilir) ya da birden fazla nörodejeneratif hastalıklarla mücadele için yeni stratejilerin tasarımı nı etkilemek için harnessed olabilir blok. Bu nedenle, burada açıklanan protokol klasik genetik mutagenez ekranları, genom çapındaki RNAi ekranları, arttırıcıları ve bastırıcıları tanımlamak için genleri sistematik olarak deviren ekranlar veya bu sürecin aday farmakolojik değiştiricilerini tanımlayan ilaç müdahale çalışmaları için kullanılabilir. Yaklaşım, biraz zahmetli olmasına rağmen, basittir. Eksophers onlar yüksek büyütme diseksiyon mikroskop ile görülebilir büyüktür. Yine de, C. elegans nöronlar nispeten küçük ve organelleri veya membranlar bakarak daha yüksek güç konfokal görüntüleri gerektirir ve yavaş bir süreçtir. Daha yüksek iş elde etme seçenekleri, çok iyi plaka biçiminde yüksek içerikli görüntüleme yaklaşımlarını içerebilir.
Eksopher puanlama için standart bir yaklaşım uygulaması hangi nöronlar organize ve hücresel enkaz ortadan kaldırmak sürecin uyumlu bir genetik diseksiyon altında yatan olmalıdır.

Agregalar ve disfonksiyonel mitokondri nörotoksik zorluklar uzun hücre içsel olarak kabul edilmiştir, ama daha yakın zamanda bir nöron kaynaklanan yanlış katlanmış insan hastalığı proteinleri de komşu hücrelere yayılabilir açık hale gelmiştir, patoloji teşvik1. Aynı şekilde, memeli mitokondri transsellüler bozunma 2 veya meydan2 komşu hücrelerde mitokondriyal popülasyonların kurtarılması için orijinal üretim hücre dışına gönderilebilir3. Çeşitli boyutlarda veziküller genellikle komşu hücrelere veya sıvıçevresinehücresel malzeme aktarmak için gözlenmiştir 4 . Bazı ekstrüde veziküller ortalama nöronal soma boyutuyaklaşım (ortalama dokunmatik nöron soma ~ 6 μm) ve büyük agregalar ve organeller barındırabilir.
Protein agregaları ve organeller taşıyabilir büyük vezikül ekstrüzyon çarpıcı bir örnek C. elegans dokunmatik reseptör nöronlar yüksek bir kopya numarası muhabiri bir zararlı toplama eğilimli kodlama oluşturmak ifade oluşur, bozulmaya dirençli mCherry5. Dokunma nöronlarından ekstrüzyonlar, eksoshers denilen ekstrüzyonlar, ~ 4 μm ortalama çapı, seçici mCherry veya diğer agregalar içerir, ve komşu hipodermis doğrudan teslim edilir, normalde dokunma reseptör nöronları çevreleyen. Hipodermis lizom bazlı bozulmayı dener, ancak mCherry agregaları gibi bazı sindirilemeyen içerikler hipodermis tarafından hayvanın sıvı dolu pseudocoelom'una yeniden ekstrüzyon yapılabilir, bu da mCherry'nin uzun süreli depolama için coelomocyte adı verilen uzak çöpçü hücreleri tarafından alınabilir (Şekil 1, Şekil 2)5.
Büyük ekstrüzyon ekzotek vezikülleri dokunma reseptör plazma zarı ile çevrili hücre bırakın ve toplu insan hastalığı proteinleri içerebilir, mitokondri, ve lizozomlar. Eksopher üretim süreci potansiyel olarak toksik türlerin sıralanması (örneğin bir toplama eğilimli ifade mCherry çözünür, çoğunlukla nöronal soma kalır GFP gibi zararsız proteinler ayrılmış) içeren gibi görünüyor. Bu şekilde, tehdit edici varlıkların yönlendirilmiş sınırdışı nöron tarafından gerçekleştirilir5. Bir proteostaz sorun, otofaji yıkılması tarafından indüklenen stres gibi, MG132 aracılı proteozom inhibisyonu, huntington hastalığı ile ilişkili genişletilmiş poliglutamin Q128 veya Alzheimer hastalığı ile ilgili parça Aβ1-42gibi insan hastalığı proteinlerinin transgenik ekspresyonu , exhers üreten nöronların sayısını artırabilir5.
