Name: application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Genel: Yazarlar, Böbrek Hassas Tıp Projesi (www.kpmp.org) araştırmacılarına nazik destekleri ve tavsiyeleri için teşekkür eder.
Finansman: Bu çalışma için destek NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Bu yazıda bildirilen araştırmalar, U2CDK114886 ödül numarası altında Ulusal Diyabet ve Sindirim Enstitüsü (NIDDK) Böbrek Hassas Tıp Projesi (KPMP), (www.kpmp.org) tarafından desteklenmiştir.
Veri ve malzeme kullanılabilirliği: Veriler Omnibus Gen İfadesi'nde arşivlenmiştir (GEO # beklemede)

Çalışma Indiana Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından kullanılmak üzere onaylandı.
NOT: Bu protokolü, Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiminde korunmuş ve -80 °C'de depolanan böbrek nefrektomi dokusuyla (hem X hem de Y boyutlarında 2 cm'ye kadar) kullanın. Tüm çalışmaları RNA kontaminasyonini sınırlayan bir şekilde gerçekleştirin, temiz tek kullanımlık eldivenler ve yüz maskesi kullanın. Tüm yüzeylerin temizliğini sağlayın. Bu protokol?...

<ol>
	<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection.">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue.">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li><li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR.">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016)</li><li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis.">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys.">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Aided+Laser+Dissection:+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools.">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).</li></ol>

LMD tabanlı transkriptomik, gen ekspresyonını doku içindeki belirli alanlara tutturan yararlı bir teknolojidir. Bu teknolojinin temeli ve böbrekteki potansiyel uygulaması daha önce tanımlanmıştır8. Bununla birlikte, özellikle aşağı akış RNA dizilimi için yüksek doğruluk diseksiyonunu amaçlayan floresan bazlı diseksiyonun optimizasyonu, modernizasyonu ve düzene sokulması daha az yaygındır. Bu metodoloji doku içinde mekansal olarak topraklandığı için, doku yapıların...

Doku örneklerinin incelenmesindeki teknolojik gelişmeler, çeşitli organlardaki sağlık ve hastalık durumunun anlaşılmasını geliştirlemiştir. Bu tür gelişmeler, patolojinin sınırlı bölgelerde veya belirli hücre tiplerinde başlayabileceğinin altını çizmiştir, ancak tüm organ üzerinde önemli etkileri vardır. Bu nedenle, kişiselleştirilmiş tıbbın mevcut çağında, biyolojiyi sadece küresel olarak değil, hem hücre hem de bölgesel düzeyde anlamak önemlidir1. Bu, özellikle patolojik stresi farklı olarak başlatan ve / veya yanıt veren çeşitli özel hücre ve yapılardan oluşan böbrekte geçerlidir. Çeşitli insan böbrek hastalığı türlerinin patogenezi hala iyi anlaşılamamıştır. İnsan böbreğindeki interstiyumun belirli tübüler segmentlerinde, yapılarında veya alanlarında gen ifadesindeki değişiklikleri incelemek için bir metodoloji oluşturmak, hastalığın patogenezini bilgilendirebilecek bölgeye özgü değişiklikleri ortaya çıkarma yeteneğini artıracaktır.
İnsan böbrek biyopsisi örnekleri sınırlı ve değerli bir kaynaktır. Bu nedenle, böbrek dokusundaki transkriptomiyi sorgulayan teknolojiler dokuyu ekononize etmek için optimize edilmelidir. Hücre ve bölgesel düzeyde transkriptomikleri incelemek için mevcut yöntemler arasında tek hücreli RNA dizilimi (scRNaseq), tek nükleer RNaseq (snRNaseq), in situ mekansal hibridizasyon ve lazer mikrodiseksiyon (LMD) sayilebilir. İkincisi, aşağı akış RNA dizilimi ve analizi 2 ,3,4,5için doku bölümlerindeki bölgelerin veya ilgi çekici yapıların hassas izolasyonu için çok uygundur. LMD, diseksiyon sırasında floresan bazlı görüntüleme kullanılarak doğrulanmış belirteçlere dayalı belirli hücre tiplerinin veya yapılarının tanımlanmasına dayanarak benimsenebilir.
Lazer mikroseksiyon destekli bölgesel transkriptominin benzersiz özellikleri şunlardır: 1) hücrelerin histolojik olarak değil ifade ile tanımlandığı tek hücre teknolojilerini tamamlayan hücre ve yapıların mekansal bağlamının korunması; 2) bir antikor işaretçisi ifade imzalarını tanımladığı için teknoloji diğer görüntüleme teknolojilerini bilgilendirir ve bilgilendirir; 3) hastalıkta belirteçler değiştiğinde bile yapıları tanımlama yeteneği; 4) yaklaşık 20.000 gende düşük eksprese transkriptlerin tespiti; ve 5) olağanüstü doku ekonomisi. Teknoloji, yeterli RNA alımı için gerekli olan bir çekirdeğin 100 μm kalınlığından daha az olan bir böbrek biyopsisi için ölçeklenebilir ve büyük depolarda veya akademik merkezlerde yaygın olarak bulunan arşivlenmiş donmuş dokunun kullanılmasını sağlar6.
Devam eden çalışmada, insan böbrek dokusu ile kullanılmak üzere yeni bir hızlı floresan boyama protokolü ile optimize edilmiş bölgesel ve toplu transkriptomik teknolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu yaklaşım klasik LMD keşifleri üzerinde geliştirir, çünkü toplama tubulointerstitial ifadenin aksine interstiyum ve nefron alt segmentleri için ayrı ifade verileri sağlar. Titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlamak için uygulanan kalite güvence ve kontrol önlemleri dahildir. Protokol, hücrelerin ve ilgi alanlarının görselleştirilmesini sağlar ve bu da aşağı akış RNA dizilimine izin vermek için bu yalıtılmış alanlardan RNA'nın tatmin edici bir şekilde alınmasına neden olur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccant Cartridge</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42046-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>RDD buffer is included in the pakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megalin/LRP2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76969</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 568</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC700T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (RNAse Free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>K812-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (Oregon Green 488)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>O7466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS-membrane slides</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11505268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Human Reference Total RNA 25 &#181;g</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>636690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer (HiSeq or NovaSeq)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamm-Horsfall Protein Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5144</td>
			<td>Directly conjugated to Alexa Fluor 546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser microdissection to uncover regional transcriptomics in human kidney tissue