Exophers sadece son zamanlarda belgelenmiştir gibi, ne onların biyoloji yararları açıklama bilinmektedir. Eksophers keşfedildi, ve en iyi çalışılan, C. elegans dokunmatik reseptör nöronlar. Altı C. elegans mechanosensory touch nöronlar olan hücre organları vücuda dağılmış var(Şekil 3A) ve mikrotübül hücreleri denir çünkü ultrayapısı ayırt edici özellikleri 15 protofilament mikrotübüller. Dokunma reseptör nöronlar anterior AVM vardır (anterior ventral mikrotübün nöron), ALMR, ve ALML (ön lateral mikrotübün nöronlar sağ ve sol), daha merkezi PVM (posterior ventral mikrotübül nöron), ve posterior PLMR ve PLML (posterior lateral mikrotübül nöronlar sağ ve sol). İlginçtir, altı dokunmatik reseptör nöronlar farklı oranlarda ekofherler üretmek, aynı saldırgan transgen ifade rağmen (Şekil 3C). Altı mekanosensoriyel dokunma reseptör nöronlar, ALMR nöron diğer dokunma nöronlar daha sık eksozgenez uğrar. Dokunma nöronlarından eksopher numaralarının sayısallaştırılması böylece genellikle ALMR'ye odaklanılarak kurulur.
Ekofhernez genellikle nöronal sitoplazmanın şişmesi ile başlayan dinamik bir süreçtir (Şekil 1A-B). Hücresel içerikler, organeller veya protein agregaları nöronal somanın bir tarafına toplanır, en sık ALMR nöronun arka ucuna doğru (projektif netüritten uzakta), bir ön eksosetki alanı (PED) oluştururlar(Şekil 1B). PED dışa doğru yansıtmaya başladığında erken çıkıntı gözlenir ve tanınabilir bir çıkıntılı tomurcuk oluşturur. Geç tomurcuk, soma-ekopher boynunun daralması çapından yaklaşık 1/3 daha büyük olan pre-exopher etki alanının en geniş çapı nın yaklaşık olarak 1/3'ü olduğunda tanımlanır(Şekil 1C). Eksophers soma hemen hemen herhangi bir yönde atılabilir, ancak en ekofers hücre gövdesinden posteriora çıkmak ve kökeni soma olarak yaklaşık aynı odak düzleminde kalır.
Dış aparat, tomurcuk boyun ince bir filament içine daralır gibi gelen soma uzak hareket edebilir. Exophers bu filament(Şekil 1D, ok)ile soma bağlı kalabilir ve daha sonra kopuk olabilir. Kalsiyum gibi hücresel içerikler, agregalar, ve mitokondri ekli exopher içine bu filament yoluyla transfer edilebilir5, ekstrüde malzemenin toplu büyük tomurcuklanma olayı tarafından exopher bölmesi içine konulsa da. Ekophers görünür bir bağlantı tüpü veya ince filament olduğunda olgun olarak kabul edilir ve eksopher gönderme soma tamamen ayrılır(Şekil 1E).
C. elegans dokunma nöronları tarafından üretilen exophers hemen hipodermis karşılaşma, dokunma nöron çevreleyen doku. En yaygın olarak, eksopher vezikül hipodermis içinde arka arkaya kuyruk doğru seyahat görünür, ve dışa dönük içeriği bozulma için hedefli görünmeden önce soma oldukça uzak olabilir (örneğin, mesafe ~ 100 μm uzaklıkta soma olabilir(Şekil 1F)). Floresan eksopher vezikül hipodermis içinde çok daha küçük veziküller içine ayrılır, bir görünüm alarak "yıldızlı gece"(Şekil 1G ve Şekil 2). "Yıldızlı gece" aşamasında, punctate floresan malzeme orijinal yalnız exopher göre floresan birçok küçük noktalarıiçine hipodermal senkronium dağılmış görülebilir. Yıldızlı gece düşük büyütme altında delinmiş bakabilirsiniz ve yüksek büyütme ile, punctate ve / veya hipodermis içinde ağ bakabilirsiniz. Yıldızlı gecenin floresan sinyali genellikle eksopher ve nöronsal olarak ifade edilen floresandan daha sönüktür (Şekil 2B-C). Birçok punctate veziküller içine mCherry dağılımı hipodermal hücrenin endozomal / lysozomal ağ ile fagozom olgunlaşma ve füzyon içerdiği düşünülmektedir. Bazı ekopher malzemeleri muhtemelen hipodermal lisozomal ağda bozulur, ancak bozulmaya karşı dirençli artık türler (mCherry agregaları gibi) hipodermisten hücresel enkaz içerebilen bir sıvı bölmesi olan pseudocoelom'a atılır. Floresan malzeme daha sonra coelomocytes denilen uzak çöpçü hücreleri tarafından alınır(Şekil 2C),hangi konsantre olabilir, depolamak, ve tekrar mCherry bozulmagirişimi.
Agrega ekstrüzyon ve transfer olgusu phyla boyunca korunmuş olarak görünür, C. elegans5gibi genetik modellerde bildirilmiştir 5,6,7 ve D. melanogaster8,9 yanı sıra birden fazla memeli modelleri. Ekopher benzeri ekstrüzyonlar memeli hücreleri için bildirilmiştir10, korunmuş mekanizmalar agrega ve organel ihracı altında yatan olabileceğini düşündüren bir gözlem. Exopher üretimi böylece temel bir hücresel enkaz yönetimi korunmuş bir mekanizma olabilir, ama daha önce tanınmayan, nöronal proteostaz ve mitokondriyal kalite kontrolü dalı, hangi, dengesiz, aktif nörodejeneratif hastalığa katkıda bulunabilir. Enkaz ayrımcılığı ve ayrıştırma ile ilgili moleküllerin tanımlanması, ayrı bir hücre altı lokaline taşınması, ekstrüzyon, soma ve geç eksopher'i birbirine bağlayan borubağlantısının oluşumu/makaslanması ve komşu hücre tarafından uzaktan bozulması için büyük ekstrüzyon vezikülünün tanınması gelecekteki çalışmalar için kalır. Nematod ve sinek modellerinde yapılan çalışmalar, agrega ve organel toplama ve aktarma mekanizmalarının tanımlanması, bu modellerin katılımcı molekülleri fizyolojik bağlamda tanımlamak için sunduğu tarafsız genetik yaklaşımlar ve güçlü hücre biyolojik araçlarının kullanılması açısından kritik öneme sahiptir.