İnsan böbrek dokusunun gen ekspresyon analizi homeostaz ve hastalık patofizyolojisini anlamak için önemli bir araçtır. Bu teknolojinin çözünürlüğünün ve derinliğinin arttırılması ve doku içindeki hücre seviyesine kadar genişletilmesi gerekir. Tek nükleer ve tek hücreli RNA diziliminin kullanımı yaygınlaşmış olsa da doku ayrışmasından elde edilen hücrelerin ifade imzaları mekansal bağlamı korumamaktadır. Belirli floresan belirteçlere dayanan lazer mikrodiseksiyon (LMD), bilinen lokalizasyon ile belirli yapıların ve hücre gruplarının izolasyonuna izin verecek ve böylece böbrek dokusunda mekansal bağlantılı transkriptomik imzaların elde edilmesini sağlayacaktır. hızlı floresan bazlı bir leke tarafından yönlendirilen bir LMD metodolojisini, insan böbreği içindeki beş ayrı bölmeyi izole etmek ve değerli insan böbrek dokusu örneklerinden sonraki RNA dizilimini yapmak için optimize ettik. Ayrıca, toplanan numunelerin yeterliliğinin değerlendirilmesini sağlamak için kalite kontrol parametreleri sunuyoruz. Bu yazıda özetlenen iş akışı, alt segmental transkriptomik imzaları yüksek güvenle izole etmek için bu yaklaşımın fizibilitesini göstermektedir. Burada sunulan metodolojik yaklaşım, ilgili antikor belirteçlerinin ikame edilmesi ile diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Örnekleri
Böbrek nefron segmentlerini ve interstisyel alanları izole etmek için hızlı floresan boyama protokolünü kullanarak dokuz referans nefrektomiden (Indiana Üniversitesi'nde elde edilen 3 örnek ve Böbrek Hassas Tıp Projesi ile elde edilen 6 örnek) verileri sunuyoruz. Bu süreçte kullanılan bölümler vefat eden böbrek donörlerinden veya etkilenmemiş tümör neforektomilerinden elde edildi. Bu örneklerde bitişik bölümlerden alınan H&E lekesinde gör...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue at JoVE.com

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

İnsan Beyin Dokusundan Proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzleme Tabanlı Tespiti Kullanılarak Nicel Proteomik İş Akışı

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Doku ve İdrardan İnsan Böbrek Tubuloidlerinin Üretimi

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...