Eksopher biyolojisinde etkili mekanizmaların deşifre edilmesinde kritik ilk adımlar, in vivo ekopher nicelleştirmede tekrarlanabilir protokollerin tanımlanmasını içerir. C. elegans modeli, vücut şeffaf olduğundan ve floresan etiketli proteinler veya organeller içerdiklerinde kolayca gözlemlenebildiği için bu tür çabalar için özel bir avantaj sunar. Ekophers C. elegans dopaminerjik nöronlar PDE ve CEP, ASE ve ASER duyusal nöronlar tarafından oluşturulan bildirilmiştir, ve boya dolum amphid nöronlar5. Dokunma reseptör nöronları tarafından üretilen ekophers en iyi karakterize olduğundan, burada odak ekofher analizi için dokunmatik nöronların kullanımı üzerindedir. Ancak herhangi bir hücreden eksopher üretimini ölçmek için temel yaklaşım uygulanabilir. C. elegans tarafından üretilen ekofherleri algılamak ve quantitate etmek için protokoller transgenically mCherry protein ifade reseptör nöronlar dokunun, takip edilebilir yükler ve puanlama zamansal kısıtlamalar üzerinde durularak. Bu makalede, in vivo ekopher tanımlamaya yönelik yaklaşımlar ve eksopher üretimini modüle eden çevresel ve genetik koşulların niceliği tanımlanabılmaktadır. Protokoller, temel eksopher üretiminin belirlenmesi ve genotipler arasında karşılaştırmalar için sürekli gerilim dışı koşullara eleştirel dikkat ilerler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:604px;" width="603">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">95B Scientific CMOS camera</td>
			<td style="width:108px;">Photometrics Prime</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">1,000 &#956;L low retention tips</td>
			<td style="width:108px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">10 mL serological pipette</td>
			<td style="width:108px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:128px;">CC214</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">10 &#956;L low retention tips</td>
			<td style="width:108px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:128px;">70.1130.105</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">13% sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:108px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:128px;">AC219255000</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">05-539-12</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td style="width:108px;">Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:128px;">FLA4036</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">25 mL serological pipette</td>
			<td style="width:108px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:128px;">CC216</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">300 &#956;L low retention tips</td>
			<td style="width:108px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:128px;">70.765.105</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">50 mL serological pipette</td>
			<td style="width:108px;">Appleton Woods</td>
			<td style="width:128px;">CC117</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td style="width:108px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:128px;">L16497.ME</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">9 cm sterile Petri dishes</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">11309283</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">absolute ethanol</td>
			<td style="width:108px;">Vwr</td>
			<td style="width:128px;">20821.33</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Agar</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">A1296</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">C. elegans strain wild type</td>
			<td style="width:108px;">Supplied by CGC</td>
			<td style="width:128px;">N2</td>
			<td style="width:177px;">C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">C3881</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">cholesterol</td>
			<td style="width:108px;">Acros</td>
			<td style="width:128px;">110190250</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">dibasic sodium phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">S3264</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">E. coli strain OP50</td>
			<td style="width:108px;">Supplied by CGC</td>
			<td style="width:128px;">Op50</td>
			<td style="width:177px;">E coli strain</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">FBS10 Standard microscope</td>
			<td style="width:108px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:128px;">KSC 410-1-100-1</td>
			<td style="width:177px;">FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">glass pipette 270 mm</td>
			<td style="width:108px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">FB50255</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td style="width:108px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:128px;">75004515</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Inoculating Spreaders</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">11821741</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">LB medium capsules</td>
			<td style="width:108px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:128px;">3002-031</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">LDI &#8211; Laser Diode Illuminator</td>
			<td style="width:108px;">89 North</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">levamisole</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">16595-80-5</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">M4 multipette</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:128px;">4982000012</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">magnesium sulphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">M7506</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">P0662</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td style="width:108px;">Infors HT</td>
			<td style="width:128px;">INFO28573</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">3120-1000</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">P10 pipette</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf Research Plus</td>
			<td style="width:128px;">3123000020</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">P1000 pipette</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf Research Plus</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">P200 pipette</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf Research Plus</td>
			<td style="width:128px;">3123000055</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">pipeteboy 2</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:128px;">612-0927</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Polystyrene microbeads</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">MFCD00131491</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td style="width:108px;">Sorvall</td>
			<td style="width:128px;">9900884</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Reusable ringed cytology slides</td>
			<td style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">22037242</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">GFP expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">13422</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:128px;">S/4880/53</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td style="width:108px;">Priorclave</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Triton-X</td>
			<td style="width:108px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:128px;">28313</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">Tween 20</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">9005-64-5</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit</td>
			<td style="width:108px;">CrestOptics</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">mCherry expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">Q128 expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">mitoROGFP expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td>
			<td style="width:108px;">contract Driscoll lab</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;">autophagy marker expressed in touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:54px;width:191px;">ZEISS Axio Vert.A1</td>
			<td style="width:108px;">Zeiss</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in c. elegans

Yanlış katlanmış proteinlerin toksisitesi ve mitokondriyal disfonksiyon, türler arasında yaşa bağlı fonksiyonel nöronal gerileme ve nörodejeneratif hastalığı teşvik eden önemli faktörlerdir. Bu nörotoksik sorunlar uzun hücre-içsel olarak kabul edilmiş olmasına rağmen, önemli kanıtlar şimdi bir nöron kaynaklanan yanlış katlanmış insan hastalığı proteinleri komşu hücrelerde görünebilir destekler, insan nörodejeneratif hastalık patoloji yaymak teşvik etmek için önerilen bir fenomen.
C. elegans yetişkin nöronlar bu toplama proteinleri ifade büyük ekstrüzyon olabilir (~4 μm) membran çevrili veziküller toplu protein içerebilir, mitokondri, ve lizozomlar. Bu büyük veziküller "ekophers" olarak adlandırılır ve ekzozomlardan farklıdır (yaklaşık 100 x daha küçüktür ve farklı biyogeneze sahiptir). Eksophers hücresel enkaz dışarı atma temel oluşturan korunmuş bir mekanizma tarafından oluşabilir, ama daha önce tanınmayan, nöronal proteostaz ve mitokondriyal kalite kontrolü dalı, hangi agregalar insan nörodejeneratif hastalıklarda yayıldı süreçleri ile ilgili.
Ekoferler çoğunlukla dokunma nöronların içinde yüksek kopya transgenik mCherry ifade hayvanlarda incelenmiş olsa da, bu protokoller flüoresans etiketli organeller veya nöronların çeşitli sınıflarda ilgi diğer proteinler kullanarak ekofhergenez çalışmalarında eşit derecede yararlıdır.
Burada açıklanan C. elegans ekophers fiziksel özellikleri, bunların tespiti için stratejiler, tanımlama kriterleri, nicelik için optimal zamanlama ve dışa dönük üretim düzeylerini modüle edebilir stresler için kontrol hayvan büyüme protokolleri vardır. Birlikte, burada özetlenen protokollerin ayrıntıları laboratuvarlar arasında eksophers kantitatif analizi için bir standart oluşturmak için hizmet etmelidir. Bu belge, eksopherlerin üretildiği ve eksopherlerin komşu ve uzak hücreler tarafından tepkiverilen moleküler mekanizmaları ayrıntılı olarak ortaya koyan laboratuvarlar için sahada bir kaynak olarak hizmet vermeyi amaçlamaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans at JoVE.com

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Bu protokol, C. elegans hücreleri tarafından membrana bağlı ekophers şeklinde üretilen büyük agrega ve/veya organel ekstrüzyonların (~4 μm) tespiti ve niceliği için yaklaşımları açıklamaktadır. Bu enkaz kovma mekanizmasının diseksiyonunu kolaylaştırmak için gerekli suşları, büyüme koşullarını, puanlama kriterlerini, zamanlamayı ve mikroskopi hususlarını tanımlıyoruz.

C. elegans'ta Büyük Ekofher Veziküllerde İnvivo Nöronal Agrega ve Organel Ekstrüzyon Puanlama da Kantitatif Yaklaşımlar

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Nörodejeneratif hastalık patolojisi yayılımı ile ilgili olarak, eksogenez, kötü anlaşılmış biyoloji adı verilen bir süreçle nöronlardan agrega ve organel ekstrüzyonun in vivo mekanizmalarını karakterize ediyoruz. Bu yaklaşımlar ekstrüzyon nöronal eksophers tekrarlanabilir puanlama elde etmek için gerekli ve komşu hücrelere nöronal transfer yoluyla hücresel çöp eliminasyonu mekanistik diseksiyon için bir platform göstermek. Nöronların agregaları nasıl çıkardığının in vivo mekanizmalarının tanımlanması, insan nörodejeneratif koşullarının tedavisinde yardımcı olmak için yeni stratejilerin tasarımını etkileyebilir.Bazal koşullar için, 20 santigrat derece sabit sıcaklıkta aynı biyolojik yaşta ev C.Elegans. Hücre içi dinamiklerin ve ekofhergenezin özelliklerinin canlı görüntülenmesi için, 20 kadar hayvanı cam mikroskop kaydırağında bir agaros pedine yerleştirin ve hayvanları hareketsiz hale getirin. Dikkatle felç solucanlar üzerinde bir kapak kayma yerleştirin ve bir konfokal floresan mikroskop aşamasına slayt yerleştirin.Brightfield istenilen Z düzlemi tanımlamak için 10-40x objektif kullanın, solucan konumlandırma notları alarak, baş kuyruk oryantasyonu, ve vulva konumu, hangi daha sonra nöronal ve exopher kimlik için dönüm noktası olan. Aynı Z düzleminde kalarak, seçilen sitosolik muhabir için 10 ila 40 x geniş alan floresan görüntülemeye geçin ve odak düzlemindeki hayvanın derinliğini ve floresan ifadesini gözlemlemek için Z ekseni içinde ilerleyin. Baş floresan sinir halkası olacak, ve daha sivri kuyruk bir ila iki görünür posterior lateral dokunmatik nöron somas içerecektir.63x lens ile yüksek büyütme sinir halkası tanımlamak için yardımcı olabilir, nöronal süreçler, ve soma organları. İlk olarak hayvan ve lateral nöronal süreçlerin başında bulunan sinir halkası tanımlamak için yararlıdır. Bunu yapmak için, solucanın başında nöral süreçlerin bağlı olduğu sinir halkasının düzlemini belirlemek için yavaşça Z ekseninde ilerleyin.Bir kez sinir halkası tespit edilmiştir, floresan görünümünde vulva doğru arka yönde yanal bağlı nöronal süreci izleyin, soma belirgin olacak nerede. Yuvarlak soma vücut veya organları odak olduğunda, yakındaki tüm nöronlar belirlemek önemlidir. Dokunmatik nöron tanımlama için, ilk ALML bulmak, ALMR, ve AVM soma, hangi parlak sinyalleri olmalıdır ve sürecin sonunda yuvarlak bir hücre gövdesi ile işaretlenmiş.Bir kez en odak nöronal soma yer olmuştur, AVM hücre kullanın, bir ventral hücre, oryantasyon atamaya yardımcı olmak için. AVM nöron ALM ile aynı düzlemde ise, o zaman hayvan yan ve lateral nöron ALMR dinleniyor. AVM nöron söz konusu ALM ile aynı düzlemde değilse, odak düzlemine en yakın dokunmatik nöron ALML nörondur.Ayrıca yararlı PVM nöron tanımlamak için, kuyruk yakınında bulunan bir ventral dokunma nöron olan. PVM odak düzlemi ön dokunmatik nöron ALML veya ALMR olup olmadığını gösterir. Söz konusu ALM PVM ile aynı düzlemde ise, o zaman gözlenen dokunmatik nöron ALML nöron.En odak alm tespit edilip atandıktan sonra, ilgi alanı ve tüm Z uçakları nda yakın diğer soma organlarının konumlarını belirlemek önemlidir, exophers onları yanlış değil. İlgi touch nöron bulunduğunda, ALMR veya ALML, büyük çıkıntılı eksopher etki alanları için nöron incelemek, yeterince büyük bir tomurcuk eksopher olarak kabul edilecek, en az beşte biri kökenli soma boyutu. Hiçbir tomurcuk veya exopher etki gözlenirse, daha fazla soma vücuttan yayılan bağlı ince filaman için nöronal soma incelemek.Ekli eksophers soma kökenli yakın ve benzer bir Z düzlemde yer olma eğilimindedir. Bir bekar exopher tanımlamak için, genellikle soma daha parlak konsantre süzme floresan proteinler arayın. Burada tasvir edilmesine rağmen, büyük bir eksopher vardır.Tek bir soma dan kaynaklanan birden fazla floresan varlık olabilir. Farklı odak düzlemlerinde ve soma kaynaklı bulunan uzak lateral bölgede bekar eksophers arayın. Eksophers genellikle nöronal süreçten bir posterior yönde soma uzak çıkıntı.Nöronal somas olarak tanımlanan ve konumlandırılmayan büyük küresel nesneleri kontrol edin. Ekoferler genellikle boğucu yapılar olmasına rağmen, zaman içinde bozulabilir, daha düzensiz bir şekil elde. Yıldızlı gece olaylarının varlığını ve birden çok eksopher olayının örneğini arayın.Bir eksopher için yanlış ve düzlem dışı soma önlemek için, gözlem başında bile odak dışı somas, tüm yakın soma organları tanımlamak için önemlidir. Genişletilmiş veya sivri soma görülebilir, ancak net bir daralma yeri olmayan bir uzatma eksopher olarak puanlandırılmamalıdır. Exopher olay nicelleştirmede soma boyutunun beşte birine ulaşamayan küçük çözülmüş tomurcukları reddedin.Olgun nöritler yaşla birlikte önemli ölçüde uzatabilse ler ve floresan proteinler bu tür yapıların distal ucuna göç etseler de, dışa dönük çıkıntıları dışa dönük olarak saymaz. Ekophers olmayan floresan varlıkları tanımlamak için, geniş alan floresan altında yıldızlı gece vesiküler enkaz için yanlış olabilir herhangi bir otofloresan, dışlamak için emin olun. Embriyonik floresan sinyalleri dışlamak için, floresan ve brightfield aydınlatma arasında geçiş, ve rahim içinde yumurta ile sinyal ilişkilendirme kontrol edin.Bu tablo, eksopher üretimini izlemek için kullanılan farklı dokunma nöron ifade floresan muhabirlerin bir özetini sağlar. Ekzoteklerde ekstrüzyon yaptığı bilinen yükler arasında Q128, insan Huntington genişletilmiş poliglutamin tekrarlarının bir füzyonu, lysozomal ilişkili membran proteini ile etiketlenmiş lyozomlar GFP ve matris lokalize GFP ile etiketlenmiş mitokondri gibi agregalar bulunmaktadır. Sitoplazmik GFP güçlü bir şekilde sınır dışı edilmez ve tercihen soma'da tutulur, ancak GFP dışa dönükleri zayıf bir şekilde görselleştirmek için kullanılabilir.Genel olarak, bazal koşullar altında ALMR nöron ifade mCherry tarafından eksopher üretimi yetişkinliğin ilk gününde başlar ve yetişkin gün bir ila üç ana ekopher üretim zaman dilimi içinde incelenen ALMR yaklaşık% beş ila % 25 arasında değişmektedir. Özellikle gerilmeler ve genetik tedirginlikler ALMR nöronlar içinde eksopher üretimini büyük ölçüde artırabilir. Bu dışa etki alanları, bozulmamış eksophers, ya da yıldızlı gece olayları için ilgi ve çevredeki nöron incelemeden önce yakındaki tüm nöronlar bulmak için çok önemlidir.Ekopherleri manuel olarak tanımlamakta rahat olduğunuzda, yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak büyük ölçekli tarama için geliştirilmiş iş verme yöntemleri kullanılabilir, böylece tüm genom analizi ve mekanistik ekophergenez diseksiyonu kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...